Мембраны и мембранные технологии, 2022, T. 12, № 4, стр. 245-253

ВВЕДЕНИЕ

Аминокислоты рассматривают в качестве актуальных аналитов, поскольку они являются нутриентами и маркерами различных заболеваний, а также представляют собой привлекательные модельные объекты для исследования влияния размера и природы радикала органических ионов на характеристики их определения разрабатываемыми методами. Традиционные методы определения аминокислот, такие как ВЭЖХ, спектрофотометрия и электрофорез, имеют ряд ограничений для потокового анализа пищевых, технологических и физиологических сред. Для экспрессного внелабораторного определения аминокислот в пищевой промышленности и клинической диагностике разрабатываются химические сенсоры. Подавляющее число работ в этой области посвящено вольтамперометрическим, амперометрическим [1–5] и оптическим [6–10] сенсорам на основе композиционных материалов, включающих перфторсульфополимеры Nafion, органические кислоты, наночастицы металлов и углеродные материалы. При создании потенциометрических сенсоров для определения аминокислот используют пластифицированные поливинилхлоридные мембраны, содержащие аниообменники на основе тетрафенилбората натрия или фосфорномолибденовой кислоты [11], которые избирательно взаимодействуют с протонированными азотсодержащими соединениями, поэтому не отличаются высокой селективностью к аминокислотам в реальных средах.

Невысокая селективность (перекрестная чувствительность) сенсоров может быть компенсирована объединением их в мультисенсорные системы с применением многомерных математических методов обработки данных. В работах [12, 13] показана возможность определения аминокислот с использованием массивов перекрестно чувствительных сенсоров, аналитическим сигналом которых является потенциал Доннана (ПД), на основе перфторированных сульфокатионообменных мембран Nafion и МФ-4СК. ПД-сенсоры не содержат компонентов, селективно взаимодействующих с аналитами, варьирование чувствительности к ним достигается повышением их сорбции, как по ионообменному, так и по необменному механизмам, а также подавлением сорбции некоторых мешающих ионов. Это может быть достигнуто посредством термообработки мембран при различной относительной влажности и введения наночастиц различной природы [12, 13]. Природа и концентрация допанта выбираются с целью введения в мембрану дополнительных реакционных центров для аналитов, а также повышения проницаемости мембран для них вследствие совокупного действия электростатических, осмотических и упругих сил, обусловленного присутствием наночастиц в порах и/или матрице мембраны. В работе [13] показана возможность существенного увеличения чувствительности и точности определения гидрофобных аминокислот аланина (Ala), валина (Val) и фенилаланина (Phe) в катионной форме посредством модификации мембран МФ-4СК углеродными нанотрубками (УНТ), предварительно обработанными окислителем для функционализации поверхности карбоксильными группами (УНТ-COO^–). Такая модификация способствует поступлению в мембраны ионов аминокислот, в том числе за счет сродства к ним УНТ. Хорошие сорбционные свойства УНТ по отношению к аминокислотам описаны в ряде работ, посвященных иммобилизации аминокислот, пептидов и белков на поверхности УНТ с целью создания материалов для биосенсоров или адресной доставки биомолекул в организм [14–16]. Стоит отметить, что функционализация поверхности допантов часто приводит к существенному улучшению свойств ионообменных мембран, в частности, их селективности [17, 18]. На основании этого в данной работе исследованы мембраны МФ-4СК, содержащие наночастицы УНТ-COO^–, для повышения чувствительности ПД-сенсоров к аминокислотам аланина, валина и фенилаланина в анионной и цвиттер-ионной формах в щелочных водных растворах.

Целью работы явилась разработка мультисенсорных систем с ПД-сенсорами на основе мембран МФ-4СК, модифицированных наночастицами УНТ-COO^–, для определения анионов и цвиттер-ионов аланина, валина и фенилаланина совместно с катионами калия в щелочных водных растворах.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты исследования. Для приготовления градуировочных растворов использовали сухие вещества аланин (2-аминопропановая кислота; ≥99%; Sigma-Aldrich, США), валин (2-амино-3-метил бутановая кислота; ≥99%; Sigma-Aldrich, США), фенилаланин (2-амино-3-фенилпропановая кислота; ≥99%; Sigma-Aldrich, США), гидроксид калия (ООО “Экохим”, Россия; стандарт-титр) и деионизованную воду (сопротивление 18.2 МОм, рН 5.41 ± 0.05). Концентрации аминокислоты и щелочи варьировали в различном соотношении в диапазоне от 1.0 × 10^–4 до 5.0 × 10^–2 М. Значения рН растворов Ala + KOH, Val + KOH, Phe + KOH варьировались в диапазонах 8.19–9.97, 7.96–9.97 и 8.09–10.00, соответственно. В водных растворах в исследуемых диапазонах рН аминокислоты присутствуют преимущественно в форме цвиттер-ионов и частично в форме однозарядных анионов.

Получены мембраны МФ-4СК с однородным и градиентным распределением (по площади образца) нанотрубок УНТ-COO^–. Однородно модифицированные образцы использовали для исследования равновесных и транспортных свойств, градиентно модифицированные – для организации ПД-сенсоров. В качестве образцов сравнения были также изготовлены немодифицированные мембраны. Исходными материалами служили 10% раствор перфторсульфополимера МФ-4СК в литиевой форме в диметилформамиде (эквивалентная масса ЭМ = 1100; ОАО “Пластполимер”, Россия) и многостенные УНТ Таунит S12 (внешний диаметр 20–40 нм, внутренний диаметр 5–10 нм, длина до 10 мкм, полученные каталитическим пиролизом-CVD углеводородов на Ni/Mg катализаторе; ООО “НаноТехЦентр”, Россия).

Модификация поверхности УНТ карбоксильными группами достигалась в результате очистки коммерческих образцов от остатков катализатора, использованного при синтезе. Для этого готовили их суспензию в растворе, содержащем 30% HNO₃, в соотношении по массе 1 : 8, выдерживали в течение 1 ч при 90°С при постоянном перемешивании, затем промывали большим количеством воды до нейтрального pH и сушили на воздухе при 90°С в течение 24 ч.

Мембраны МФ-4СК, содержащие 0.5 и 1.0 мас. % УНТ-COO^–, были получены отливкой из раствора полимера, смешанного с навеской предварительно подготовленных наночастиц допанта. Полученную смесь (объемом 25 мл) подвергали обработке с помощью заполненной водой ультразвуковой (УЗ) ванны RK-100 (частота 35 кГц, мощность 4.0 Вт; Bandelin electronic, Германия) в течение 45 мин, не допуская нагревания раствора полимера выше 50°С. Для получения однородно модифицированных образцов полученную взвесь из раствора полимера и допанта выливали на стеклянную поверхность. Для получения градиентно модифицированных образцов в прямоугольную стеклянную ячейку (4 × 10 см) одновременно выливали с одной стороны раствор полимера МФ-4СК без допанта и без УЗ обработки (немодифицированная сторона), а с другой – раствор полимера после УЗ обработки, содержащий допант (модифицированная сторона). Полученные пленки имели два участка равной длины, один из которых содержал допант, при этом граница между модифицированной и немодифицированной частями была несколько размыта (ширина переходной области не превышала 0.5 см). Наличие переходной области не вносило погрешность в отклик ПД-сенсора, т.к. в процессе измерения концы мембраны, имеющей длину 6–8 см, погружались в исследуемый раствор и раствор сравнения только на 0.3–0.5 см. При этом с раствором сравнения контактировал конец немодифицированной части, отсутствие допанта в которой, обеспечивало близость составов раствора сравнения и внутрипорового раствора, нивелируя межфазный скачок на соответствующей границе. Немодифицированные мембраны были получены из раствора полимера без УЗ обработки. Для удаления растворителя образцы сушили в следующем режиме: 60°С – 4 ч, 80°С – 12 ч, затем при 110°С в вакуумном шкафу 4 ч. Полученные пленки аккуратно снимали со стеклянной поверхности и подвергали горячему прессованию под давлением 5 МПа при температуре 110°С в течение 3 мин для обеспечения лучшей прочности.

Для приведения к стандартным условиям все полученные образцы мембран кондиционировали по методике, описанной в работе [13], а затем переводили в K⁺-форму. Для этого их выдерживали в 2 М растворе KCl в течение 72 ч с последующей промывкой в деионизованной воде. Аналогичным образом осуществляли “регенерацию” мембран после длительного использования (до 3 мес.). Высокое сродство сульфокатионообменников к катионам K⁺ обеспечивало быструю и полную “регенерацию” образцов после контакта с многокомпонентными исследуемыми растворами. Между сериями повторных измерений (~100) мембраны сначала выдерживали в 0.1 М растворе KCl в течение 30 мин при постоянном перемешивании, затем помещали на хранение в деионизованную воду.

Методы исследования. Влагосодержание мембран определяли с помощью установки дифференциально-термического и термогравиметрического анализа “Thermoscan-2” (ООО “Аналитприбор”, Россия). Исследовали влагосодержание образцов в K⁺-форме после длительного контакта с водой, а также после их контакта в течение 48 ч с 0.1 М растворами аминокислот. Образцы предварительно нагревали в кварцевой кювете от 25 до 105°С со скоростью 5 град/мин. После этого их выдерживали в эксикаторе над насыщенным раствором Na₂HPO₄ (относительная влажность 95%) в течение 12 ч для сорбции воды, взвешивали для определения массы в набухшем состоянии (m", г), а затем нагревали до 105°С и взвешивали для определения массы в сухом состоянии (m, г). Влагосодержание (W, мас. %) мембран определяли по формуле:

Оценку отклика ПД-сенсоров выполняли с помощью многосекционной ячейки, описанной в [12]. Мембраны модифицированным концом контактировали с исследуемым раствором, а немодифицированным концом – с раствором сравнения (1 М KCl). Близость состава раствора сравнения и внутреннего раствора мембраны нивелировало потенциал Доннана на соответствующей границе. Расстояние между раствором сравнения и исследуемым раствором соответствовало длине мембраны, что устраняло трансмембранный перенос в процессе измерения отклика и минимизировало диффузионный потенциал. С помощью многоканального потенциометра и набора хлоридсеребряных электродов ЭСр-10103 (ООО “Эконикс-эксперт”, Россия) измеряли напряжение нескольких цепей вида (2).

(2)

Технологические растворы при получении аминокислот содержат катионы K⁺ и продукты диссоциации воды. Аналитами для систем ПД-сенсоров выступают катионы K⁺ и аминокислоты в анионной и цвиттер-ионной формах. Для получения градуировочных зависимостей устанавливали значения отклика ПД-сенсоров в растворах с заданными концентрациями аналитов, а значения рН контролировали с помощью стеклянного электрода ЭС-10301/4 (ООО “Эконикс-эксперт”, Россия). Зависимость отклика ПД-сенсоров (∆φ_D, мВ) от отрицательного логарифма концентрации катионов K⁺ (рK), суммарной концентрации анионов и цвиттер-ионов аминокислот (pA) и рН имела линейный вид (3) в диапазоне концентраций аналитов 1.0 × 10^–4–5.0 × 10^–2 М. Разность между экспериментальными значениями откликов и значениями откликов, предсказываемыми по градуировочным уравнениям, составляла 3–5 мВ.

Дисперсию воспроизводимости (мВ²) отклика ПД-сенсора рассчитывали как среднее значение дисперсии отклика для матрицы градуировочных растворов. Для оценки времени установления отклика ПД-сенсоров и его дрейфа регистрировали хронопотенциометрические зависимости в растворах с эквимолярным содержанием аминокислот и KOH в течение 1 ч. Время, начиная с которого изменение значений отклика не превышало их разброс при дублировании эксперимента, считали временем установления отклика. Изменение значения отклика в единицу времени (мВ/ч) после установления квазиравновесия считали дрейфом отклика.

В массивы объединяли пары ПД-сенсоров с наименьшей корреляцией между откликами. Концентрацию катионов K⁺ и суммарную концентрацию анионной и цвиттер-ионной форм аминокислоты в исследуемых растворах рассчитывали, решая систему из двух градуировочных уравнений с учетом экспериментальных значений отклика ПД-сенсоров и рН растворов. Для оценки правильности определения аналитов рассчитывали относительную погрешность (δ, %) как относительное отличие установленных и теоретических значений концентраций. Для оценки воспроизводимости определения аналитов рассчитывали относительное стандартное отклонение (s_r, %).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Зависимости отклика ПД-сенсора от времени имели сходный вид для всех исследуемых систем. В качестве примера представлено изменение отклика ПД-сенсора на основе мембраны МФ-4СК/1.0 мас. % УНТ-COO^– в течение часа контакта с растворами, содержащими 5.0 × 10^–3 М аминокислот и KОН (рис. 1). Время установления отклика ПД-сенсоров на основе исходной и модифицированных мембран не превышало 1 мин, а дрейф был незначим. Значения дисперсии воспроизводимости отклика составили 10–26 мВ².

Рис. 1.

Зависимость отклика ПД-сенсора в растворах Ala + KOH (а), Val + KOH (б), Phe + KOH (в) от времени.

Для всех исследуемых образцов наблюдалась высокая чувствительность ПД-сенсоров к катионам K⁺ (57.1–77.8 мВ/рс, рис. 2) и существенно более низкая чувствительность к цвиттер-ионам и анионам аминокислот (7.2–24.1 мВ/рс, рис. 2), что обусловлено катионообменной природой мембраны МФ-4СК. Причиной значимого влияния концентрации аминокислот на отклик ПД-сенсоров на основе катионообменных мембран является смещение равновесия их ионных форм в сторону образования цвиттер-ионов в фазе мембраны вследствие доннановского исключения анионов гидроксила, обусловливающего снижение рН внутрипорового раствора на ~2 единицы по сравнению с рН внешнего раствора [19]. Положительно заряженная аминогруппа в структуре аминокислот способна к электростатическому взаимодействию и образованию водородных связей с сульфогруппами мембраны. Кроме того, не исключено формирование водородных связей между карбоксильными группами аминокислоты и гидратными оболочками противоионов, участвующих в формировании двойного электрического слоя с фиксированными группами мембраны. Различие рН внешнего и внутрипорового раствора, а также протекание реакций протонирования/депротонирования в исследуемых системах приводит к значимой чувствительности ПД-сенсоров к продуктам диссоциации воды (11.4–20.4 мВ/рН, рис. 2). Для анализа щелочных растворов влияние рН на отклик ПД-сенсора не является такой существенной проблемой, как для анализа растворов при рН ≤ 7, и может быть учтено при определении ключевых компонентов посредством контроля рН объекта анализа и введения соответствующего слагаемого (b₂pH) в градуировочные уравнения.

Рис. 2.

Зависимость коэффициентов чувствительности ПД-сенсоров к ионам в растворах Ala + KOH (а), Val + KOH (б), Phe + KOH (в) от концентрации УНТ-COO^– в мембране МФ-4СК.

Значения чувствительности ПД-сенсора на основе немодифицированной мембраны МФ-4СК, как к катионам K⁺, так и к ионам аминокислот возрастают с увеличением размера и гидрофобности аминокислот в ряду Ala < Val < Phe (рис. 2). Введение в мембрану наночастиц УНТ-COO^– и увеличение их концентрации приводит к некоторому росту чувствительности ПД-сенсоров к ионам K⁺ и Ala^± в растворах Ala + KOH (рис. 2а), немонотонному изменению чувствительности к ионам K⁺ и Val^± в растворах Val + KOH (рис. 2б) и существенному снижению чувствительности ПД‑сенсоров к ионам K⁺ и Phe^± в растворах Phe + + KOH (рис. 2в).

Причинами различий в поведении ПД-сенсоров с разными материалами и аналитами могут быть изменения микроструктуры мембран в результате модификации и влияние сорбции органических аналитов.

Введение небольших количеств (0.5–1.0 мас. %) УНТ-COO^– приводит к некоторому увеличению по сравнению с исходным образцом влагосодержания (от 16.9 до 17.4 мас. %), ионной проводимости (от 1.12 × 10^–2 до 1.61 × 10^–2 Ом^–1 см^–1 при 30°С) и диффузионной проницаемости мембран (от 1.8 × 10^–8 до 2.5 × 10^–8 см²/с для 0.1 М раствора KCl) [13]. Значения приведены для мембран в K⁺‑форме в контакте с водой. Одной из причин изменения свойств мембран является предварительная УЗ обработка раствора полимера и допанта перед отливкой модифицированных образцов, которая уменьшает степень агломерации и среднюю молекулярную массу макромолекул перфторсульфополимера (в результате отрыва боковых цепочек полимера) и увеличивает подвижность отдельных звеньев. Результатом является формирование более развитой микроструктуры и разветвленной системы пор и каналов мембран [20], а их ИОЕ несколько снижается (до 0.97–0.98 ммоль/г по сравнению с 1.00 ммоль/г для немодифицированной мембраны, полученной из раствора полимера без УЗ обработки). Ввиду своей природы наночастицы УНТ преимущественно располагаются в гидрофобной фазе. В то же время наличие на поверхности допанта функциональных групп, заряженных одноименно с фиксированными группами мембраны, способствует частичному расположению допанта в гидрофильных порах и некоторому их расширению [21].

Образцы МФ-4СК и МФ-4СК/1.0 мас. % УНТ-COO^–, приведенные в равновесие с растворами гидрофобной алифатической аминокислоты Ala^±, имеют более высокое влагосодержание, чем те же образцы в K⁺-форме, а влагосодержание мембран, приведенных в равновесие с растворами гидрофобной ароматической аминокислоты Phe^±, снижается (рис. 3). Видимо, цвиттер-ионы алифатической аминокислоты встраиваются в двойной электрический слой, сформированный сульфогруппами мембраны и катионами K⁺, что приводит к удалению друг от друга фиксированных групп и расширению пор (рис. 4). Теория ограниченной эластичности стенок пор перфтормембран [22], позволяет предположить, что сорбция аминокислот на поверхности допанта также может способствовать расширению пор. Вследствие этого доступность сульфогрупп мембраны повышается, как для катионов K⁺, так и для цвиттер-ионов аминокислоты, обеспечивая рост чувствительности ПД-сенсоров к ним с ростом концентрации допанта. Сорбция цвиттер-ионов ароматической аминокислоты способствует вытеснению воды из пор мембраны (рис. 3). Это, с одной стороны, повышает их концентрацию в мембране, обеспечивая более высокую чувствительность к ним, чем к алифатическим аминокислотам при использовании немодифицированного образца. С другой стороны, присутствие объемных цветтр-ионов фенилаланина в мембране и их закрепление на поверхности допанта может приводить к блокировке пор. Вследствие этого при введении и увеличении концентрации наночастиц УНТ-COO^– наблюдается существенное снижение чувствительности ПД-сенсоров к ионам K⁺ и Phe^± в растворах Phe + KOH.

Рис. 3.

Отношение значений влагосодержания мембран, приведенных в равновесие с растворами Ala^± и Phe^±, (W, %) и влагосодержания мембран в K⁺-форме (W_K, %).

Рис. 4.

Схемы взаимодействия цвиттер-ионов аминокислот с функциональными группами мембраны.

Таким образом, введение частиц УНТ-COO^– в мембрану может оказывать, как положительное, так и отрицательное влияние на чувствительность ПД-сенсоров к анионам и цвиттер-ионам аминокислот в зависимости от их природы. В то же время для организации мультисенсорной системы принципиально важным является различное распределение чувствительности к аналитам разного типа (катионам K⁺ и ионным формам аминокислот), которое обусловливает необходимое для их совместного определения снижение корреляции между откликами ПД-сенсоров. Поскольку модификация мембран обеспечила отличную от исходных значений (для немодифицированного образца) перекрестную чувствительность ПД-сенсоров к ионам в растворах Ala + KOH, Val + KOH, Phe + KOH, это позволило сформировать массивы ПД-сенсоров для совместного определения ионов аминокислот и K⁺ в водных растворах в диапазоне концентраций от 1.0 × 10^–4 до 5.0 × 10^–2 М при рН от 8 до 10. Для определения ионов Ala^–, Ala^±, Phe^–, Phe^± и K⁺ были выбраны ПД-сенсоры на основе мембран МФ-4СК и МФ-4СК/1.0 мас. % УНТ-COO^–, а для определения Val^–, Val^±, K⁺ – МФ-4СК/ 0.5 мас. % УНТ-COO^– и МФ-4СК/1.0 мас. % УНТ-COO^– (табл. 1–3). Относительная погрешность определения анионов и цвиттер-ионов аланина (5–15%), валина (0.3–10%) и фенилаланина (0.7–5%) в исследуемых растворах с помощью выбранных образцов мембран соизмерима с таковой для катионов K⁺ (1.4–11%).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методом отливки получены перфторированные сульфокатионообменные мембраны МФ-4СК, содержащие углеродные нанотрубки, поверхностно модифицированные карбоксильными группами. Установлены характеристики перекрестно чувствительных ПД-сенсоров на основе полученных мембран, а также исходного образца в растворах, содержащих щелочь и гидрофобные аминокислоты аланин, валин и фенилаланин в анионной и цвиттер-ионной формах в диапазоне концентраций от 1.0 × 10^–4 до 5.0 × 10^–2 М. Выявлено различное влияние присутствия и концентрации наночастиц УНТ-COO^– в мембране на чувствительность ПД-сенсоров к ионам алифатических и ароматической аминокислот. Причинами являются изменение микроструктуры мембран в результате модификации и появление новых реакционных центров, изменяющие условия необменной сорбции органических частиц разного размера. В зависимости от природы аминокислот их сорбция оказывает противоположное действие на влагосодержание мембран. Для совместного определения анионов, цвиттер-ионов аминокислот и катионов K⁺ разработаны мультисенсорные системы на основе исходной мембраны МФ-4СК и мембраны, содержащей 0.5 или 1.0 мас. % наночастиц УНТ-COO^–. Достигнуты соизмеримые характеристики определения ионных форм аминокислот и катионов K⁺ в исследуемых растворах. Предложенный способ не требует коррекции рН объекта анализа в диапазоне значений от 8 до 10.

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации, грант № МД-5732.2021.1.3 (The work was supported by the grant of the President of the Russian Federation, grant number MD-5732.2021.1.3).