Микробиология, 2019, T. 88, № 6, стр. 740-743

Анализ пигментного состава микробного сообщества по глубине водоема дает представление о распределении различных групп фотосинтезирующих микроорганизмов в слоях воды, что является важной характеристикой водоема, прямо связанной с происходящими в нем процессами продукции и деструкции органического вещества, влияющими, в целом, на всю водную экосистему. Особый интерес вызывает исследование аноксигенных фототрофных бактерий (АФБ), обитающих чаще всего в нижних бескислородных слоях меромиктических водоемов. Используемая методика была нами разработана для стратифицированных водоемов, отделяющихся от Белого моря, где в водной толще в сообществах АФБ доминируют зеленые серобактерии (ЗСБ) (Krasnova et al., 2015; Savvichev et al., 2018). Основными фотосинтетическими пигментами ЗСБ являются бактериохлорофиллы (Бхл) d и е. В слое воды с зелено- или коричнево-окрашенными ЗСБ могут в значительном количестве развиваться и пурпурные бактерии, содержащие в качестве основного пигмента Бхл а. При анализе природных проб нужно учитывать состав сообщества оксигенных и аноксигенных фотосинтетиков в исследуемом горизонте и, как следствие, состав пигментов в полученном экстракте. На сегодняшний день количественное определение бактериохлорофиллов в водных образцах проводят при помощи экстрагирования пигментов различными растворителями и детектирования спектров поглощения экстрактов. Для этого пробу воды объемом V фильтруют или центрифугируют; пигменты из клеток экстрагируют в органическом растворителе объема v (часто в ацетоне или ацетон-метанольной смеси), регистрируют спектры поглощения экстрактов и с помощью значений оптической плотности на определенных длинах волн проводят количественный расчет содержания пигментов по эмпирическим формулам. В табл. 1 приведены длины волн максимумов поглощения света пигментами в экстрактах для выделенных культур и проб воды из различных водоемов, отделяющихся от Белого моря. Если сообщество АФБ в водоеме представлено микроорганизмами с одним преобладающим типом пигмента (только пурпурные бактерии с Бхл а, только зелено-окрашенные зеленые серобактерии с Бхл d или только коричнево-окрашенные зеленые серобактерии с Бхл е), то концентрацию Бхл в экстракте можно рассчитать с помощью следующих из закона Бугера–Ламберта–Бера формул (Намсараев, 2009). В обобщенном виде формулу для расчета концентрации (С_Бхлx, мкг/л) преобладающего Бхл x (Бхл а, d или е) можно записать:

где D – оптическая плотность экстракта для кюветы длиной 1 см, k – удельный коэффициент поглощения экстракта в максимуме длинноволновой полосы поглощения Бхл x. Отметим, что значение k зависит от типа Бхл, от растворителя и от длины волны, на которой измеряется оптическая плотность (Намсараев, 2009).

Однако чаще в природной воде развиваются АФБ разного пигментного состава, и на определенных глубинах их клетки могут присутствовать одновременно. Из табл. 1 видно, что присутствие Бхл а не будет мешать определению Бхл d и е, поскольку пики поглощения Бхл а и Бхл d и е не перекрываются. Определение содержания Бхл d при совместном присутствии с хлорофиллом (Хл) а проводилось в работе (Overmann, Tilzer, 1989). Предпринимались попытки определения содержания Бхл d в присутствии нескольких Хл (Хл а, b и c) (Горбунов, Уманская, 2003). Отметим, что в слоях массового развития АФБ в отделяющихся водоемах Белого моря обычно отсутствуют хлорофилл-содержащие микроорганизмы (водоросли, цианобактерии). Формулы (Overmann, Tilzer, 1989) с определенными ограничениями могут применяться для определения суммарной концентрации Бхл (d + e) для водных горизонтов с разными типами ЗСБ, но при сильном доминировании зелено-окрашенных ЗСБ. Если же доля коричнево-окрашенного типа бактерий возрастает, и концентрации Бхл d и е становятся сопоставимы, расчеты по таким формулам не дают возможности корректно оценить вклад зеленых и коричнево-окрашенных ЗСБ в пробе из-за значительного отличия коэффициентов поглощения Бхл d и Бхл е. Для разделения вкладов Бхл d и Бхл е в природной воде можно использовать флуоресцентный анализ водных образцов (Kharcheva et al., 2016; Жильцова и соавт., 2018). Методика спектрофотометрического разделения Бхл d и е при их совместном присутствии отсутствует, и, насколько нам известно, попытки разделить эти два пигмента из смеси по спектрам поглощения экстрактов до сих пор не предпринимались.

Мы предлагаем методику разделения Бхл d и Бхл е с помощью анализа одновременно длинноволнового и коротковолновых пиков в спектрах поглощения экстрактов. Объектами исследования были пробы природной воды и монокультуры зеленых и коричневых ЗСБ, выделенные из оз. Большие Хрусломены (о. Олений, Губа Ковда, Кандалакшский залив, Белое море). В качестве эталонных образцов для моделирования различных соотношений Бхл d и Бхл е были взяты жидкие монокультуры зелено-окрашенного штамма GrKhr-17 и коричнево-окрашенного штамма BrKhr-17. Штаммы бактерий были выращены в анаэробных условиях в жидкой культуре во флаконах. Геномы этих штаммов отличались друг от друга только наличием или отсутствием кластера, кодирующего синтез коричневого каротиноида изорениератина и Бхл е, а клетки штаммов различались только составом пигментов (Grouzdev et al., 2019). В качестве экстрагирующей смеси применяли ацетон : метанол в пропорции 7 : 2, поскольку эта смесь наиболее полно экстрагирует не только Бхл, но и каротиноиды (Ruivo et al., 2014). Для приготовления эталонных образцов – экстрактов Бхл d или Бхл е – монокультуры зелено- и коричнево-окрашенного штаммов осаждали на фильтре и осадок экстрагировали в ацетон-метанольной смеси, при этом в образце с Бхл d отсутствовал Бхл е, а в образце с Бхл е отсутствовал Бхл d. Экстракты хранили в холодильнике в темноте и все манипуляции с ними проводили в затененном помещении. Измерение спектров оптической плотности экстрактов проводили на спектрофотометре Solar 2201 в спектральном диапазоне 200–900 нм в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см.

Мы использовали предположение об аддитивности вкладов Бхл d и е в суммарный спектр оптической плотности экстракта с коэффициентами, пропорциональными содержанию каждого пигмента. Для определения вкладов разных Бхл спектры поглощения экстрактов нормировали таким образом, чтобы оптическая плотность в максимуме длинноволнового пика составляла 1. Далее составляли последовательный ряд модельных спектров – суммы двух эталонных спектров с весами, изменяя доли компонентов от 0 до 1 с шагом 0.001. На рис. 1 показан нормированный спектр поглощения экстракта природной воды из оз. Б. Хрусломены (глубина 3.75 м) и пример его моделирования с помощью эталонных спектров. Сравнение модельного спектра с реальным спектром поглощения экстракта в коротковолновой области спектра от 400 до 500 нм позволило найти наилучшее соотношение пиков зелено-окрашенной (427 нм) и коричнево-окрашенной культуры (469 нм) и, соответственно, значения вкладов α_d и α_e для разных пигментов в спектр поглощения, при которых наблюдается наилучшее согласие по форме реального и модельного спектров экстрактов. Концентрации отдельно для Бхл d и Бхл е в исходных водных пробах рассчитывали по формулам:

где D₆₅₄ – значение оптической плотности экстракта в спектре без нормировки на длине волны 654 нм для кюветы длиной 1 см, α_d и α_e – относительные вклады Бхл d и Бхл е, найденные описанным выше способом. Коэффициент поглощения в длинноволновом пике Бхл e k_e = 49.6 л г^–1 см^–1 в ацетон-метанольной смеси (Borrego et al., 1999). Поскольку в научной литературе отсутствуют данные для коэффициента поглощения Бхл d в смеси ацетон : метанол, то мы считали, что он незначительно отличается от такового в ацетоне k_d = 98 л г^–1 см^–1 (Stanier, Smith, 1960; Montesinos et al., 1983). Разработанный метод позволяет показать соотношение зелено- и коричнево-окрашенных ЗСБ в природной воде при их совместном развитии с помощью измерения спектров поглощения экстрактов пигментов из взятой пробы.