Кристаллография, 2023, T. 68, № 2, стр. 268-275

ВВЕДЕНИЕ

Пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ) катализируют обратимый фосфоролиз пуриновых рибо- и 2'-дезоксирибонуклеозидов с образованием свободного азотистого основания и (дезокси-)рибоза-1'-фосфата (рис. 1).

Рис. 1.

Схема реакции, катализируемой пуриннукдеозидфосфорилазой из Thermus thermophilus HB27. Аденозин/аденин – R₁ = NH₂, R₂ = H. Гуанозин/гуанин – R₁ = O, R₂ = NH₂.

Благодаря своей каталитической активности ПНФ способны в присутствии ионов фосфата осуществлять реакцию трансгликозилирования: перенос азотистого основания с одного нуклеозида на другой [1–3]. Пуриннуклеозидфосфорилазы играют значительную роль в метаболизме нуклеиновых кислот и реутилизации пуриновых азотистых оснований, а также нашли широкое применение в каскадном синтезе модифицированных нуклеозидов [17–21].

ПНФ из различных организмов различаются по ряду параметров: масса, четвертичная структура и субстратная специфичность, на основе чего можно выделить два функциональных класса. Ферменты первого класса ПНФI, встречающиеся у всех живых организмов, представляют собой гомотримеры массой ~90 кДа и узко специфичны в отношении 6-оксопуриновых нуклеозидов. Ферменты второго класса ПНФII, характерные только для микроорганизмов, являются гомогексамерами с молекулярной массой 110–150 кДа и обладают более широкой специфичностью, взаимодействуя как с 6-оксопуринами, так и с 6-аминопуринами [3].

Известно, что геном термофильной эубактерии штамма Thermus thermophilus HB27 содержит гены ПНФ как первого, так и второго класса. Объектом данного исследования является пуриннуклеозидфосфорилаза II из Thermus thermophilus HB27 (ThPNPII). Как представитель второго класса ПНФ, TthPNPII является гексамером, способным осуществлять фосфоролиз гуанозина и аденозина [1]. Данный фермент обладает широкой субстратной специфичностью в отношении модифицированных не природных пуриновых азотистых оснований [1]. Субстратами для TthPNPII являются не только рибозиды, но и дезоксирибозиды и различные производные 2-дезоксирибозы. Стоит также отметить высокую степень гомологии TthPNPII в сравнении с ферментом человека – 40% [1, 3].

Для TthPNPII аденозин является значительно лучшим субстратом по K_m и K_cat в сравнении с гуанозином, что обусловлено различием заместителя в шестом положении пурина [1]. Сравнительный анализ ПНФ из термофильных бактерий семейства Deinococcus–Thermus, проведенный в [2], показал, что определяющую роль в субстратной специфичности TthPNPII (в [2] вывод сделан для тримерного ПНФ, гомологичного исследуемому TthPNPII) играет аминокислотный остаток Asp235. Аспартат в данном положении обусловливает высокое сродство фермента к аденозину, замена его на аспарагин (мутация D235N) увеличивает активность фермента относительно гуанозина [2].

Для исследования структурных основ субстратной специфичности TthPNPI рассмотрим окружение субстрата в активном центре фермента в радиусе до 4 Å от атомов субстрата (рис. 2б): Tyr85, Ala113, Phe187, Phe192, Leu198, Ile209, Gly210, Met211, Thr234, Asp235, Ala237, His244, Val250, а также принадлежащей соседнему мономеру Phe153. Можно видеть, что O6 и N7 атомы гуанозина находятся на расстоянии, достаточном для формирования водородных связей с атомами Asp235. Аденозин отличается от гуанозина наличием в шестом положении аминогруппы вместо оксогруппы, данная аминогруппа также может образовывать водородные связи с атомами Asp235.

Рис. 2.

Пространственная структура гексамера TthPNPII, в активных центрах расположен фосфат, изображенный сферами (а). Активный центр TthPNPII, светлыми линиями показан Phe153 из полипептидной цепи соседней субъединицы, сферами – фосфат, толстыми стержнями – гуанозин, пунктирными линиями – возможные водородные связи (б).

Мутация D235N несколько меняет картину взаимодействий, так как дикарбоновая аминокислота заменяется полярно нейтральной, однако амидогруппа аспарагина (СОNH₂) также может образовать водородную связь либо с кислородом в положении 6 гуанозина, либо с атомом N7 аденозина [1]. Благодаря полученной в [1] кристаллической структуре белка TthPNPII (рис. 2а) представляется возможным провести соответствующие модификации in silico и сравнить энергии связывания фермента с аденозином и гуанозином до и после мутации с последующей декомпозицией энергии по аминокислотным остаткам, чему и посвящено данное исследование.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Создание структур комплексов. Для получения необходимого комплекса в программе PyMOL [17] структуру исследуемого белка TthPNPII (PDB ID: 6TK9) совместили со структурой гомологичной ПНФ (PDB ID: 3IEX), находящейся в комплексе с гуанозином. Далее c использованием программы PyMOL гуанозин и остаток Asp 235 в белке заменили соответственно на аденозин и Asn. Тем самым сгенерировали четыре необходимые для молекулярной динамики (МД) комплекса дикого и мутантных типов ферментов отдельно с каждым из субстратов.

Моделирование молекулярной динамики. Для предварительной подготовки файлов, моделирования МД и анализа энергий системы использовали пакет программ для МД Amber [4, 5]. Использовали наборы силовых полей ff14SB [6] и GAFF (General AMBER Force Field) [7] для молекул ферментов и лигандов соответственно. Для параметризации лигандов использовали программу antechamber [4]. Для воды использовали модель TIP3P [8]. Молекулу комплекса поместили в кубическую ячейку. Минимальное расстояние от молекулы белка до граней ячейки составляло 1.5 нм. Ячейка была заполнена молекулами воды. В каждую из систем добавили несколько ионов натрия для нейтрализации заряда системы. На первом этапе для каждой из систем провели минимизацию энергии. Далее системы были уравновешены при температуре 300 К и давлении 1 бар путем моделирования динамики в NVT- и NPT-ансамблях (50 пс в каждом) соответственно. Температуру и давление в системах контролировали с использованием модифицированного термостата Ланжевена [9] и баростата Берендсена [10] с временными константами τ_T = 1 пс и τ_P = 2 пс соответственно. Продуктивное 10 нс моделирование МД для каждой из систем проводили в NPT-ансамбле с шагом интегрирования 2 фс. Дальнодействующие электростатические взаимодействия рассчитывали с использованием схемы суммирования по Эвальду в варианте PME [7, 11]. Кулоновские потенциалы и потенциалы Леннарда–Джонса были усечены до 1.4 нм, что является наиболее оптимальным для используемого силового поля [5].

Оценка энергии взаимодействия лигандов с белком. Для расчета энергии взаимодействия лигандов с рецептором использовали метод MM-GBSA (Molecular mechanics – Generalized Born surface area) [12, 13]. Расчет проводили с помощью программы MMPBSA.py [14]. Использовали 1000 фреймов для каждой из систем. Для вычисления энергии взаимодействия использовали модифицированную обобщенную модель Борна, предназначенную для макромолекул [15].

РЕЗУЛЬТАТЫ

На рис. 3 представлены зависимости RMSD (Root Mean Square Deviation, среднеквадратичное отклонение) от времени для C_α-атомов дикого и мутантных форм ферментов в комплексе с гуанозином. RMSD комплекса с нативным ферментом плавно стабилизируется около значения 1.75 Å, тогда как у комплекса мутантного типа плато RMSD устанавливается при значении 2 Å нм и только после 4 нс моделирования. Кривая RMSD комплекса мутантного типа менее плавная и больше в среднем по значению. Из этого можно заключить, что комплекс гуанозина с белком мутантного типа менее стабилен, чем с нативной формой.

Рис. 3.

Графики зависимости среднеквадратичного отклонения (RMSD) атомов от времени для комплексов гуанозина с ферементом дикого (1) и мутантного типа (2).

Для аденозина кривая RMSD (рис. 4) фермента мутантного типа в отличие от вычислительного эксперимента с гуанозином показывает большую стабильность комплекса с лигандом, достигая диапазона значений 1.6–1.75 Å. Комплекс нативного фермента с аденозином имеет менее сглаженную кривую и на интервалах времени 1.5–3, 6–7.2 и 8–10 нс значения RMSD заметно больше. Из графика следует, что отклонения атомов полипептидной цепи нативного белка растут на протяжении моделирования, достигая значения 2 Å.

Рис. 4.

Графики зависимости среднеквадратичного отклонения (RMSD) атомов от времени для комплексов аденозина с ферементом дикого (1) и мутантного типа (2).

Графики RMSF (Root Mean Square Fluctuation, среднеквадратичная флуктуация) комплексов с гуанозином (рис. 5) показывают заметные изменения в подвижности участков полипетидной цепи. Для комплекса мутантного типа флуктуации большей части остова белка увеличиваются, что касается и активного центра, хотя и максимальное значение флуктуаций ~3 Å достигается для нативного фермента. Кривые RMSF показывают, что комплекс мутанта с гуанозином в целом стал более подвижным и пики флуктуаций начали приходиться на другие аминокислоты. Кривая RMSF для комплекса мутантного типа также может свидетельствовать о дестабилизации и влиянии мутации на конформационные превращения, претерпеваемые белком в растворе.

Рис. 5.

График флуктуации координат атомов, усредненные по всему времени моделирования (RMSF) комплексов гуанозина с ферментом дикого (1) и мутантного типа (2).

Графики RMSF комплексов с аденозином не сильно разнятся до и после мутации (рис. 6). Заметное различие в кривых RMSF наблюдается на остатках β-листов, расположенных рядом с активными центрами, в которых проводили замену D235N; пиковое значение 4.5 Å приходится на β-листы (остатки 1419–1434) мономера F. Таким образом, существенного изменения в подвижности комплекса с аденозином до и после мутации, судя по кривым, не произошло, по крайней мере картина отличается от результатов с гуанозином. Нельзя не заметить, что первый отличительный пик кривой 1 (рис. 6) приходится на His244, расположенный в активном центре. Этот пик отсутствует у того же аминокислотного остатка гистидина в мутантной форме белка, как и у обоих комплексов с гуанозином, что свидетельствует о его менее фиксированном положении в пространстве. His244, как показано на рис. 2б, способен установить водородную связь с оксогруппой гуанозина, тогда как в связывании аденозина его роль, судя по всему, становится другой либо вовсе утрачивается. Это, в свою очередь, может быть обусловлено изменением распределения частичных зарядов в активном центре после мутации и стерическим различием субстратов.

Рис. 6.

График флуктуации координат атомов, усредненный по всему времени моделирования (RMSF), комплексов аденозина с ферментом дикого (1) и мутантного типа (2).

Также рассмотрено положение субстратов в результате моделирования МД. На рис. 7 построены кривые RMSD для неводородных атомов гуанозина в комплексе с ферментами дикого (кривая 1) и мутантного типа (кривая 2). Кривая комплекса гуанозина с нативным ферментом заметно флуктуирует до 7 нс с максимальным отклонением 1 Å, что вполне ожидаемо. Интереснее выглядит кривая гуанозина в комплексе с мутантом: первые 5 нс лиганд в обоих случаях имел схожее значение отклонения от начального положения, однако после 5 нс RMSD лиганда резко увеличилось на 1 Å, достигнув более-менее стабильного положения при 2 Å от начального положения.

Рис. 7.

Подвижность гуанозина в комплексах с ферментом дикого (1) и мутантного типа (2).

Аналогичные кривые RMSD для атомов аденозина в комплексе с ферментом показаны на рис. 8. Кривая комплекса с ферментом мутантного типа (кривая 2) выше, чем для комплекса с ферментом дикого типа (кривая 1), почти на всем интервале моделирования (за исключением последней наносекунды), из чего можно заключить, что мутация несколько повлияла на положение субстрата в активном центре, в среднем значения для двух случаев раличаются на 0.4 Å. Таким образом, полученные графики свидетельствуют о применимости траекторий для дальнейшего вычисления энергий. Влияние мутации зависит от субстрата. Комплекс ПНФ с аденозином стал более стабильным после замены аспарагиновой кислоты на аспарагин согласно кривой RMSD. В случае комплекса ПНФ с гуанозином замена Asp235 на Asn существенно увеличила подвижность большинства аминокислот (рис. 3) и заметно повлияла на динамику белковой глобулы.

Рис. 8.

Подвижность аденозина в комплексах с ферментом дикого (1) и мутантного типа (2).

Методом MM-GBSA из четырех траекторий рассчитаны энергии связи субстратов с белком в растворе (табл. 1–4).

Из рассчитанных значений следует понижение энергии связи ∆∆G_bind = –14.3 ккал/моль для комплекса с гуанозином, тогда как для аденозина произошло изменение в обратную сторону и ∆∆G_bind = 4.97 ккал/моль. Так как ∆G_bind < 0 во всех случаях, комплекс с любым субстратом термодинамически выгоден. Изменение энергий связи в противоположном направлении для аденозина и гуанозина свидетельствует об увеличении специфичности фермента к гуанозину в результате мутации D235N, что согласуется с данными [1, 2].

Проведенный вычислительный эксперимент показал, что мутация D235N сказывается на субстратной специфичности и динамике фермента, причем характер влияния мутации на динамику зависит от природы субстрата: комплекс мутанта с гуанозином становится более подвижным и менее стабильным, а с аденозином – более устойчивым, с меньшими отклонениями C_α-атомов пептидной цепи. TthPNPII, в нативной форме специфичная к аденозину и способная расщеплять гуанозин [1], после замены остатка аспарагиновой кислоты на аспарагин начала формировать, согласно результатам расчета методом MM-PBSA, термодинамически более выгодный комплекс с гуанозином на ∆∆G_bind = –14.3 ккал/моль. Для аденозина энергетический выигрыш связи с субстратом наоборот уменьшился на ∆∆G_bind = = 4.97 ккал/моль.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 21-13-00429) в рамках расчета МД и при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках выполнения работ по Государственному заданию ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН в части анализа результатов молекулярного моделирования.