Кристаллография, 2023, T. 68, № 1, стр. 46-50

ВВЕДЕНИЕ

К аллергенам относят антигены белковой природы, вызывающие аллергию и обладающие способностью связываться с иммуноглобулином Е (IgE) [1]. Белки из клещей домашней пыли Dermatophagoides pteronyssinus составляют большую часть домашних аллергенов и являются одним из главных факторов, ответственных за развитие аллергии и бронхиальной астмы во всем мире [2, 3]. В связи с этим экстракты Dermatophagoides pteronyssinus используются для подкожной (SCIT) или сублингвальной иммунотерапии, а также для диагностики аллергии [4, 5]. Однако поскольку натуральные экстракты довольно разнообразны по содержанию и составу аллергенов, для диагностики и терапии все чаще используются рекомбинантные аллергены и гипоаллергены [6, 7].

Главными аллергенами клеща домашней пыли Dermatophagoides pteronyssinus являются белки Der p, многие из которых относятся к протеазам [8]. Высокий уровень IgE против аллергенов Der p 1 и Der p 2 обнаружен более чем у 70% пациентов. Важную роль в аллергии играют также сериновые протеазы Der p 3, Der p 6 и Der p 9 [9, 10]. При этом сериновая протеаза Der p 3 является одним из ключевых аллергенов. Имеются данные о взаимодействия протеазы Der p 3 с дыхательным эпителием [11, 12]. Установлена роль сериновой протеазы Der p 3 в стимулировании кальциевых каналов семейства Orai1. Показано, что терапия, включающая одновременное ингибирование белка Der p 3 и каналов Orai1, подавляет активацию тучных клеток клещами домашней пыли. Кроме того, Der p 3 является важным аэроаллергеном, активирующим Ca²⁺-каналы [13].

Основная проблема при диагностике аллергии в настоящее время заключается в поиске эпитопов для прогнозирования аллергенной активности [14]. Задача распознавания антигенных участков белков является ключевой при создании синтетических вакцин, иммунодиагностических тестов и производстве антител. Поэтому данные о пространственной структуре белков-аллергенов представляют существенный интерес. Информация о структуре позволяет проследить эволюцию аллергенов, объясняет наблюдаемую клинически кросс-реактивность и делает возможным дизайн гипоаллергенных производных для аллергических вакцин.

В настоящей работе описана новая методика получения и очистки рекомбинантного белка-аллергена Der p 3 из Dermatophagoides pteronyssinus, найдены условия кристаллизации белка. От выращенных кристаллов получен дифракционный набор, пригодный для установления пространственной структуры Der p 3 при разрешении 2.25 Å.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение экспрессионного плазмидного вектора, содержащего ген Der p 3. Из клещей домашней пыли Dermatophagoides pteronyssinus при помощи набора для выделения суммарной РНК ExtractRNA (Евроген, Россия) выделена матрица, из которой с помощью ревертазы Mint (Евроген, Россия) в соответствии с протоколом фирмы-производителя получена кДНК. Для амплификации гена аллергена Der p 3 были синтезированы олигонуклеотидные праймеры (Der-forward 5'-GGTGGTCATATGAATCCAATTCTACCAGCATCACC-3' и Der-reverse 5'-GGTGGTCTCGAGCTGTGACGTTTTGATTTCAATCCAA-3'), подобранные на основании последовательности мРНК из банка данных (LOC113796035). Полученные полимеразные фрагменты были расщеплены эндонуклеазами рестрикции NdeI и XhoI (ThermoScientific, США) и клонированы в экспрессионный вектор pET-23a+, предварительно обработанный этими же рестриктазами, в одной рамке считывания с фрагментом, кодирующим His₆-метку. В результате получен экспрессионный вектор pERDerp3.

Культивирование штамма-продуцента аллергена Der p 3. При электропорации рекомбинантной плазмиды pERDerp3 в штамм Escherichia coli C3029/pGro7 получен высокоэффективный штамм-продуцент E. coli С3029/pGro7/pERDerp3 рекомбинантного аллергена Der p 3, продуцирующий белок в растворимой форме. Трансформированные клетки высевали на твердую агаризованную среду LB, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 20 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали в течение 14 ч при 37°С для получения отдельных колоний. После этого несколько колоний переносили в 100 мл среды LB с 100 мкг/мл ампициллина и 20 мкг/мл хлорамфеникола и выращивали в течение 16 ч при 37°С на шейкере CERTOMAT® SII (Sartorius, Германия) при перемешивании со скоростью 180 об./мин для получения инокулята. Полученной культурой засевали среду LB, содержащую 50 мкг/мл ампициллина, 20 мкг/мл хлорамфеникола и 0.5 мг/мл L-арабинозы, и культивировали при 37°C до оптического поглощения A₅₉₅ = 0.6, затем индуцировали изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом до концентрации 0.4 мМ и выращивали 18 ч при 23°С. Клетки отделяли центрифугированием при 3900 об./мин в течение 20 мин при 4°C на центрифуге Avanti J30I (BeckmanCoulter, Германия). Из 1 л культуры штамма-продуцента E. coli С3029/pGro7/pERDerp3 получили 3 г влажных клеток.

Выделение аллергена Der p 3. Клетки ресуспендировали в буферном растворе А (50 мМ Трис-HCl, pH 8.5, 5 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 1 мМ PMSF) и разрушали во льду с помощью ультразвукового дезинтегратора LABSONIC (Sartorius). Клеточный дебрис отделяли центрифугированием при 12 000 об./мин в течение 30 мин при 4°C на центрифуге HERMLE Z383K (Hermlelabortechnik). На первой стадии очистки осветленный клеточный лизат разбавляли в 2 раза буферным раствором Б (20 мМ NaOAc (Merk), pH 6.0) с титрованием до pH 6.0 и наносили на колонку XK16/20 с катионообменным сорбентом Macro-Prep High S Support (Bio-Rad, США) объемом 20 мл, предварительно уравновешенную буферным раствором Б. Элюцию белка проводили в градиенте хлорида натрия от 0 до 500 мМ.

На второй стадии очистки обогащенные фракции аллергена после катионообменной хроматографии наносили на колонку с металл-аффинным сорбентом Ni²⁺-IDA (Qiagen, Германия) объемом 30 мл, предварительно уравновешенным буферным раствором Б. Элюцию белка проводили в градиенте имидазола от 0 до 500 мМ. После аффинной хроматографии к фракциям, содержащим целевой белок, добавляли ЭДТА до 5 мМ и концентрировали при помощи ультрафильтрационной ячейки Amicon 8200 объемом 200 мл (Millipore, США) на мембране Ultracel®10 кДа (Millipore).

Последующую очистку проводили на гель-фильтрационной колонке HiLoad 16/60 с сорбентом Superdex 75 (GE Healthcare, США) в буфере В (20 мМ NaH₂PO₄, pH 6.0, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5% глицерина, 0.04% NaN₃). Очищенные фракции целевого белка после гель-хроматографии объединяли и концентрировали до 25 мг/мл (рис. 1).

Рис. 1.

Гель-электрофореграмма рекомбинантного аллергена Der p 3 из Dermatophagoides pteronyssinus в 15%-ном полиакриламидном геле ПААГ в денатурирующих условиях: 1 – Der p 3 в невосстанавливающих условиях; 2 – стандарты молекулярных масс PageRuler^TMPlusPrestainedProteinLadder (ThermoScientific^TM); 3 – Der p 3 в восстанавливающих условиях.

Кристаллизация рекомбинантного аллергена Der p 3. Подбор условий кристаллизации аллергена Der p 3 проводили методом диффузии паров растворителя при температуре 20–22°С. Для этого к 2 мкл раствора белка в 20 мМ NaH₂PO₄, pH 6.0, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5% глицерина, 0.04% NaN₃ с концентрацией 10 мг/мл добавляли равный объем раствора-осадителя. Каплю раствора помещали на поверхность силиконированной стеклянной пластинки, которой накрывали кювету, содержащую 1 мл раствора-осадителя. В качестве осадителя использовали наборы HR2-110, HR2-112, HR2-126, HR2-144 (Hampton Research, США). Кристаллы, использованные при получении дифракционного набора, выращены из 1%-ного раствора белка при добавлении равного объема раствора-осадителя, содержащего 3 М сульфат аммония, 0.1 М цитрат натрия, рН 5.8, 0.6 М хлорида натрия, 4% 2-метил-2,4-пентандиола МПД. Кристаллы в виде игольчатых друз появлялись через три недели (рис. 2).

Рис. 2.

Кристаллы аллергена Der p 3, полученные методом диффузии паров растворителя при использовании в качестве осадителя сульфата аммония.

Сбор и обработка дифракционных данных. Дифракционный набор до разрешения 2.25 Å собран на синхротроне ESRF (Франция, станция ID23-1) при температуре 100 K. Перед получением дифракционного набора кристаллы замораживали в кристаллизационном растворе.

Дифракционные данные получали от одного кристалла методом вращения–качания при расстоянии между кристаллом и детектором 400 мм и длине волны 0.96772 Å; углы качания и вращения – 0.1° и 360° соответственно. Для регистрации отражений использовали детектор прямого действия Pilatus6MF. Обработку набора экспериментальных интенсивностей отражений проводили с помощью программы iMosflm [15]. Статистические характеристики дифракционных данных приведены в табл. 1. Кристаллы относятся к пр. гр. С121. В независимой части ячейки содержатся две молекулы фермента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Белок Der p 3 согласно анализу аминокислотной последовательности является сериновой протеазой группы трипсина. В нативных условиях он выделяется в виде предшественника про Der p 3, который активируется протеазой Der p 1 [16]. Согласно [16] Der p 3 не содержит потенциальных сайтов гликозилирования, хотя не исключены другие посттрансляционные модификации. Рекомбинантный Der p 3 получен в Pichia pastoris [17]. Было показано, что белок подвергается автолизу, поэтому наряду с нативным белком приготовлена мутантная форма S196A, в которой остаток серина активного центра заменен на аланин. Мутантная форма оказалась стабильной и способной связываться с IgE, поэтому она более подходит для использования при диагностике и иммунотерапии, чем природный белок.

В данной работе получен высокоэффективный штамм-продуцент С3029/pGro7/pERDerp3 аллергена Der p 3, продуцирующий рекомбинантный белок в E. coli в растворимой форме, и разработана методика очистки рекомбинантного аллергена. Ген, кодирующий аллерген Der p 3 из Dermatophagoides pteronyssinus, получен методом обратной транскрипции на матрице мРНК, выделенной из клеща домашней пыли, и клонирован в плазмидный вектор pET23a+ для прокариотической экспрессии в E. coli. В ходе культивирования клеточной культуры штамма-продуцента E. coli С3029/pGro7, трансформированного плазмидным вектором pER-Derp3, целевой белок накапливался в растворимой форме. После разрушения клеточной биомассы осуществляли очистку Der p 3 посредством трех последовательных стадий катионообменной, металл-аффинной и гельпроникающей хроматографий. Разработанная методика позволяет получать препарат рекомбинантного аллергена Der p 3 из Dermatophagoides pteronyssinus 98%-ной чистоты с концентрацией 25 мг/мл (рис. 1).

По аминокислотному составу и молекулярной массе белок гомологичен бычьему трипсину (идентичность 41%). Выравнивание аминокислотных последовательностей между трипсином из Bos taurus (Uniprot P00760) и объектом исследования представлено на рис. 3. Выравнивание содержит аннотацию элементов вторичной структуры бычьего трипсина в соответствии с кристаллической структурой из базы данных PDB (PDB_ID: 4I8H).

Рис. 3.

Выравнивание аминокислотных последовательностей трипсина из Bos taurus и аллергена Der p 3 из Dermatophagoides pteronyssinus. Выравнивание построено при помощи ClustralW, визуализация – web-сервер ESPript3 (https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).

Раствор рекомбинантного белка использовали для получения кристаллов, пригодных для исследования пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа. Поиск условий кристаллизации проведен методом диффузии паров растворителя с использованием наборов фирмы Hampton Research и приготовленных вручную водно-солевых растворов. Кристаллы, использованные для рентгеновского исследования, получены из 1%-ного раствора белка в цитратном буфере, рН 5.8, с использованием в качестве раствора-осадителя сульфата аммония. Собранный от полученных кристаллов дифракционный набор пригоден для определения пространственной структуры аллергена Der p 3 при разрешении 2.25 Å.

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования в рамках Государственного задания ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН.