Микробиология, 2019, T. 88, № 6, стр. 695-704

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Объектами исследования были микробные сообщества, выделенные из образцов почв оазисов Восточной Антарктиды, Арктики, дерново-подзолистой почвы (горизонт А1) из лесопарковой зоны Подмосковья и сероземов (горизонт А) из района Хайдарканского ртутного месторождения (табл. 1).

Образцы почв Восточной Антарктиды отобра-ны сотрудниками Института географии РАН к. г. н. Н.С. Мергеловым и к. г. н. А.В. Долгих в период 56-ой и 58-ой Российских антарктических экспедиций в районе оазисов Холмы Ларсеманн и Холмы Тала. Образцы почв Арктики были отобраны в ходе комплексной экспедиции “Мониторинговые исследования среды обитания человека в полярных регионах” (переданы В.С. Крыленковым) на островах Земля Визе, Северный (Новая Земля) и Хейса (Земля Франца-Иосифа), а также на морене ледника Альдегонда острова Западный Шпицберген (переданы Н.С. Мергеловым). Образцы дерново-подзолистой почвы были получены с кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Сероземы в районе Хайдарканского ртутного месторождения были отобраны чл.-корр. РАН Р.Б. Хесиным в мае 1983 г (Khesin, Karasyova, 1984).

Использованные штаммы и условия культивирования. В работе были использованы только изоляты грамотрицательных бактерий, поскольку для них легче стандартизовать процедуру тестирования устойчивости к АБ. Из образцов почв Восточной Антарктики нами были выделены 53 штамма, из тундровых арктических почв – 20, из дерново-подзолистых почв Подмосковья – 21 штамм, из почв района Хайдарканского ртутного месторождения – 33 штамма, формирующих, соответственно, 4 коллекции. Чтобы избежать изменений генотипа и биохимического статуса, которые могут происходить в ходе последовательных пересевов культур в лаборатории и, в частности, приводить к изменению антибиотикоустойчивости, все штаммы сразу после выделения в чистую культуру закладывали на длительное хранение. Штаммы из Антарктиды и Подмосковья были выделены в ходе работы и сразу же заложены на хранение под минеральное масло (Sambrook, Rassel, 2001). Штаммы из Арктики и Хайдаркана были ранее выделены в ИМГ РАН и сразу после выделения лиофилизированы. Для культивирования изолятов использовали бульон Лурия-Бертани (LB) (Sambrook, Russel, 2001), а также LB с добавлением 1.8% агара (LA). Все штаммы выращивали при 30°С.

Определение спектра устойчивости. Опыты по определению спектра устойчивости штаммов к различным АБ проводили с помощью матрицы на 50 лунок. В качестве положительных/отрицательных контролей в опытах по определению спектра устойчивости к АБ были использованы ранее охарактеризованные штаммы (табл. 2). Использовали только свежие (суточные) культуры. В каждую лунку матрицы вносили 100 мкл LB и с помощью стерильной зубочистки суспендировали один из тестируемых или контрольных штаммов. После заполнения всех лунок с помощью специального инокулятора матрицу последовательно печатали на чашки Петри со средой LА без АБ (для контроля роста каждого штамма) и с одним из антибиотиков различных классов в следующих концентрациях (мкг/мл): 1) аминогликозиды: стрептомицин (Str) – 50–100, канамицин (Km) – 25–50, спектиномицин (Sp) – 50–100; 2) тетрациклины: тетрациклин (Tc) – 10; 3) производные нитробензола: хлорамфеникол (левомицитин) (Cm) – 20; 4) β-лактамы: ампициллин (Ap) – 100–200; 5) хинолоны – налидиксовая кислота (Nal) – 20. Концентрации АБ были подобраны ранее экспериментальным путем как наиболее оптимальные для выявления бактерий, устойчивых к данным АБ (Petrova et al., 2009). Чашки инкубировали 1 сут при 30°С, после чего оценивали устойчивость каждого штамма по сравнению с отрицательным и положительными контролями и его ростом на среде без АБ. Вывод о спектре устойчивости штаммов к АБ делали на основании трех (и более при необходимости) независимых опытов. Устойчивость ряда штаммов была дополнительно проверена с помощью рассевов на чашках с АБ при сравнении с контрольными устойчивыми и чувствительными штаммами.

Штаммы из Хайдарканского ртутного месторождения дополнительно проверяли на устойчивость к ртути (HgCl₂, 5 мкг/мл).

Идентификация штаммов. Выборочно до рода были идентифицированы по 1–3 штамма с каждым типом спектра антибиотикоустойчивости (табл. 3) из каждой коллекции. Идентификацию проводили на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК штаммов. Геномную ДНК из бактериальных клеток выделяли c помощью набора GeneJET Genomic DNA Purification Kit (“Thermo Scientific”), следуя рекомендациям производителя. Для амплификации гена 16S рРНК использовали универсальные консервативные праймеры прокариот 63F и 1387R (Lane, 1991). ПЦР проводили в режиме: 1) 95°С – 4 мин, 2) 30 циклов с чередованием температурных интервалов: 95°С – 1 мин, 55°С – 1 мин, 72°С – 1 мин 30 с, 3) 72°С – 5 мин. Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 0.9% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. ПЦР-продукты очищали на колонках с помощью готового набора GeneJET PCR Purification Kit (“Thermo Scientific”). Секвенирование очищенных фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе в ЦКП “Геном” (Институт молекулярной биологии РАН). Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК анализировали с использованием программ онлайн программ BLAST (Altschul et al., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При обсуждении проблемы исследования фоновой (базовой) устойчивости к АБ в литературе дискутируется вопрос, где отбирать образцы для ее определения. Естественно, что наиболее оптимальными являются районы, для которых документально подтверждено отсутствие каких-либо загрязнений на протяжении хотя бы нескольких последних десятков лет. Однако чаще всего бывает необходимо определять базовую устойчивость для районов, где почвы активно используются человеком, но в таких местах найти чистую почву для исследования нередко бывает невозможно. Поэтому очень трудно разграничить устойчивость, являющуюся результатом антропогенного воздействия, от колебаний природной резистентности, которая может зависеть от естественной неоднородности и пространственной динамики устойчивых к АБ бактерий в различных почвах (Durso et al., 2018). В настоящей работе были проведены сравнительные исследования спектров устойчивости к выбранным нами АБ и частоты распространения антибиотикоустойчивых штаммов почвенных бактерий, выделенных из незагрязненных мест, а также биотопов с небольшой антропогенной нагрузкой. Под небольшой антропогенной нагрузкой подразумевается невысокая посещаемость людьми и животными мест отбора проб и отсутствие явного промышленного и сельскохозяйственного загрязнения. Кроме того, были исследованы такие места, где помимо небольшой антропогенной нагрузки наблюдается повышенное естественное содержание ртути. Такие биотопы были выбраны нами в связи с тем, что в клинике часто гены устойчивости к ртути и гены резистентности к различным АБ входят в состав одних и тех же мобильных элементов (R‑плазмид и транспозонов группы Tn21). Кроме того, было показано, что в городских почвах увеличение содержания тяжелых металлов приводит к росту содержания генов устойчивости к различным АБ за счет горизонтального переноса мобильных элементов, содержащих оба типа детерминант резистентности (Zhao et al., 2019). Таким образом, при cелективном давлении, вызванном повышенным содержанием ртути, могут одновременно отбираться бактерии, устойчивые как к ртути, так и к АБ. Мы ограничились исследованием только грамотрицательных бактерий, поскольку их рост обычно ингибируют сходные концентрации различных АБ, тогда как для грамположительных бактерий ингибирующие концентрации могут сильно варьировать, что затрудняет массовый анализ.

Во всех исследованных биотопах обнаружены штаммы, обладающие устойчивостью к одному или более из использовавшихся природных (то есть не синтетических) АБ, за исключением тетрациклина, устойчивость к которому проявил лишь один штамм из Антарктиды (рис. 1). Следует отметить, что в 98 из 100 исследованных образцов почв Небраски, которые рассматривали как чистые, были обнаружены гены устойчивости к тетрациклину. Кроме того, ни один из исследованных нами штаммов не проявил устойчивости к налидиксовой кислоте, которая является синтетическим антибактериальным препаратом. Возможно, причиной этого является искусственное происхождение данного АБ, однако в ряде работ в относительно чистых почвах обнаруживали присутствие генов устойчивости к сульфаниламиду, который также является синтетическим препаратом (Durso et al., 2016; Hayward et al., 2018). У исследованных в данной работе штаммов бактерий наиболее распространена устойчивость к ампициллину. Далее по степени убывания встречаемости идут устойчивости к спектиномицину, левомицетину, стрептомицину и на последнем месте, как уже было сказано выше, к тетрациклину. Сходная закономерность была отмечена при исследовании спектров устойчивости к АБ грамотрицательных бактерий, выделенных из многолетнемерзлых отложений (Миндлин и соавт., 2008), и при анализе метагеномов антарктических почв, в которых было выявлено присутствие генов устойчивости к аминогликозидам, хлорамфениколу и бета-лактамным АБ (Van Goethem et al., 2018).

Рис. 1.

Устойчивость выделенных штаммов к использованным АБ. Цифрами на диаграммах указано число резистентных штаммов к каждому из АБ в разных биотопах. Обозначения антибиотиков как в табл. 2.

Во всех выборках около трети штаммов обладали устойчивостью к одному АБ, а чувствительные штаммы также составляли приблизительно треть от общего числа в почвах полярных областей и чуть больше в образцах дерново-подзолистой почвы и сероземов в районе Хайдарканского рудника (табл. 3). На диаграмме (рис. 2) видно, что штаммы из почв полярных областей обладали более широким спектром устойчивости, по сравнению со штаммами из дерново-подзолистых почв и сероземов. Причем в коллекции антарктических штаммов с устойчивостью к трем различным АБ было обнаружено больше штаммов, чем в коллекции из арктических почв. Таким образом, устойчивость к АБ штаммов бактерий, обитающих в нетронутых почвах, отличающихся суровыми климатическими условиями формирования, оказалась чуть выше, чем у штаммов, выделенных из почвы, подверженной слабому антропогенному воздействию, умеренной климатической зоны и почв вблизи ртутного рудника.

Рис. 2.

Количество изолятов, обладающих разными спектрами устойчивости к АБ в коллекциях из разных биотопов. Цифрами около каждого из столбцов на диаграммах указано число изолятов, обладающих устойчивостью к одному, двум, трем или четырем АБ или чувствительных ко всем АБ.

Интересен следующий факт. При том, что 29 из 33 хайдарканских штаммов были устойчивы к сулеме, наличие ртути в почве не привело к увеличению устойчивости к АБ обитающих в ней штаммов, в отличие от городских почв, в которых повышение содержания тяжелых металлов, и в частности ртути, приводило к увеличению количества копий и разнообразия генов устойчивости к АБ (Zhao et al., 2019). Из этого следует, что детерминанты устойчивости и генетические структуры, в состав которых они входят, в биотопах, подвергающихся сильному антропогенному воздействию или не подвергающихся таковому, могут сильно различаться. Косвенные данные о том, что в “чистых” природных популяциях, в отличие от популяций из “загрязненных” почв и клиники, гены устойчивости к АБ не сцеплены с мобильными элементами, были получены и при исследовании образцов почв Восточной Антарктиды (Van Goethem et al., 2018). В цикле работ по изучению молекулярно-генетической структуры детерминант устойчивости к АБ и ртути у бактерий из вечной мерзлоты было показано, что у них, в отличие от “клинических” детерминант, преобладают простые мобильные элементы, содержащие устойчивость только к одному АБ или ртути (Миндлин, Петрова, 2017).

Полученные данные свидетельствуют о том, что штаммы бактерий из чистых почв полярных областей обладают множественной устойчивостью к АБ, сходной с резистентностью изолятов из почв с низким антропогенным воздействием или с повышенным содержанием ртути. Таким образом, наличие множественной устойчивости к АБ не является исключительно реакцией на антропогенное загрязнение. Вероятно, в “чистых” биотопах, формирующихся в экстремально холодных условиях, устойчивость связана в большей степени с так называемой врожденной устойчивостью, которая обусловлена, например, характерным для конкретной систематической группы строением клеточной стенки, препятствующей проникновению АБ в клетку и/или наличием различных неспецифических систем выброса токсичных для клетки веществ.

Тот факт, что спектры устойчивости антарктических штаммов были шире спектров штаммов из Хайдаркана, может быть связан с тем, что штаммы из Антарктиды вообще могут проявлять высокую степень толерантности к различным стрессам в силу постоянного внешнего воздействия экстремальных условий: низкой влажности, высокого уровня УФ облучения, постоянных колебаний температуры. Наиболее вероятно, что в данном случае устойчивость к АБ не обусловлена наличием специфических генов устойчивости, а возникает за счет неспецифических механизмов, связанных с изменением протекания биохимических процессов в клетке в целом. Кроме того, можно предположить, что при наличии высоких концентраций ртути, которые характерны для Хайдарканского месторождения, отбираются бактерии тех систематических групп, которые не обладают врожденной устойчивостью к АБ. Следует подчеркнуть, что у клинических штаммов как раз устойчивость к ртути часто бывает сцеплена с множественной лекарственной устойчивостью, поскольку все детерминанты входят в состав одних и тех же мобильных элементов, обеспечивающих их распространение.

Обращает на себя внимание тот факт, что среди штаммов с множественной устойчивостью были выявлены различные типы спектров устойчивости к АБ (табл. 3). Причем некоторые спектры устойчивости были обнаружены в разных биотопах. Например, комбинация устойчивости “Ap, Sp” встречалась у бактерий, выделенных из всех 4-х местообитаний; спектры устойчивости “Ap, Lv” и “Ap, Lv, Sp” – у бактерий из трех биотопов; спектр “Ap, Sp, Str” – у бактерий из образцов антарктических почв, дерново-подзолистой почвы, и образцов серозема в районе Хайдарканского ртутного месторождения; спектр “Ap, Sp, Str, Km” – у бактерий из арктических и антарктических почв. Можно предположить, что эти спектры принадлежат типичным почвенным бактериям, обитающим в разных почвах. Кроме того, были выявлены уникальные спектры устойчивости к нескольким АБ у бактерий, выделенных из разных почв, например, “Km, Lv” и “Ap, Sp, Str, Km, Tc”.

Для проверки гипотезы о зависимости спектра устойчивости от систематической принадлежности данного бактериального штамма мы провели выборочную идентификацию штаммов с каждым типом спектра устойчивости из каждой экосистемы. Из рассмотрения табл. 4 следует, что штаммы с широкими спектрами устойчивости преимущественно относятся к родам, среди представителей которых широко распространена врожденная устойчивость: Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas. Причем псевдомонады преобладают среди изолятов с широкими спектрами. Известно, что псведомонады за счет низкого содержания поринов в клеточной мембране обладают устойчивостью к ампициллину (Delcour, 2009), что четко подтверждают и наши данные. Кроме того, псевдомонады обладают активными системами эффлюкса, что может обеспечивать устойчивость к АБ разных классов. Псевдомонады являются типичными обитателями различных почв, и именно к ним относятся штаммы с одинаковыми спектрами, обнаруженные во всех или в большинстве исследуемых биотопов. Системы эффлюкса имеются у многих грамотрицательных бактерий, чем, по-видимому, и обусловлена устойчивость штаммов, относящихся к таким родам, как Sphingomonas, Delftia, Ralstonia, Variovorax, Cytophaga, Bacteroides, Comamonas, Brevundimonas, Chryseobacterium. Следует отметить, что среди устойчивых одновременно к нескольким различным антибиотикам штаммов грамотрицательных бактерий, выделенных из образцов многолетнемерзлых отложений, также преобладали представители Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas (Mindlin et al., 2009).

Интересно, что представители рода Acinetobacter были обнаружены как среди чувствительных штаммов, так и среди изолятов и с узким, и с широким спектром устойчивости. При этом клинические штаммы, относящиеся к этому роду, славятся своими широчайшими спектрами устойчивости, часто также являющейся врожденной, по крайней мере, частично. Ряд почвенных псевдомонад также обладали весьма скромными спектрами устойчивости, по сравнению с клиническими штаммами. Эти факты еще раз свидетельствуют о том, что в клинике в условиях жесткого селективного отбора реализуются все потенциальные возможности, позволяющие бактериям выживать.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что бактерии из незагрязненных местообитаний могут обладать множественной устойчивостью к АБ. Изучение детерминант устойчивости к АБ бактерий, выделенных из почв, формирующихся в экстремальных климатических условиях практически в отсутствие антропогенного воздействия, позволит расширить представления о механизмах устойчивости природных штаммов к АБ и их эволюции. К аналогичному заключению пришли и авторы работы по исследованию разнообразия и структуры детерминант устойчивости к АБ в метагеномах нетронутых антарктических почв в районе ледника Маккай. Авторы предложили рассматривать антарктические почвы как “природный резервуар” генов устойчивости к АБ, сформировавшийся в отсутствии внешних антропогенных воздействий (Van Goethem et al., 2018).