Кристаллография, 2023, T. 68, № 2, стр. 276-280

ВВЕДЕНИЕ

Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) является возбудителем многих инфекционных заболеваний, возглавляет список бактерий, чаще всего вызывающих внутрибольничные инфекции и поражающих послеоперационные раны. Этот патогенный микроорганизм чрезвычайно устойчив к антибиотикам пенициллинового ряда, антисептикам, высоким температурам, прямым солнечным лучам. Наиболее опасными для человека являются штаммы S. aureus, устойчивые к метициллину (MRSA), ванкомицину (VRSA) и гликопептидам (GISA) [1–3].

Больше половины всех известных антибиотиков оказывают бактериостатический или бактерицидный эффект за счет нарушения или остановки белоксинтезирующего аппарата клетки бактерии. Ключевым звеном в процессе синтеза белка является рибосома.

Рибосомы (важнейшие органеллы клетки) представляют собой нуклеопротеид, собирающийся из одной (в малой 30S-субъединице) или нескольких (в большой 50S-субъединице) молекул рибосомальной РНК (рРНК) и специфических рибосомных белков. Сборка или созревание каждой частицы рибосомы – очень сложный и высококоординированный процесс, каждый этап которого зависит от целого ряда вспомогательных молекул – факторов сборки [4]. Даже небольшие нарушения в процессах сборки рибосом могут значительно уменьшить скорость синтеза всех белков в клетке или полностью остановить клеточное функционирование [5, 6].

Созревание малой 30S-субъединицы рибосомы в бактериальной клетке регулируется определенными факторами сборки, работающими в строгой последовательности [7, 8]. Одним из таких факторов является гуанозинтрифосфатсвязывающая гидролаза (ГТФаза) Era (Escherichia coli Ras-like protein), отвечающая за поздние этапы сборки рибосомной частицы и контролирующая таким образом клеточный рост и деление [9]. В настоящее время имеется мало информации об особенностях пространственного строения ГТФаз Era из различных микроорганизмов, в том числе из патогенной бактерии S. aureus [6].

ГТФаза Era относится к семейству гидролаз, но с характерным наличием в С-концевом регионе специфического домена, содержащего последовательность GxxG, ответственного за связывания с рРНК.

Era из S. аureus – низкомолекулярная ГТФаза (300 аминокислотных остатков, 35.3 кДа), состоящая из двух доменов: ГТФазный домен на N-конце (высококонсервативный среди семейства ГТФаз) и С-концевой домен, содержащий характерную для S. аureus последовательность GKGG. Согласно [10] ГТФаза Era благодаря участку GKGG распознает участок 16S рРНК в районе спирали 45 (h45) около 3'-конца с последовательностью ₁₅₃₁AUCACCUCCUUA₁₅₄₂, образует комплекс с рРНК, и это действие стимулирует ГТФазную активность Era. В свою очередь, гидролиз гуанозинтрифосфата (ГТФ) позволяет белку Era освободиться от зрелой 30S-субъединицы рибосомы [11]. Таким образом, ГТФаза Era отслеживает наличие достаточного количества ГТФ в клетке бактерии, необходимого для дальнейшей жизнедеятельности микроорганизма. Тем самым ГТФаза Era контролирует скорость роста клетки через регуляцию созревания рибосомной 30S-субъединицы [12].

Для некоторых бактерий ГТФаза Era жизненно необходима для клетки [13]. Поэтому ГТФаза Era из S. аureus может послужить отличной моделью для конструирования новых противомикробных препаратов на основе информации о ее трехмерной структуре.

Одним из современных методов точного определения структуры вещества является рентгеноструктурный анализ (РСА) кристаллов. Однако проблема таких исследований заключается в трудности получения кристаллов белков, что значительно увеличивает время эксперимента [14, 15]. Для получения информации о форме, размере, пространственной ориентации доменов белка в растворе используют метод малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР, или SAXS, small angle X-ray scattering). В данной работе проведены выделение, очистка, исследование структуры белка Era ГТФаза из S. аureus в растворе и выращивание кристаллов этого белка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование и экспрессия Era. Ген era клонировали из генома S. aureus и на основе вектора pET28a создали конструкт Era_Sa::pET28a, несущий ген era c шестью гистидинами на С-конце (His₆-Era) под контролем LacI^q-промотора. Конструкт подтвержден секвенированием. Культуру трансформированных полученной плазмидой клеток (E. coli штамм BL21(DE3)pLysS) выращивали на богатой питательной среде LB при 37°C на шейкере со скоростью вращения 180 об./мин до OD₆₀₀ = 0.6. Индукцию синтеза His₆-Era проводили с помощью добавления изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) с дальнейшей культивацией клеточной культуры в течение 4 ч при этих же условиях. Далее клетки осаждали центрифугированием 10 мин при частоте вращения 5000 об./мин при 4°C (центрифуга “Beckman”, Avanti JXN-26, ротор JLA-9.1000, США), замораживали и хранили при –24°C.

Для выделения белка Era полученные замороженные клетки размораживали, ресуспендировали в специально подобранном буфере 1 (50 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 0.8 М NaCl) в присутствии ингибиторов протеаз и разрушали с помощью ультразвукового гомогенизатора HD2070 (“Bandelin”, Германия). Полученный лизат центрифугировали при 45 000 об./мин при 4°C в течение 45 мин (центрифуга Optima XPN, ротор 45Ti) для осаждения клеточного дебриса.

Очистка Era. Очистку His₆-Era от супернатанта проводили в два этапа: сначала методом металл-хелатной аффинной хроматографии (Immobilised Ion Affinity Chromatography, IMAC), затем с помощью гель-фильтрации. Для этого супернатант наносили на Ni-NTA-сорбент (Ni-NTA Agarose, QIAGEN, Германия), последовательно промывали смолу буферами 2 (50 мМ Tris-HCl, pH 8.0; 1 М NaCl), 3 (50 мМ Tris-HCl, pH 8.0; 0.8 М NaCl; 20 мМ имидазол) и элюировали белок буфером 4 (50 мМ Tris-HCl, pH 8.0; 0.8 М NaCl; 0.3 М имидазол). Гель-фильтрацию проводили с помощью хроматографической системы NGC Discover (“BioRad”, США) на колонке Enrich Sec 650 (“BioRad”, США) в буфере 1. Пиковые фракции были отобраны и сконцентрированы в концентраторах с отсечением 10 кДа (Amicon Ultra, Merk KGaA, Германия) центрифугированием при 14 500 об./мин, 4°C в течение 10 мин, многократно. Чистоту полученного образца оценивали с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) (SDS-PAGE) в Tris-глициновом буферном растворе, рН 8.3 (25 мМ Tris-буфер; 250 мМ глицина; 0.1% додецилсульфат натрия) при температуре 20°С и рабочем напряжении 140 В.

Кристаллизация Era. Раствор очищенного белка сконцентрирован до значения 30 мг/мл в буфере 1. К объему белка Era, рассчитанному на кристаллизационный эксперимент, добавили нерасщепляемый аналог ГТФ (GppCp, Guanosine-5'-[(β,γ)-methyleno]triphosphate, Sodium salt, Jena Bioscience, Германия) до конечной концентрации 10 мМ. Поиск кристаллизационных условий был выполнен с использованием наборов JBScreen JCSG++1, ++2, ++3 и ++4 (Jena Bioscience, Германия) методом диффузии в парах в варианте висячей капли при 22°С в 24-луночных планшетах (Hampton Research, США). 1.25 мкл буфера с белком His₆-Era+GppCp смешивали с 1.25 мкл противораствора и уравновешивали 250 мкл противораствора.

Малоугловое рентгеновское рассеяние. Для исследований методом МУРР использовали образец белка His₆–Era из S. aureus с концентрацией 12 мг/мл в буфере 1. Предварительный анализ данных выполняли с использованием дифрактометра Nanostar SAXS (Bruker AXS GmbH, Германия) ФИЦ КазНЦ РАН. Дальнейшие эксперименты выполнены на установке Rigaku HighFlux HomeLab (Rigaku, Япония) [16] с вращающимся медным анодом MicroMax 007-HF. Длина волны генерируемого рентгеновского излучения 1.54 Å (CuK_α). Расстояние от позиции образца до детектора составляло 2.0 м (диапазон q составляет 0.006–0.19 Å). Измерения выполнены при температуре 20°С. Азимутальное интегрирование полученных 2D-изображений с детектора выполнено с использованием программного обеспечения Saxsgui (Rigaku Innovative Technologies, Inc., Токио, Япония) и JJ X-ray System Aps (Хорсхольм, Дания).

Получение дифракционных данных. Данные рентгеновской дифракции были собраны при 100 K (криопротекция в градиенте концентрации глицерина 1–10% с шагом 1%) на дифрактометре Rigaku XtaLAB Synergy-S, оснащенном детектором HyPix-6000HE. Длина волны генерируемого рентгеновского излучения 1.54 Å (CuK_α). Данные рентгеновской дифракции были собраны с шагом 0.5° при расстоянии от кристалла до детектора 40 мм и времени экспозиции 100 с. Дифракционные изображения обработаны с помощью пакета программ XDS [17].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для получения препарата белка, удовлетворяющего требованиям кристаллизации, провели подбор и оптимизацию условий получения белка His₆-Era в культуре клеток E. coli, подбор состава и pH буфера на этапах разрушения клеток и очистки белка. В итоге были использованы буферные условия: 50 мМ Tris-HCl, pH 8.0; 200 мМ NaCl) [18]. Профиль гель-фильтрации приведен на рис. 1. Чистоту полученного после гель-фильтрации препарата белка анализировали с помощью электрофореза в ПААГ (рис. 2).

Рис. 1.

Пик элюции His₆–Era после нанесения на гель-фильтрационную колонку Enrich Sec 650.

Рис. 2.

Электрофоретический анализ в ПААГ в денатурирующих условиях нескольких пиковых фракций His₆–Era после гель-фильтрации (М – маркер, 1, 2 – фракции His₆–Era с левого плеча пика, 3, 4 – фракции с правого плеча пика).

При концентрировании белка свыше 3 мг/мл наблюдалась его агрегация. Агрегации удалось избежать, повысив концентрацию NaCl до 0.8 М (буферы 1, 3, 4) и до 1 М (буфер 2), как это было сделано в [10]. В результате удалось сконцентрировать His₆-Era до значения 30 мг/мл. Перед кристаллизацией к образцу белка добавляли негидролизуемый аналог ГТФ GppCp до 10 мМ для стабилизации структуры целевого белка и проводили поиск условий кристаллизации. В результате в условиях: 20% PEG 3350; 0.2 M цитрата калия; рН 8.3 (JBScreen JCSG++1/B12, Jena Bioscience, Германия), через 4 нед выросли монокристаллы белка His₆-Era размером 80 × 50 × 40 мкм (рис. 3). Для подтверждения того, что полученные кристаллы являются кристаллами целевого недеградировавшего белка His₆-Era, использовали методику отмывки, растворения кристаллов в воде и анализ полученного раствора с помощью денатурирующего электрофореза в ПААГ (рис. 4).

Рис. 3.

Кристалл His₆–Era.

Рис. 4.

ПААГ электрофорез кристаллов His₆–Era; 2 – растворенные кристаллы, 1 – весь оставшийся маточный раствор из кристаллизационной капли.

Данные по исследованию размера, формы и пространственного расположения молекул белка His₆-Era из S. aureus в растворе методом МУРР обработаны в пакете программ ATSAS [19]. Проекции полученной формы частиц показаны на рис. 5. Полученная 3D-модель электронной плотности имеет форму цилиндра с параметрами радиуса гирации R_g = 23.1 Å и наибольшей длиной D_max = 57.7 Å. Рассчитанная структура Era ГТФаза из S. aureus с помощью проекта AlphaFold2 [20] имеет размеры 62 Å × 56 Å × 47 Å. Для этой структуры в программном пакете CRYSOL был проведен теоретический расчет радиуса гирации, он составил R_g = 21.5 Å. Отметим, что согласно экспериментам РСА белок Era из E. coli кристаллизуется в виде димера [21]. Однако параметры полученной в настоящей работе формы свидетельствуют о том, что в исследуемом растворе при заданной концентрации белок Era ГТФаза из золотистого стафилококка находится в виде мономера.

Рис. 5.

Формы белка His₆–Era из S. aureus в двух проекциях по данным МУРР. Для сопоставления размеров показана Era GTPase из S. aureus, полученная с помощью программы AlphaFold 2.0 (UniProt A5IT95).

На рис. 6 приведена дифрактограмма кристалла белка His₆–Era, полученная при исследовании методом РСА. Дифракционная картина соответствует дифракции рентгеновского излучения на элементарной ячейке белкового кристалла с разрешением ~4 Å, что не позволяет решить структуру белка с высоким разрешением. Необходимы дальнейший подбор условий кристаллизации, криопротекции кристалла и сбор данных на более интенсивном синхротронном источнике излучения, что планируется при дальнейших исследованиях.

Рис. 6.

Дифракционная картина белка His₆–Era.

В данной работе впервые оптимизированы условия выделения, очистки и кристаллизации ГТФазы Era из S. аureus в комплексе с негидролизуемым аналогом ГТФ GppCp и найдены условия кристаллизации комплекса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведен синтез рекомбинантного белка Era из патогенной бактерии Staphylococcus aureus. Достаточное для кристаллизации количество белка было очищено с помощью металл-хелатной и эксклюзионной хроматографии, также показано предпочтительное мономерное состояние белка в растворе. Проведен подбор условий для кристаллизации. Кристаллы получены методом диффузии в парах в варианте висячей капли с использованием противораствора, содержащего PEG 3350 и цитрат калия. Данные кристаллы белка Era из Staphylococcus aureus демонстрируют дифракционную картину, характерную для белковых кристаллов. Оптимизация найденных условий кристаллизации белка Era из Staphylococcus aureus позволит в дальнейшем получить кристаллы, пригодные для структурных исследований методом РСА.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 21-74-20034).