Кристаллография, 2023, T. 68, № 2, стр. 298-305

ВВЕДЕНИЕ

Положительные результаты терапии широкого спектра заболеваний в значительной степени зависят от возможности осуществлять доставку препаратов в целевой орган, ткань или клетку. Несмотря на длительные исследования в области адресной доставки лекарств, в настоящее время бόльшая часть лекарственных препаратов не обладает адресностью и распределяется по всему организму, попадая преимущественно в клетки макрофагов печени и селезенки. Развитие побочных эффектов и снижение эффективности удельной дозы препарата особенно критичны при доставке химиотерапевтических препаратов с выраженными токсическими свойствами. Для устранения недостатков традиционной терапии и уменьшения побочных эффектов особую привлекательность приобрела идея, основанная на использовании сосудистых аномалий опухолей для обеспечения доступа к ним лекарственных препаратов с избежанием проникновения в нормальные ткани [1]. Особенности сосудов опухоли, в частности повышенная проницаемость и возможность удерживать введенные препараты и частицы, получили название EPR-эффекта [2]. С момента открытия и до сих пор EPR-эффект считается наиболее важной концепцией при разработке систем доставки противоопухолевых препаратов [1, 3–5]. Однако медленная диффузия лекарственных препаратов в опухолевую ткань в настоящее время признана ограничивающим фактором, серьезно снижающим лекарственную эффективность в клетках-мишенях. Помимо этого, особенности пор в кровеносных капиллярах опухоли могут сильно варьироваться в зависимости от природы опухолей, стадии развития, места положения и других факторов, а последние исследования в этой области показывают, что EPR-эффект гораздо сильнее выражен у грызунов, чем у людей [6–9]. Для более существенного увеличения эффективности терапии перспективной стратегией представляется использование особенностей микроокружения опухоли в дополнение к EPR-эффекту, в частности слабокислого рН [1, 4, 10]. Это делает перспективным разработку рН-чувствительных систем доставки, которые высвобождают инкапсулированное содержимое при понижении рН среды. Среди чувствительных к рН высоко пористых частиц благодаря хорошей биосовместимости и низкой токсичности выделяются частицы СаСО₃ [11–15]. Одна из полиморфных модификаций СаСО₃, ватерит, характеризуется значительной сорбционной емкостью, что позволяет сорбировать различные вещества с эффективностью до 10–15% от массы самих частиц [16]. В настоящее время для доставки in vitro в основном используют частицы ватерита среднего диаметра 2–5 мкм [17, 18]. Частицы СаСО₃ диаметром менее 1 мкм не так распространены из-за сложности их синтеза [19]. Известно, что частицы ватерита быстро высвобождают загруженные в них противораковые вещества (камптотецин, доксорубицин и доксициклин) при pH от 4 до 6 (до 90%), в то время как при pH = 7.4 высвобождение ничтожно мало [12, 13, 17, 20, 21].

В одной из первых работ по изучению влияния незагруженных частиц СаСО₃ размером 30–200 нм на рост опухоли у грызунов было показано, что частицы CaCО₃ избирательно накапливаются во внеклеточной области опухолей, повышая и поддерживая рН опухоли на уровне ∼7.4 благодаря высокой буферной способности [22]. В [23] продемонстрировано, что непрерывная инфузия 100 ± 9 нм частиц CaCO₃ способна ингибировать метастазирование опухоли в модели агрессивно метастазирующего ортотопического рака молочной железы. В [24] выявлено, что при совместном культивировании клеток рака молочной железы и фибробластов добавление наночастиц CaCO₃ (120 ± 30 нм) привело к избирательному ингибированию роста и замедлению миграции раковых клеток без влияния на фибробласты. Этот эффект связывают с тем, что растворение частиц CaCO₃ в слабокислой среде, характерной для окружения раковых клеток, обеспечивает хорошую буферизацию pH в пределах нормального физиологического диапазона, что приводит к метаболическому перепрограммированию раковых клеток и может уменьшить их агрессивность, не влияя на рост и поведение окружающих нормальных клеток.

Степень накопления частиц в опухолевой ткани определяется диаметром частиц, их формой, зарядом и природой поверхности [4, 9]. Благодаря возможности получать частицы CaCО₃ с требуемыми характеристиками с помощью варьирования условий их синтеза, которая была изучена ранее [19, 25, 26], в настоящей работе синтезирована серия частиц CaCО₃ в диапазоне размеров от 50 до 500 нм. Изучено влияние размера и структуры частиц СаСО₃ на эффективность их загрузки доксорубицином, а также его высвобождение в модельных условиях при нейтральном и кислом рН.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и реактивы. В ходе работы использовали хлорид кальция (CaCl₂⋅2H₂O и CaCl₂⋅ ⋅6H₂O), карбонат натрия (Na₂CO₃), гидрокарбонат натрия (NaHCO₃), карбонат аммония ((NH₄)₂ CO₃), гидроксид калия (KOH), хлорид железа (III) (FeCl₃), фосфатно-солевой буфер (PBS), хлорид магния (MgCl₂), глицерин, Твин 20 и гидрохлорид доксорубицина производства Sigma-Aldrich (Германия), полиэтиленгликоль (ПЭГ 2000 Да) производства Carl Roth (Германия), DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) производства GIBCO Life Technologies (США). Для проведения экспериментов воду очищали с помощью системы Milli-Q Plus.

Получение частиц CaCO₃. Сферические субмикронные частицы CaCO₃ были получены по методике, описанной в [19]. Для этого к перемешиваемой на магнитной мешалке смеси глицерина с 0.33 М водного раствора CaCl₂ быстро добавляли равный объем смеси глицерина с эквимолярным водным раствором Na₂CO₃. Реакцию проводили в смеси глицерин : вода при содержании глицерина 80%. Реакционную смесь перемешивали со скоростью 500 об./мин в течение трех часов, затем суспензию полученных частиц CaCO₃ трижды промывали от ионов Na⁺ и Cl^– дистиллированной водой. Для предотвращения агрегации частиц суспензию периодически подвергали ультразвуковому воздействию. Все образцы высушивали, частицы карбоната кальция хранили в виде порошка.

Частицы СaCO₃ получали также методом соосаждения [25]. Для этого под действием ультразвука к 1 мл водного раствора, содержащего 0.10 М NaHCO₃, 0.1 мг/мл ПЭГ, 0.1% об. Твин 20 и DMEM, добавляли 100 мкл водного раствора, содержащего 0.1 М СaCl₂ и MgCl₂, 0.1% об. DMEM. Частицы отделяли центрифугированием (10 мин, 13.400 об./мин) и хранили в дистиллированной воде.

Синтез наночастиц состава CaCO₃ : Si : Fe проводили с помощью темплатного метода, описанного в [26]. Для этого использовали монодисперсные сферические частицы кремнезема (mSiO₂) с внешним диаметром 200 нм, содержащие цилиндрические наноканалы диаметром 3 нм [27]. Для подготовки мезопористых частиц mSiO₂ к синтезу осуществляли их капиллярную пропитку 1 М водным раствором CaCl₂ в течение 24 ч. Затем частицы высушивали при 60°С, полученный порошок выдерживали в 2 М водном растворе (NH₄)₂CO₃. После этого частицы редиспергировали в деионизованной воде, центрифугировали и высушивали на воздухе. Описанную процедуру синтеза CaCO₃ повторяли 6 раз. Далее проводили травление материала темплата (аморфного SiO₂) с использованием 3 М водного раствора КОН в течение 5 ч при температуре 70°С. Затем частицы центрифугировали и редиспергировали в деионизованной воде. Для получения агрегативно устойчивого гидрозоля к водной суспензии наночастиц добавляли 0.1 М раствор FeCl₃. Полученную суспензию выдерживали в течение суток, после чего частицы CaCO₃ : Si : Fe многократно центрифугировали и промывали деионизованной водой.

Загрузка частиц CaCO₃ доксорубицином. Для загрузки частиц CaCO₃ и CaCO₃ : Si : Fe доксорубицином проводили адсорбцию из раствора доксорубицина на предварительно сформированные нано- и субмикрочастицы. Для этого навески частиц определенной массы помещали в раствор доксорубицина (0.15 мг/мл) и инкубировали на шейкере в течение двух часов, затем центрифугировали и промывали 1 раз деионизованной водой. Для определения концентрации доксорубицина супернатанты исследовали спектрофотометрически на длине волны поглощения доксорубицина (480 нм).

Высвобождение доксорубицина при различных рН. Высвобождение доксорубицина из частиц изучали в буферных растворах с различным рН. Для этого 6 мг частиц ресуспендировали в 1.5 мл фосфатного буфера с рН = 4 или 7 и непрерывно перемешивали на шейкере. Через определенные промежутки времени (15, 30 мин, 1, 2, 6, 24 ч) образцы центрифугировали, и супернатант добавляли к 1.5 мл свежего буферного раствора с соответствующим рН. Супернатант анализировали спектрофотометрически при длине волны 480 нм для определения концентрации доксорубицина.

Физико-химические методы исследования. Анализ размера, формы, морфологии поверхности и структуры частиц проводили на сканирующем электронном микроскопе Jeol 7401F при напряжении 5 кВ.

Исследования частиц методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) выполняли на микроскопе Tecnai Osiris (FEI, США) с ускоряющим напряжением 200 кВ, широкоугловым детектором темного поля и EDX-спектрометром Bruker SuperX, а также на микроскопе Jeol JEM-2100F (JEOL, США), оборудованном EDX-спектрометром INCA (Oxford Instruments, Великобритания).

Гидродинамический размер частиц и ζ-потенциал их поверхности в водной суспензии определяли с помощью автоматического анализатора Zetasizer Nano-ZS (Malvern, Великобритания).

Порошковые рентгеновские дифрактограммы субмикронных частиц снимали на лабораторных дифрактометрах Rigaku Miniflex 600 и D2 Phaser (Bruker, Германия) с использованием источника CuK_α (λ = 1.5406 Å, 40 кВ, 15 мА) в режиме съемки с шагом 0.02° и со скоростью 1 шаг/с в интервале углов 2θ 18°–75°. Определение фазового состава и расчет среднего размера области когерентного рассеяния (ОКР) проводили методом Ритвельда при помощи программы FullProf.

Эффективность загрузки частиц CaCO₃ и CaCO₃ : Si : Fe доксорубицином оценивали спектрофотометрически с помощью двухлучевого сканирующего спектрофотометра Lambda-С650 (Perkin Elmer, США) с диапазоном длин волн 190–900 нм. Оптическую плотность раствора регистрировали на длине волны 480 нм, соответствующей максимуму поглощения доксорубицина. Количество вещества, инкорпорированного в частицы CaCO₃ и CaCO₃ : Si : Fe, определяли с помощью предварительно построенных калибровочных прямых по разнице концентрации раствора вещества после адсорбции по отношению к исходному раствору. Эффективность капсулирования (ЭК) определяли по формуле

где K_д – количество вещества (концентрация), добавленного к частицам, K_суп – количество вещества в супернатанте после адсорбции. Загрузку частиц доксорубицином в массовых процентах (мас. %) рассчитывали как отношение массы включенного вещества к массе частиц. Для изучения высвобождения доксорубицина из частиц определяли содержание вещества в супернатантах. Данные, представленные на графиках, являются усредненными значениями серии экспериментов (3–5), проведенных в одинаковых условиях, и среднеквадратичными отклонениями серии измерений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Частицы карбоната кальция, полученные в результате смешивания водных растворов солей, представляют собой не агрегированные сферические частицы с развитой поверхностью (рис. 1). При выбранном составе кристаллизационной смеси получены субмикрочастицы карбоната кальция, средний гидродинамический размер которых составляет 500 ± 90 нм (СаСО₃–500) и 172 ± 75 нм (СаСО₃–200) (рис. 1а, 1б). Гидродинамический диаметр наночастиц CaCO₃ : Si : Fe, синтезированных в порах частиц кремнезема, составляет 65 ± 15 нм (CaCO₃ : Si : Fe–50). Распределения по размерам частиц СаСО₃ и CaCO₃ : Si : Fe в водной суспензии приведены на вставках рис. 1.

На рис. 2 представлены энергодисперсионные рентгеновские спектры для трех образцов частиц и распределения химических элементов для отдельных частиц в этих образцах. Энергодисперсионный анализ частиц CaCO₃–500 показывает значительное преобладание кальция, углерода и кислорода, которые распределены равномерно. Для частиц СаСО₃–200 идентифицируются магний и фосфор, колокализованные с кальцием, поскольку частицы синтезировали в питательной клеточной среде, богатой этими элементами. В образце наночастиц CaCO₃ : Si : Fe–50 определяются остаточный кремний (после растворения частиц кремнезема) и железо, которые применяли для стабилизации наночастиц. На карте распределения элементов видно, что железо колокализуется не только одновременно с кальцием, но и в свободном виде, что говорит о его избыточном содержании для улучшения стабильности наночастиц.

Структуру и фазовый состав субмикро- и наночастиц СаСО₃ изучали методом порошковой рентгеновской дифракции. Для анализа фазового состава частиц использовали модель структуры ватерита из [28, 29] (пр. гр. P6₃/mmc, параметры гексагональной ячейки a = b = 4.131, c = 8.492 Å). Отметим, что структура поликристаллического ватерита до сих пор обсуждается и нет единой модели, которая описывала бы все рефлексы на дифрактограммах независимо от способа получения частиц. Структура кальцита, определенная в 1914 г. [30], была одной из первых структур, изученных с помощью рентгеновских лучей. Характеристические пики на полученных дифрактограммах (рис. 3а) при углах 2θ, равных 20.77°, 24.70°, 26.90°, 32.60°, 38.65°, 43.65°, 48.75°, 49.70°, 55.50°, соответствуют кристаллографическим плоскостям ватерита (004), (110), (112), (114), (211), (300), (304), (118) и (224). Пики при углах 2θ, равных 23.03°, 29.34°, 32.16°, 35.98°, 39.38°, 43.11°, 47.51°, 48.52° и 57.30°, соответствуют кристаллографическим плоскостям кальцита (012), (104), (006), (110), (113), (103), (202), (016), (018) и (122).

Все обнаруженные пики для образца СаСО₃–500 относятся к двум фазам ватерита и кальцита, полнопрофильный анализ методом Ритвельда подтвердил, что кристаллы СаСО₃–500 состоят на 99.4% из фазы ватерита с 0.6% включением кальцита. На дифракционной кривой образца наночастиц CaCO₃ : Si : Fe–50 (рис. 2а) наблюдается набор рефлексов, соответствующих кальциту, примесных кристаллических фаз не обнаружено. Рассчитанный методом Ритвельда средний размер ОКР для наночастиц CaCO₃ : Si : Fe–50 составил ∼45 нм. Достаточно большое значение ОКР может быть связано с тем, что образец предварительно сушили при температуре 60°С, что способствует перекристаллизации наночастиц карбоната кальция в субмикронные частицы [26]. Как было определено ранее, для субмикронных поликристаллов СаСО₃–500 ОКР может принимать форму эллипсоида с длиной главных осей ∼120 и 50 нм [31].

На рис. 3б представлены ПЭМ-изображение отдельной частицы СаСО₃–200 и картина электронной дифракции, полученная с этой частицы. Отсутствие четких пиков интенсивности свидетельствует о том, что частицы СаСО₃–200 имеют аморфную структуру. Для сравнения загрузочных емкостей полученных частиц, имеющих разные средние размеры и кристаллическую структуру, одинаковые навески частиц инкубировали в растворе доксорубицина при одинаковых условиях.

Для расчета концентрации доксорубицина в растворах была построена калибровочная прямая (рис. 4а), с использованием которой рассчитана загрузка частиц СаСО₃ препаратом. Показано, что загрузка составила 4 мас. % для частиц CaCO ₃ : Si : Fe–50, 4.8 мас. % для частиц СаСО₃–200 и 6.5 мас. % для частиц СаСО₃–500, что соответствует 27, 32 и 44% эффективности инкапсулирования от исходного раствора доксорубицина. Синтезированные двумя методами частицы CaCO₃ имеют различный размер, кристаллическую структуру и загрузочную емкость для противоракового препарата, которые приведены в табл. 1. С учетом того, что погрешности для определения загрузочной емкости частиц составляют ∼1 мас. %, можно считать, что три полученных образца CaCO₃ имеют сравнимые загрузочные емкости для доксорубицина.

В качестве модельной среды для изучения высвобождения доксорубицина был выбран натрий-фосфатный буфер, поскольку осмолярность и концентрации ионов в нем соответствуют значениям в крови, тканевых жидкостях и тканях организма человека. На рис. 4б представлены результаты высвобождения доксорубицина из кристаллических частиц СаСО₃ двух размеров при их инкубации в фосфатном буфере с рН 4 и 7. Из кривых на рис. 4б видно, что для всех образцов высвобождение доксорубицина осуществляется в два этапа. Начальный этап характеризуется резким увеличением концентрации препарата в растворе, затем происходит постепенный выход оставшегося в частицах доксорубицина. Данное обстоятельство указывает на то, что на начальном этапе наблюдали выход соединения с поверхности и из пор частиц за счет процесса десорбции, а также вследствие первичного растворения карбонатной матрицы в поверхностных слоях по сравнению с объемом частицы. Последующее замедление данного процесса может быть связано с постепенным растворением карбонатной матрицы при кислотных значениях рН. Обычно интенсивный выход характеризует высвобождение иммобилизованных веществ из высокопористых частиц, которое можно замедлить с помощью покрытия частиц полимерными оболочками [32, 33]. При сравнении высвобождения доксорубицина при нейтральных (рН = 7) и более кислотных условиях (рН = 4) наиболее интенсивное высвобождение препарата наблюдается из частиц СаСО₃–500 при рН = 4, что однозначно связано с растворением карбонатной матрицы при кислотных значениях рН. При увеличении рН наблюдается замедление высвобождения препарата, что объясняется большей стабильностью карбоната кальция при нейтральном значении рН. Доксорубицин из частиц CaCO₃ : Si : Fe–50 высвобождается практически одинаково при разных рН, что связано со стабильной кристаллической структурой наночастиц, которые представляют собой кальцит, а также с присутствием в их составе Si и Fe, которые могут влиять на скорость растворения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В процессе массовой кристаллизации при соосаждении с добавлением в реакционный объем глицерина или смеси ПЭГ, Твин 20 и DMEM синтезированы субмикронные частицы СаСО₃, имеющие средние гидродинамические диаметры 500 ± 90 и 172 ± 75 нм соответственно. С помощью темплатного синтеза в мезопористых частицах кремнезема получены наночастицы СаСО₃ : Si : Fe диаметром 65 ± 15 нм. Исследование образцов методами порошковой рентгеновской дифракции и электронной дифракции показало, что структура частиц различна, и наночастицы, стабилизированные ионами железа, представляют собой стабильную модификацию кальцита. Субмикронные частицы СаСО₃, полученные соосаждением, имеют структуру ватерита или аморфны. Несмотря на различие структур синтезированных частиц эффективности их загрузки противораковым соединением сопоставимы и составляют 4–6.5 мас. %. При инкубации наночастиц кальцита при рН = 4 и 7 высвобождение иммобилизованного доксорубицина происходит одинаково. Стабильность наночастиц кальцита в кислом рН обусловлена не только наиболее термодинамически стабильной полиморфной модификацией, но и наличием в их составе кремния и железа. Наиболее интенсивное высвобождение доксорубицина происходит из субмикронных метастабильных частиц ватерита при рН = 4, что объясняется растворением частиц при кислотных значениях рН. Замедление высвобождения инкапсулированного вещества со временем связано с постепенным ростом рН в результате растворения частиц. Таким образом, частицы CaCO₃ и CaCO₃ : Si : Fe могут служить контейнерами для доксорубицина с возможностью выбрать такие параметры частиц, чтобы вещество либо длительное время не высвобождалось, либо высвобождалось в кислой среде.

Д.А. Еуров и Д.А. Курдюков выражают благодарность М.А. Яговкиной и Д.А. Кириленко за исследования частиц CaCO₃ : Si : Fe методами рентгеновской дифракции и ПЭМ.

Работа в части получения и характеризации частиц CaCO₃–500 выполнена в рамках государственного задания ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН с использованием оборудования ЦКП ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН. Синтез наночастиц CaCO₃ : Si : Fe выполнен в рамках государственного задания 0040-2019-0012. Синтез частиц CaCO₃–200 выполнен в рамках государственного задания ИХБФМ СО РАН 121031300042-1. Работы по загрузке и высвобождению доксорубицина выполнены при поддержке Российского научного фонда (грант № 21-74-10058).