Кристаллография, 2021, T. 66, № 6, стр. 894-898

ВВЕДЕНИЕ

Одними из важнейших клеточных органелл являются митохондрии. Митохондрии – это клеточные органеллы, встречающиеся в большинстве эукариотических клеток, имеющие внешнюю и внутреннюю мембраны, каждая из которых представляет собой липидный бислой с мембранно-ассоциированными белками [1]. Основной составляющей липидной компоненты мембран являются фосфолипиды (амфифильные молекулы, имеющие гидрофильную и гидрофобную части). Наиболее распространенные представители этого класса в биологических мембранах – это фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилинозитол и фосфатидилсерин [2].

Второй важный класс липидов, входящий в состав биологических мембран, – это гликолипиды, представляющие собой липиды со связанными с ними углеводами. Основным классом гликолипидов, встречающихся в мембранах, являются гликосфинголипиды, состоящие из церамида (включает в себя сфингозин и жирную кислоту), одного или нескольких углеводных остатков, а также сиаловой кислоты [3]. Они преимущественно находятся на внешней стороне мембраны и отвечают прежде всего за клеточное распознавание и проведение сигналов [3]. Кроме того, в состав мембран входит холестерол, регулирующий их вязкость [4]. Известно, что изменение вязкости мембран приводит к различным заболеваниям, таким как атеросклероз [5], диабет [6] и другие.

Белковую компоненту мембраны составляют различные классы белков, находящиеся на ее поверхности, или пронизывающие ее, например, различные ионные каналы, обеспечивающие избирательную проницаемость мембраны для различных ионов в зависимости от условий [7].

Основной функцией митохондрий являются окисление органических соединений и использование полученной при этом энергии для синтеза аденозинтрифосфата [1]. Кроме того, один из сигнальных путей апоптоза (регулируемого процесса запрограммированной гибели клеток) связан с митохондриями, причем у позвоночных именно такой путь является основным [8]. Отметим, что нарушение апоптоза приводит к различным заболеваниям. Для таких заболеваний, как удушье новорожденных [9] и церебральная ишемия у пожилых людей [10], так же как и для болезни Альцгеймера [11] и некоторых других нейродегенеративных заболеваний, дегенерации сетчатки [12] и отторжения трансплантата [13], характерен чрезмерный апоптоз. При злокачественных опухолях, наоборот, апоптоз в раковых клетках подавлен [14, 15]. Митохондриальный сигнальный путь апоптоза реализуется путем выхода из межмембранного пространства митохондрии в цитоплазму клетки апоптогенных белков путем разрушения мембраны или открытия водопроницаемых каналов на внутренней мембране митохондрии (ВММ) [16]. Один из механизмов активации апоптоза – запуск перекисного окисления липидов ВММ, в первую очередь кардиолипина (CL), катализируемого цитохромом С (Cyt c) [17]. Хотя данный процесс изучался посредством ряда биофизических методов [18, 19], до сих пор остается неизвестной структура комплекса Cyt c и ВММ на молекулярном уровне. Для изучения свойств ВММ построена модель бислоя, имитирующего по составу ВММ (на 37.0% состоит из фосфатидилэтаноламина, на 26.5% – из фосфатидилхолина, на 25.4% – из кардиолипина и на 4.5% – из фосфатидилинозитола) [20], и изучена молекулярная динамика (МД) полученной модели.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исходная модель системы была построена с использованием сервиса CHARMM-GUI [21], она содержала липидный бислой, состоящий из 51 молекулы дилинолеил фосфатидилэтаноламина (DLiPE), 36 молекул дилинолеил фосфатидилхолина (DLiPC), 35 молекул тетраолеил кардиолипина (TOCL) и 6 молекул дилинолеил фосфатидилинозитола (DLiPI), равномерно распределенных в каждом из двух слоев липидов, 15 Å водного слоя с каждой стороны, а также 0.15 M KCl. Размер ячейки, в которой проводилось моделирование МД, составлял 109.47 × 109.47 × 70.00 Å, ячейка имела кубическую форму. Моделирование МД проводили с использованием программного пакета AMBER [22] c CUDA-версией pmemd [23]. В процессе моделирования МД использовали силовое поле CHARMM36 [24]. В качестве модели воды использовали модель TIP3P. Для релаксации структуры и во избежание стерических клэшей провели минимизацию энергии системы. Затем система была уравновешена в шесть стадий по 25–50 пс каждая при температуре 310 K и давлении 1 атм в NVT- и NPT-ансамблях с ограничениями на подвижность атомов. После этого ограничения на подвижность были сняты, и система уравновешивалась еще 2 нс. Температуру и давление в системе контролировали с помощью термостата Ланжевина [25] и полуизотропного баростата Монте-Карло [26] с двумя интерфейсами. В результате продуктивной МД было промоделировано 20000 пс с шагом 2 фс.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Полученная модель бислоя, имитирующего ВММ, изображена на рис. 1. Ширина модели мембраны после уравновешивания системы составляет в среднем 39.08 Å. Видно, что модель бислоя не содержит пор и является непроницаемой для растворителя. Как было показано ранее в ленгмюровских экспериментах [27], существует возможность оценить плотность упаковки липидов в монослое экспериментальными методами, причем высказано предположение, что монослой CL меняет свою плотность при взаимодействии с Cyt c. Учитывая возможность менять плотность упаковки липидов в полученной модели, использованный метод молекулярного моделирования позволяет построить молекулярные модели взаимодействия Cyt c и липидного бислоя ВММ.

Рис. 1.

Построенная модель липидного бислоя, имитирующего внутреннюю мембрану митохондрий.

В результате МД-эксперимента показано, что полученная модель липидного бислоя является стабильной структурой и может быть использована как модель липидной компоненты ВММ. Полученная модель состоит из четырех различных по химическому строению липидов – DLiPE, DLiPC, TOCL и DLiPI (рис. 2), однако принадлежащих к одному классу, т.е. являются фосфолипидами и имеют гидрофильную фосфатную головку и гидрофобный углеродный хвост. Для анализа разницы в подвижности различных частей липидов был рассчитан RMSF (root-mean-square fluctuation) – наиболее часто используемый показатель для оценки динамического изменения координат частиц – как для гидрофобной, так и для гидрофильной частей липидных молекул (для атомов углерода и атомов кислорода). Анализ данных показал, что молекулы липидов по подвижности значительно отличаются друг от друга, однако зависимости степени подвижности липида от его класса не выявлено. С другой стороны, каких-либо тенденций в разнице подвижности атомов кислорода и атомов углерода, входящих в состав липидных молекул, не выявлено (рис. 3).

Рис. 2.

Химические формулы фосфолипидов, использовавшихся для построения модели внутренней мембраны митохондрий: 1 – дилинолеил фосфатидилэтаноламин, 2 – дилинолеил фосфатидилхолин, 3 – дилинолеил фосфатидалинозитол, 4 – тетраолеоил кардиолипин.

Рис. 3.

RMSF для атомов, входящих в состав липидных молекул. Представлены RMSF для атомов углерода (а) и кислорода (б).

Таким образом, в результате моделирования получена модель липидного бислоя, имитирующая липидную компоненту ВММ. Полученная модель будет использована в дальнейшем для изучения процессов апоптоза, ассоциированных с Cyt c и ВММ.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 19-14-00244) в части моделирования МД и при поддержке Министерства науки и высшего образования в рамках выполнения работ по Государственному заданию ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН в части анализа результатов молекулярного моделирования.