Микробиология, 2019, T. 88, № 3, стр. 367-371

В последние годы произошли значительные изменения в представлениях о микроорганизмах и микробных сообществах, осуществляющих процессы окисления метана в морских и пресных водоемах. Ранее считалось, что в пресных водоемах основными окислителями метана являются аэробные метанотрофные протеобактерии I и II типа, имеющие метанмонооксигеназу (ММО) – ферментный комплекс, катализирующий ключевую реакцию окисления метана кислородом до метанола. Затем, около 20 лет назад появились первые прямые доказательства существования процесса анаэробного окисления метана (АОМ), сопряженного с сульфатредукцией (Boetius et al., 2000; Knittel, Boetius, 2009), происходящего при участии консорциума метанотрофных архей и сульфатредуцирующих бактерий. Позднее выяснилось, что в отсутствии сульфатов акцептором электронов при АОМ может быть нитрат, нитрит, а также окисленные формы Fe и Mn (Beal et al., 2009; Haron et al., 2013; Ettwig et al., 2016). В последнее десятилетие появились исследования, существенно меняющие представления о метаболических возможностях метанотрофных бактерий. Например, установлено, что в отсутствии кислорода бактерии Ca. “Methylomirabilis oxyfera” (группа NC10) осуществляют нитрит-зависимое анаэробное окисление метана по “внутриаэробному” пути, при котором внутри бактериальной клетки при диспропорционировании NO происходит высвобождение молекулярного кислорода, который затем расходуется на окисление метана с участием ММО и дыхание (Ettwig et al., 2010). Совсем недавно появились сообщения о том, что метанотрофные гаммапротеобактерии (тип I), которые ранее считались строгими аэробами, способными сохранять активность в гипоксидных и даже анаэробных условиях (Chistoserdova, 2015). Одно из объяснений сохранения активности метанотрофных гаммапротеобактерий в гипоксидных условиях связано с предположением о формировании трофической взаимосвязи между аэробными метанотрофами и оксигенными фототрофами. Образованный фототрофами кислород немедленно подхватывается метанотрофами для окисления метана (Milucka et al., 2015; Oswald et al., 2015). Процесс светозависимого метанокисления был экспериментально подтвержден в стратифицированных пресноводных озерах Кадано, Ротзее (Швейцария), Ла Круз (Milucka et al., 2015; Oswald et al., 2015, 2016), а также в наших работах по изучению пресноводного меромиктического оз. Светлое в Архангельской области (Кallistova et al., 2019). У нижней границы редокс зоны, где кислород аналитически не выявлялся, радиоизотопным методом была выявлена стимуляция светом процесса окисления метана, а также детектировано одновременное присутствие в этой зоне аэробных метанотрофов рода Methylobacter, метилотрофов рода Methylotenera и цианобактерий родов Synechococcus и Prochlorococcus. Таким образом, значительный прогресс в изучении механизмов окисления метана в гипоксидных и анаэробных условиях связан с изучением стратифицированных/меромиктических водоемов, в водной толще которых на границе аэробных и анаэробных вод развиваются сложные микробные сообщества, часто формирующие многоуровневые трофические связи.

Объектом исследования процессов окисления метана было полярное меромиктическое озеро Большие Хрусломены, расположенное на побережье Кандалакшского залива Белого моря (Краснова и cоавт., 2018). Важной особенностью озера является постоянное поступление морских вод через проницаемые породы, вследствие чего ниже хемоклина происходит значительное нарастание солености (до 22‰ в придонных горизонтах). Отбор образцов воды проводили в начале сентября 2017 г. с борта маломерного судна погружным насосом (координаты точки пробоотбора 66°42′59′′ N, 32°51′29′′ E), позволяющим с высоким разрешением (до 5–10 см) отбирать требуемые горизонты водной толщи (рис. 1). Соленость и температуру измеряли погружным зондом, содержание кислорода в водной толщe озера определяли методом Винклера, сероводорода – калориметрически, метана – газохоматографическим методом по методикам, описанным ранее (Savvichev et al., 2018). Озеро, глубиной около 18 м, характеризовалось четко выраженной стратификацией, наличием хемо- и галоклина на глубине 2–4 м (рис. 2а). Температура воды в озере в период пробоотбора изменялась от 7.3 до 13.5°С, причем температурный максимум располагался в хемоклине на глубине 3.5–3.75 м (рис. 2а). Содержание кислорода в этом интервале глубин падало от 0.7 ммоль л^–1 на глубине 2 м до 2.5 мкмоль л^–1 на глубине 4 м. Сероводород появлялся на глубине 4 м, и в придонных горизонтах его концентрация составляла 17.8 ммоль л^–1 (рис. 2а). Наряду с высоким содержанием Н₂S в толще гиполимниона наблюдались также и экстремально высокие концентрации метана (до 1.8 ммоль л^–1 на глубине 18 м). В интервале глубин 3.75–5.5 м происходило резкое снижение содержания метана до величин 0.04–1.13 мкмоль л^–1 в аэробной зоне (0–3.5 м). Скорости темновой и световой ассимиляции углекислоты, необходимые для получения профиля фотосинтеза, а также эксперименты по определению влияния света на интенсивность окисления метана проводили радиоизотопным методом с использованием NaH¹⁴CO₃ (специфическая активность 2.04 ГБк ммоль^–1, 5 мкКю на пробу) и ¹⁴CH₄ (2 мкКю на пробу, специфическая активность 1.16 ГБк ммоль^–1) по методике, описанной ранее (Kallistova et al., 2019).

Рис. 1.

Схема расположения озера Большие Хрусломены.

Рис. 2.

Физико-химические параметры (а), интенсивность первичной продукции (ПП) (б), скорости окисления метана на свету (С-МО) и в темноте (Т-МО) (в) и доля (%) последовательностей 16S рРНК цианобактерий и метанотрофных гаммапротеобактерий в сравнении со скоростью метанокисления на свету и в темноте в хемоклине озера Большие Хрусломены (г).

В эпилимнионе (0–2 м) интенсивность оксигенного фотосинтеза составляла 0.7−1.7 мкмоль С л^–1 сут^–1, в зоне хемоклина (2.5–3.75 м) – 0.2–1.0 мкмоль С л^–1 сут^–1. На глубине 4.0 м активность фотосинтеза снижалась почти до нулевого значения. Немного ниже границы аэробной и анаэробной зон обнаружен узкий слой с высокой активностью аноксигенного фотосинтеза (АнФС). Максимальная интенсивность АнФС приходилась на горизонт 4.25 м (34 мкмоль С л^–1 сут^–1). При дальнейшем погружении в слой гиполимниона, по-видимому, из-за недостатка света, интенсивность фотосинтеза резко падала до 2.4–10 мкмоль С л^–1 сут^–1 в интервале глубин 4.5–4.75 м и 0.13 мкмоль С л^–1 сут^–1 на глубине 5.25 м.

Профиль распределения скоростей окисления метана свидетельствовал о протекании интенсивных процессов в узком интервале глубин 3.75–4.75 м (на свету до 0.17 мкмоль л^–1 сут^–1), причем нам удалось обнаружить заметную стимуляцию светом этого процесса (рис. 2в). Зона, где наблюдалось выраженное светозависимое окисление метана, соответствовала нижней границе проникновения кислорода.

Состав микробных сообществ в зоне хемоклина определяли с помощью высокопроизводительного секвенирования вариабельных участков V3−V6 гена 16S рРНК. Для этого клетки микроорганизмов из образцов воды объемом 100 мл, отобранных с трех глубин 3.75, 4 и 4.25 м, концентрировали на фильтрах с диаметром пор 0.22 мкм. Выделение ДНК, амплификацию, секвенирование, анализ фрагментов гена 16S рРНК, кластеризацию последовательностей в оперативные таксономические единицы (ОТЕ), удаление химерных последовательностей и таксономическую идентификацию ОТЕ проводили по методикам, описанным ранее (Кадников и соавт., 2016). Для образцов воды с глубин 3.75, 4 и 4.25 м, было получено 3086, 4600 и 7517 последовательностей соответственно. Полученные нуклеотидные последовательности депонированы в GenBank под номерами SRR8480614–SRR8480616.

Анализ последовательностей генов 16S рРНК выявил в интервале глубин 3.75–4.0 м последовательности, принадлежащие метанотрофным гаммапротеобактериям Methyloprofundus sedimenti семейства Methylococcaceae (100% сходства), доля которых достигала 2.5% от общего количества определенных последовательностей. Эти морские метанокисляющие бактерии, выделенные из поверхностных осадочных отложений каньона Монтерей у побережья Калифорнии (Tavormina et al., 2015), имеют высокое сходство гена 16S рРНК (98%) с некультивируемыми свободно живущими и эндосимбионтными метанотрофами водной толщи, донных осадков и жаберных тканей глубоководных моллюсков, а также с метанотрофами рода Methylobacter (94.6% сходства). Цианобактерии порядка Synechococcales составляли значительную долю сообщества прокариот в аэробной зоне (до 10%). Глубже 3 м их доля снижалась, но в зоне максимальной скорости светозависимого окисления метана (на глубине 3.75 м) доли цианобактерий и метанотрофов в сообществе были близки и составляли около 2.5% (рис. 2г). Результаты радиоизотопных экспериментов в сочетании с молекулярным анализом позволяют рассматривать солоноватоводное полярное меромиктическое оз. Б. Хрусломены в качестве еще одного примера существования в зоне хемоклина светозависимого окисления метана, осуществляемого метанотрофными гаммапротеобактериями в ассоциации с цианобактериями. Следует отметить, что до сих пор светозависимое окисление метана наблюдали исключительно в пресных меромиктических озерах различных климатических зон (Milucka et al., 2015; Oswald et al., 2015, 2016; Kallistova et al., 2019), где в гипоксидных условиях доминировали метанотрофные гаммапротеобактерии. В проницаемом для морских вод озере Б. Хрусломены в зоне хемоклина соленость была примерно в три раза ниже морской воды. Видимо, поэтому, в отличие от пресного меромиктического озера Светлое (соленость в хемоклине около 0.34‰), где преобладали метанотрофы рода Мethylobacter, в хемоклине оз. Б. Хрусломены максимальные скорости окисления метана были выявлены в горизонтах с доминированием среди метанотрофов типичных морских метанокисляющих бактерий рода Methyloprofundus, как и Мethylobacter входящих в семейство Methylococcaceae.

Проникновение морских вод, обогащенных сульфат-ионом, в оз. Б. Хрусломены, последствием которого являются наблюдаемые экстремально высокие концентрации сероводорода, предполагало возможность существования в анаэробном монимолимнионе процесса сульфат-зависимого окисления метана. Однако нам не удалось выявить последовательности 16S рРНК ANME архей. Бактерии группы NC10, окисляющие метан нитритом, также не были обнаружены.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что светозависимое окисление метана не ограничивается только пресными стратифицированными озерами, но может вносить существенный вклад в процессы окисления этого важнейшего парникового газа в солоноватоводных континентальных и мелководных стратифицированных морских водоемах.