Кристаллография, 2022, T. 67, № 3, стр. 451-457

ВВЕДЕНИЕ

Разработка биоразлагаемых искусственных внеклеточных матриксов из полимерных материалов представляет собой одно из активно растущих направлений заместительной и регенеративной медицины. Искусственный матрикс, вживленный в тело в месте повреждения, обрастает клетками, которые, пролиферируя и дифференцируясь, формируют ткань, в то время как сам искусственный матрикс деградирует и заменяется на естественный [1].

Согласно [2–4] морфология внеклеточных матриксов важна для роста и развития клеток и последующего формирования ткани. Клетки взаимодействуют с поверхностью внеклеточного матрикса, который осуществляет поддерживающую функцию, причем микроструктура этой поверхности может существенно влиять на характер такого взаимодействия. Матриксы с микро- и наношероховатостями могут увеличивать способность клеток к дифференциации, при этом по сравнению с более гладкими матриксами адгезия клеток и их рост улучшаются [2, 5]. Клетки более активно пролиферируют и развиваются, тогда как на гладких поверхностях замечено отставание в развитии (например, нейронные клетки имеют округлую форму и слаборазвитую ветвистость на гладких матриксах) [2, 5–8]. Распространенный метод изменения морфологии поверхности, оставляющий общие свойства материала без изменений, – плазменная обработка, в результате которой соединения на поверхности претерпевают физико-химические изменения [9, 10]. Такие изменения поверхности формируют развитый рельеф, а также приводят к увеличению ее гидрофильности – все это способствует улучшению адгезии и пролиферации клеток [11–18], улучшению биосовместимости искусственных матриксов [7, 8]. Например, в [19] представлены данные о том, что модификация полимерных поверхностей холодной плазмой улучшает процесс пролиферации фибробластов и клеток эндотелия.

Основой искусственного внеклеточного матрикса могут быть различные полимерные материалы – пленки, губки и нетканые волокнистые материалы. Для варьирования микроструктуры их поверхности в настоящей работе предлагается способ изменения шероховатости путем плазменной обработки, который может быть количественно описан с помощью метода восстановления 3D-микроструктуры поверхности по изображениям, полученным с помощью растровой электронной микроскопии (РЭМ) и методом математического описания физической адсорбции – БЭТ (Брунауэр, Эммет, Теллер [20]). Кроме этого, методом РЭМ в условиях естественной среды (ЕРЭМ) исследована смачиваемость поверхности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для получения образцов с различной морфологией использовали полилактид (ПЛА) марки 4032D (NatureWorks, США). В качестве растворителей использовали диоксан (ЧДА, “Компонент-Реактив”), хлороформ и этиловый спирт (ХЧ, “Компонент-Реактив”).

Пленки были получены горячим прессованием полимерных гранул при температуре 190°C и давлении 7 MПa. Контроль аморфного состояния полимерной матрицы обеспечивали посредством ускоренного водяного охлаждения образцов при комнатной температуре. Толщина пленок варьировалась в пределах 70 ± 5 мкм. Характерный геометрический размер пленки – 50 × 50 мм.

Для получения пористых материалов на основе ПЛА полимер растворяли в 1,4-диоксане при постоянном перемешивании в магнитной мешалке в течение 24 ч. Концентрация раствора составила 3 мас. %. Затем раствор замораживали при температуре −22°C в рефрижераторе и перемешивали дважды в процессе заморозки для равномерного распределения кристаллов растворителя. После этого образцы лиофилизировали в течение 48 ч на установке Alpha 2-4LSC (Martin Christ, Германия). Диаметр шайбы составлял 25 ± ± 1 мм при высоте 3 ± 1 мм.

Нетканые материалы получали методом электроформования из раствора ПЛА (9 мас. %) в смеси растворителей: хлороформа и этилового спирта (90 : 10). Электроформование проводили на установке, разработанной в НИЦ “Курчатовский институт”, при комнатной температуре и следующих технологических параметрах: прикладываемое напряжение 12 ± 1 кВ, расстояние между капилляром и осадительным электродом 25 ± 1 см, объемный расход полимерного раствора 5 мл/ч. Характерный геометрический размер нетканого волокнистого материала – 50 × 50 мм при толщине 550 ± 50 мкм.

Все образцы были подвергнуты плазменной обработке с одной из сторон в установке PELCO easiGlow (Ted Pella, США) при токе 20 мА в течение 30 или 60 мин. Для РЭМ-исследований образцы, включая контрольные (без обработки плазмой), закрепляли на углеродном скотче, затем для улучшения качества изображений проводили напыление на них золота в течение 30 с в установке SPI Sputter Coater (SPI Supplies, США).

Изображения получены в РЭМ Versa 3D DualBeam (Thermo Fisher Scientific, США) при ускоряющем напряжении 2 кВ и токе пучка электронов 130 пА для пленок; 5 кВ, 27 пА для волокон и губок.

Для численной оценки параметров рельефа по высоте и реальной площади объектов использовали метод 3D-реконструкции поверхности. Подробное описание метода 3D-реконструкции поверхности в РЭМ представлено в [21]. Метод заключается в регистрации пар изображений (стереопары) при эуцентрическом наклоне образца, т.е. наклоне с минимальным движением по оси, параллельной пучку электронов, на углы, составляющие ±10° в эксперименте восстановления поверхности пленок. Обработку изображений, 3D-реконструкцию поверхности и численный анализ проводили с помощью программного обеспечения MeX (Bruker Alicona, Австрия).

По 3D-моделям вычисляли следующие параметры: отношение реальной площади поверхности рельефа к площади проекции области R_S, необходимое для определения увеличения реальной площади поверхности при ее модификации плазмой, а также параметры, характеризующие разброс по высоте рельефа поверхности, т.е. шероховатость. Были определены среднее квадратичное отклонение Sq и наибольшая высота неровностей Sz, т.е. расстояние от самой низкой точки поверхности до самой высокой. Измерения отклонения высоты и глубины проводили от базовой плоскости, наиболее точно аппроксимирующей поверхность.

Измерения удельной площади поверхности методом БЭТ проводили на анализаторе удельной поверхности и пористости Autosorb iQ (Quantachrome Instruments, США) по результатам обработки изотермы адсорбции паров криптона при температуре 77 K в интервале относительных давлений p/p₀ от 0.05 до 0.3. Перед каждым измерением проводили дегазацию образца при температуре 50°C в течение 16 ч в условиях высокого вакуума. Пленки разрезали на кусочки размером 5 × 5 мм, вклад образовавшихся торцов в удельную площадь составил ∼1%.

При помощи ЕРЭМ получены изображения ПЛА-пленок (образцы до и после обработки плазмой) во время конденсации капель воды. Изображения получены без напыления золота. Для этого в ЕРЭМ выбирали значение целевой влажности 100% при фиксированной температуре 10°C. Регулировка изменения давления в камере ЕРЭМ приводила к оседанию капель воды на поверхности пленок. Серии изображений получены при ускоряющем напряжении 10 кВ и токе 93 пА с шагом в одну минуту в течение 7 мин с начала повышения влажности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

РЭМ-изображения образцов пленок, губок и нетканых волокнистых полотен до и после обработки плазмой в течение 30 и 60 мин, полученные с помощью регистрации вторичных электронов, представлены на рис. 1. У всех обработанных образцов можно наблюдать значительные изменения шероховатости поверхностей. Наиболее отчетливо изменения морфологии поверхности проявляются в пленках, обработанных плазмой как в течение 30, так и 60 мин. Это связано с тем, что обработка плазмой является поверхностным методом, наиболее эффективным именно для обработки пленок, в то время как воздействие плазмы на внутренние поверхности губчатых и нетканых волокнистых материалов слабее. На гладких поверхностях пленочных матриксов адгезия клеток минимальна [22], поэтому увеличение шероховатости пленок может значительно усилить процессы адгезии и пролиферации клеток. В губках увеличение шероховатости проявляется значительно слабее вследствие экранировки пор стенками губки.

Результаты 3D-реконструкции поверхности пленок до и после обработки плазмой в течение 30 и 60 мин представлены на рис. 2. В представленных моделях изменение цвета соответствует высоте рельефа относительно базовой плоскости (шкалы на соответствующих рисунках). В процессе исследований поверхности пленок выявлено, что высота рельефа и площадь поверхности неоднородны в различных областях, особенно в образцах, обработанных плазмой. Так, на поверхности пленки, обработанной плазмой в течение 60 мин, встречаются области как с более, так и с менее развитым рельефом (рис. 2в), что приводит к заметному разбросу величин площади рельефа. Для оценки разброса величин площади поверхности пленок исследуемую область разбивали на участки размером 10 × 10 мкм и в каждом участке определяли значение параметра R_S. Полученные таким образом значения позволяют представить разброс величин площади поверхности в зависимости от длительности обработки образцов плазмой. Как и предполагалось, наиболее однородна необработанная плазмой пленка, степень разброса величин площади поверхности увеличивается со временем обработки. Результаты подсчета параметров площади и рельефа (шероховатости) поверхности для оригинальных и модифицированных плазмой в течение 30 и 60 мин пленок представлены в табл. 1 и на рис. 3.

Отметим, что оценка параметров рельефа необработанных плазмой образцов методом восстановления 3D-микроструктуры поверхности по изображениям РЭМ бывает затруднена. Это связано с необходимостью привязки изображений к каким-либо особенностям поверхности. У необработанных плазмой пленок и в меньшей степени волокон таких особенностей или мало, или нет вообще. В результате могут появляться артефакты, приводящие к искаженному, чаще увеличенному по высоте представлению рельефа [23–25]. Метод создания текстуры нанесением золотой пленки с последующим отжигом, использованный в [25], неприменим для исследуемых в настоящей работе полимерных образцов, чувствительных к температурному нагреву. Из-за такого эффекта приходилось выбирать участки необработанного плазмой образца с какими-нибудь особенностями – неровностями или загрязнениями. При модификации образцов плазмой создается достаточно развитый рельеф, позволяющий легко сделать привязку двух изображений друг к другу и реконструировать поверхность с высокой точностью. В то же время наличие на поверхностях глубоких узких бороздок может приводить к некорректным результатам из-за перекрытия электронного пучка краями этого углубления при выбранном угле получения изображения. В результате значение глубины окажется заниженным. Такой эффект проявлялся на 3D-реконструкциях модифицированных плазмой поверхностях волокон, у которых углубления такой морфологии встречались достаточно часто. Поэтому здесь не приводим результаты 3D-реконструкции поверхности нетканых волокнистых матриксов и губок. В то же время локально поверхность губок и до определенной степени нетканых волокнистых материалов можно считать эквивалентной поверхности пленок, за исключением случая, когда существует упомянутый эффект экранирования из-за высокой нерегулярности пористой структуры.

Оценка изменения численных параметров шероховатости в пленках (рис. 3, табл. 1) однозначно свидетельствует о том, что при обработке плазмой степень шероховатости увеличивается. Так, по данным 3D-реконструкции площадь поверхности пленки уже после 30 мин обработки может увеличиться на 20%, а после 60 мин – приблизительно на 35–40%. В несколько раз возрастают размеры неровностей, причем при возрастании времени обработки размеры неровностей продолжают существенно расти.

Результаты оценки изменений морфологии поверхности образцов после обработки их плазмой подтверждаются данными измерений удельной площади поверхности методом БЭТ. Обработка пленки плазмой в течение 60 мин (с одной стороны) приводит к увеличению удельной площади поверхности почти в 1.5 раза – с 0.065 до 0.100 м²/г. Ошибка измерений была оценена как разброс измерений нескольких образцов и составила 8%.

Если предположить, что удельная поверхность одной стороны пленки до воздействия плазмой была равна а/m, где a – площадь одной плоской поверхности образца, m – масса образца, то, пренебрегая торцами образца (толщина пленки 70 мкм при размере 5 × 5 см, пленка разрезалась на 100 частей), общая удельная поверхность составляет 2а/m = 0.065 м²/г.

После обработки одной стороны пленки плазмой удельная площадь всей поверхности образца составляет – (a + b)/m = 0.1 м²/г, где b – площадь обработанной плазмой поверхности образца. Изменениями массы можно пренебречь.

Отношение удельных площадей поверхностей обработанного (с одной стороны пленки) и необработанного образца составляет

а отношение площадей обработанной и необработанной плазмой поверхностей

Этот результат оценки площади поверхности превышает оценку, полученную по результатам 3D-реконструкции поверхности. Следовательно, расхождение может быть связано с присутствием нанопор на поверхности пленки, обработанной плазмой, которые не разрешаются в РЭМ при выбранных условиях его работы с полимерными пленками, включающих также напыление тонкого слоя золота. Кроме этого, поверхность относительно глубоких пор с вертикальными стенками может искажаться при реконструкции.

Меньший эффект наблюдается у нетканого волокнистого материала – увеличение площади поверхности после обработки составило 15–20% (с 0.66 до 0.78 м²/г). Это может быть связано с тем, что при обработке плазмой изменение поверхности происходит у части волокон в образце, располагающихся ближе к поверхности. Этот эффект еще сильнее проявляется в образцах губок. Обработка поверхности губчатого материала плазмой не приводила к существенному изменению ее удельной поверхности, так как губка объемнее волокнистого полотна и обладает существенно более развитой поверхностью.

Результаты РЭМ-исследований показали, что латеральные размеры впадин на поверхности пленки при обработке в течение 30 мин составляют от 0.3 до 2 мкм (рис. 1г), в течение 60 мин – от 0.5 до 15 мкм (рис. 1ж). Такое значительное увеличение длины канавок происходит вследствие объединения в ряд нескольких соседних впадин.

Оценка неровностей поверхности волокон нетканого волокнистого матрикса показала, что при обработке плазмой в течение 30 мин начинают формироваться впадины, латеральные размеры которых составляют от 0.2 до 1 мкм (рис. 1д). Значительные изменения в нетканом волокнистом материале наблюдаются в образцах, обработанных в течение 60 мин (рис. 1з): латеральные размеры впадин от 0.4 до 6 мкм. В процессе обработки материала сеть стенок, образующих впадины на поверхности волокон, фактически напоминает связку волокон меньшего диаметра, тянущихся вдоль первоначального волокна.

Поверхность губок после обработки плазмой в течение 30 мин (рис. 1е) незначительно отличается от необработанной поверхности, появляются только мелкие (по сравнению с необработанными поверхностями) шероховатости с латеральными размерами от 0.2 до 1.5 мкм. После обработки плазмой в течение 60 мин размеры неровностей незначительно увеличиваются, их плотность растет (рис. 1и), латеральные размеры составляют от 0.2 до 3 мкм.

На следующем этапе было исследовано изменение гидрофильности/гидрофобности поверхности пленок в ЕРЭМ после обработки плазмой. Изображения капель на поверхностях необработанных плазмой пленок свидетельствуют, что при конденсации паров воды в течение 2 мин в камере ЕРЭМ формируются капли круглой формы размером от 5 до 15 мкм (рис. 4а). Отметим, что для визуализации капель образец приходилось наклонять на угол ∼30°. При продолжении процесса конденсации до 5 мин капли начинали сливаться, увеличиваясь в диаметре до 40 мкм (рис. 4б). Конденсация паров воды на обработанных плазмой поверхностях пленок выглядит иначе. При конденсации паров в течение 2 мин (рис. 4в) в части поверхности пленки у нижнего края наклоненного образца появляется равномерный слой воды. Это свидетельствует о значительном увеличении гидрофильности пленки, так как капли растекаются по поверхности. Из-за малого значения угла смачивания граница слоя воды очень плохо визуализируется. С увеличением времени конденсации до 5 мин можно наблюдать движение слоя воды по поверхности пленки и увеличение площади пленки воды (рис. 4г). Смачиваемость имеет решающее значение для биосовместимости полимерного материала, так как от параметра гидрофильности/гидрофобности зависит активность функциональных белков. Присутствие на поверхности связанных молекул воды влияет на конформацию адгезивных белков в процессе прикрепления клеток к полимерной матрице. При первом контакте молекулы воды образуют слой на поверхности гидрофильного полимера, который определяет связывание функциональных молекул, например альбуминов [26].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обработка полимерных матриксов из полилактида увеличивает шероховатость и гидрофильность поверхности. Особенно сильно этот эффект проявляется в пленках и нетканых волокнистых матриксах. По данным БЭТ площадь пленок после 1 ч обработки может увеличиться в 2 раза, оценки методом 3D-реконструкции поверхности приводят к более скромным результатам: увеличение удельной площади составляет до 40%. По-видимому, разница связана с образованием нанопор, неразличимых методом 3D-реконструкции поверхности по данным РЭМ. Размеры неровностей поверхности пленочного матрикса увеличиваются более чем в 5 раз при обработке плазмой в течение 1 ч. Воздействие плазмы на губки не приводит к существенному увеличению шероховатости, поскольку плазма экранируется верхним слоем материала, а сами губки изначально имеют развитую поверхность. Параметрами модификации поверхности можно управлять, изменяя время воздействия плазмы на образцы. Увеличение шероховатости плазменной обработкой наиболее применимо к пленкам, так как изначально поверхность таких образцов гладкая и плоская, что препятствует адгезии клеток. В дополнение к этому увеличение смачиваемости благотворно скажется на пролиферации клеток. Учитывая проблемы с выживанием и развитием клеточных культур на пленках, данный способ модификации поверхности может существенно улучшить перспективы использования пленочных матриксов для задач тканевой инженерии.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 21-13-00321 “Деформационное поведение биоразлагаемых матриксов различного типа при механических нагрузках”).