Микробиология, 2022, T. 91, № 2, стр. 226-233

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы бактерий и бактериофагов и их культивирование. Штамм Burkholderia thailandensis E 264, а также штамм фага phiBp-AMP1 были из коллекции лаборатории проф. М. Клоки, Университет Лестера, Великобритания. Культура B. pseudomallei K96243 была из коллекции Университета Лестера. Все работы с B. pseudomallei проводились в специализированной сертифицированной лаборатории BSL-3 специально подготовленным персоналом.

Для культивирования бактерий и бактериофагов использовали стандартную среду LB (триптон – 10 г; дрожжевой экстракт 5 г; NaCl – 10 г; деионизованная вода – до 1 л). В некоторых экспериментах использовалась среда с другими концентрациями NaCl. Для приготовления чашек к среде перед автоклавированием добавляли 15 г агара на 1 л, для верхнего агара – 6 г агара на 1 л.

Титрование фагов осуществляли стандартным двуслойным методом. Инкубацию чашек проводили при 37°С.

Определение влияния агрохимикатов на рост и стабильность фага AMP1 проводили, добавляя соответствующие соединения (натриевая соль дихлорфеноксиуксусной кислоты (Na-2,4Д), паракват, глифосат, приобретенные у “Sigma-Aldrich”, США) к агару на чашках (и в верхний, и в нижний слои) до титра 25 мг/мл для органических молекул. Малорастворимые в воде атрозин и аметрин (“Santa Cruz Biotechnology”, США) использовались в концентрации 1/200 от насыщающей. Концентрация CuCl₂ для эксперимента на чашках была 2.5 мM, так как более высокие концентрации ингибировали рост газона. На чашках с соответствующими добавками проводили титрование исходных суспензий фага. Для определения влияния исследуемых соединений на стабильность фагов, их вносили в физиологический раствор, в который добавляли 0.01 объема лизата бактериофага. Суспензию инкубировали 30 мин, после чего готовили серию дальнейших разведений и производили посев для подсчета бляшек. При наличии выраженного эффекта исследовали действие меньших концентраций соответствующих агентов. Cоли железа(II) FeSO₄ и (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ в экспериментах на чашках не использовали, поскольку их окисление кислородом воздуха невозможно проконтролировать в таких условиях. В экспериментах по инактивации фага использовали стоковые 500 мM растворы, которые готовили непосредственно перед экспериментом. Растворы использовали в разведении 1 : 200 до 1 : 3200 с шагом в 2 раза (соответственно, концентрация уменьшалась с 2.5 мМ до 156 мкМ).

Исследование влияния солей на рост фага AMP1. Для исследования влияния концентрации NaCl, а также солей искусственного почвенного раствора готовили среды, не содержащие NaCl. При подготовке чашек в них добавляли определенное количество 40% (вес/объем) раствора Na-Cl для достижения необходимой концентрации соответствующих солей. Использовали искусственный почвенный раствор следующего состава (мМ): NaCl ‒ 5; CaCl₂ ‒ 5; KCl ‒ 1; NH₄Cl ‒ 1; MgCl₂ ‒ 3 (из данного раствора были исключены ионы Mn²⁺, присутствие которых может наблюдаться в почве (Katoh et al., 2004), поскольку эти ионы оказались способны инактивировать фаг). Состав искусственного почвенного раствора был выбран на основании данных о составе растворов почв рисовых чеков (Katoh et al., 2004), так, чтобы концентрация каждого из катионов соответствовала максимальной концентрации, наблюдаемой в течение года.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование воздействия агрохимикатов на рост и стабильность фага AMP1. Для оценки возможного эффекта различных пестицидов на рост фага были приготовлены чашки, засеянные двуслойным методом (по Грациа) газонами культуры хозяина B. thailandensis E264, в оба слоя которых были добавлены соответствующие реагенты. На этих чашках осуществляли титрование одного и того же лизата бактериофага AMP1 путем нанесения на поверхность верхнего агара капель различных разведений фагового лизата, приготовленных в физиологическом растворе.

После инкубации чашек было обнаружено, что такие вещества как Na-2,4Д, паракват, атразин и глифосат не уменьшают биологический титр бактериофага (рис. 1). В присутствии некоторых соединений (наиболее выраженный эффект такого рода был у глифосата) наблюдалось даже образование бляшек большего размера, что, по-видимому, связано с некоторым угнетением роста бактериального газона и замедлением достижения бактериями стационарной фазы. Так, в присутствии глифосата газон индикаторной культуры выглядел заметно менее плотным, чем в контроле. Такие соединения как аметрин и CuCl₂ незначительно понижали количество бляшек (в пределах одного порядка). С учетом того, что используемые в данном эксперименте концентрации были многократно выше, чем ожидаемые в условиях практического применения этих веществ их количества в почвенных растворах или в воде рисовых чеков, эффектом исследованных органических пестицидов можно пренебречь. Поставленные с теми же соединениями эксперименты по инактивации фага (инкубация в течение 30 мин при комнатной температуре в физиологическом растворе) не обнаружили никакого инактивирующего эффекта. При использовании хлорида меди(II) в концентрации выше 4 мМ наблюдалась заметная инактивация фага с уменьшением титра на порядок и более. Однако эти концентрации не являются практически релевантными. Эксперименты на чашках с высокими концентрациями CuCl₂ поставить не удалось, так как наблюдалось подавление роста газона индикаторной культуры.

Рис. 1.

Влияние пестицидов на рост бактериофага AMP1 на культуре B. thailandensis.

Таким образом, изученные пестициды даже в очень высоких концентрациях не обладают выраженным влиянием ни на рост, ни на стабильность фага. Мы также исследовали влияние на стабильность фага препаратов железа(II), применяемых в качестве удобрений и ядохимикатов. В частности, исследовали сульфат железа(II) (железный купорос (FeSO₄), а также железоаммонийные квасцы (соль Мора ((NH₄)₂Fe(SO₄)₂). Поскольку железо(II) быстро окисляется кислородом воздуха, постановка эксперимента на чашках, аналогичного описанным выше, оказалась невозможной. При действии на суспензию фага в физиологическом растворе оба соединения показали сильную вирицидную активность (рис. 2). Так, соль Мора вызывала падение титра фага более, чем на порядок даже при наименьшей испытанной концентрации в 0.16 мM, а при концентрации 0.6 мM полностью инактивировала фаг в течение 30 мин. FeSO₄ был еще более активен, вызвав полную инактивацию вируса даже при наименьшей концентрации. Исследование более низких концентраций не производилось, так как это потребовало бы существенного усложнения эксперимента для учета фактора окисления железа(II) даже при сравнительно коротком периоде инкубации. Интересно, что сульфат железа(III) Fe₂(SO₄)₃ не оказывал существенного эффекта на жизнеспособность фага при концентрации 10 мМ (данные не приведены).

Рис. 2.

Инактивация фага AMP1 солями железа(II). Длительность инкубации с реагентом 30 мин.

Влияние NaCl и солей почвенного раствора на рост фага AMP1. В ходе определения параметров жизненного цикла фага AMP1, существенных для математического моделирования его влияния на популяции хозяев в водной среде (Egilmez et al., 2018), нами было обнаружено, что адсорбция бактериофага на клетках хозяина в среде LB происходит крайне медленно, что не позволяло количественно измерить константу адсорбции. В то же время в среде, разведенной в 10 раз деионизованной водой, адсорбция происходила более эффективно c константой около 4 × 10^–10 мл/мин. В этой связи, с учетом распространенности засоленных почв в СВ Таиланде (Duangurai et al., 2018; Chookietwattana, Yuwa-Amornpitak, 2019) и в других эндемичных по мелиоидозу районах, представлялось интересным исследовать влияние концентрации NaCl на эффективность роста фага AMP1. Для этой цели мы провели титрование лизата бактериофага на чашках с различными концентрациями NaCl (рис. 3а). Было обнаружено, что при низкой концентрации NaCl фаг AMP1 не способен образовывать бляшки, несмотря на то, что газон индикаторной культуры достигает такой же (или даже несколько большей) плотности, что и на стандартной среде LB. Обращает на себя внимание резкий характер зависимости эффективности посева (EOP) фага от концентрации NaCl: при 0.3% соли (51 мМ) рост практически отсутствует, при 0.4% NaCl (68 мМ) EOP снижена более чем на 2 порядка, но уже при 0.6% (102 мМ) EOP незначительно ниже максимальной, которая достигается при концентрации соли более 0.8% (136 мМ). Таким образом, при условиях, когда наблюдается максимальная скорость адсорбции бактериофага (Egilmez et al., 2018), его инфекционность практически полностью подавлена.

Рис. 3.

Влияние солей на инфекционность фага AMP1 в отношении B. thailandensis: а ‒ различные концентрации хлорида натрия; б ‒ искусственный почвенный раствор.

Для того, чтобы выяснить, на какой из стадий жизненного цикла происходит подавление инфекции, мы заразили находящуюся в логарифмической фазе роста (OD₆₀₀ = 0.2) культуру B. thailandensis Е264 фагом AMP1 в жидкой среде LB без NaCl. Инокуляцию осуществили таким образом, чтобы концентрация фага составила около 10⁵ БОЕ/мл. Культуру инкубировали в тех же условиях (37°C при активной аэрации на шейкере), которые использовались для получения лизатов фага. В моменты времени 0, 1, 2, 3, 6 и 18 ч отбирали аликвоты по 10 мкл, разводили в 100 раз в той же среде и производили посев для подсчета фага на чашки с использованием стандартных сред на основе LB, содержавших 1% NaCl. В течение инкубации количество БОЕ фага не претерпело существенных изменений, то есть, не наблюдалось ни инактивации, ни размножения вируса. Посевы тех же образцов после удаления клеток центрифугированием не обнаружили существенных различий титра по сравнению с интактными образцами. Таким образом, при низкой концентрации NaСl не происходит необратимой адсорбции фага (по-видимому, обратимо адсорбировавшиеся частицы успевают диссоциировать после разведения аликвот).

Для того, чтобы установить, требуется ли для перехода к необратимой инфекции высокая концентрация NaCl или необходима просто достаточная осмолярность среды, мы провели титрование фага на среде, содержавшей 4% глицерина вместо NaCl. Образование бляшек в этих условиях было полностью подавлено.

Мы предположили, что в природных условиях иные ионы, присутствующие в почвенном растворе, могут оказывать активирующее действие на инфекционность AMP1-подобных фагов. Для проверки этого предположения мы добавили к бессолевой среде LB смесь солей, имитирующую почвенный раствор. За 1× концентрацию были приняты максимальные концентрации соответствующих ионов, наблюдавшиеся в исследовании почвенных растворов под пахотным слоем рисовых полей (Katoh et al., 2004). При добавлении к среде солевой смеси 4×, 2× и меньших концентраций образования бляшек не наблюдалось, однако при добавлении к стандартной солевой среде 1% NaCl инфекционность фага полностью восстанавливалась (рис. 3б).

Поскольку зависимость инфекционности фага AMP1 может иметь определяющее значение с точки зрения его влияния на популяции возбудителя мелиоидоза в естественных местообитаниях, мы проверили наличие этого эффекта при инфекции штамма B. pseudomallei K96243. Из результатов этого эксперимента (рис. 4) следует, что сходные концентрации NaCl необходимы и для инфекции патогенного микроорганизма, что подтверждает адекватность непатогенной модели B. thailandensis для исследования физиологии взаимодействия AMP1-подобных фагов с возбудителем мелиоидоза.

Рис. 4.

Влияние концентрации хлорида натрия на инфекционность фага AMP1 в отношении B. pseudomallei.

Результаты математического моделирования (Egilmez et al., 2018, 2021) согласуются с ранее высказанными предположениями (Shan et al., 2014), что инфекция B. pseudomallei в почве и воде агроландшафтов эндемичных по мелиоидозу районов AMP1-подобными фагами является одним из существенных факторов, определяющих динамику численности возбудителя мелиоидоза в почвах и воде агроэкосистем. В пользу этих предположений также свидетельствует наблюдение, что выделение возбудителя мелиоидоза и его фагов (преимущественно AMP1-подобных) в серии образцов почвы, отобранных на одном поле, антикоррелируют между собой (Withatanung et al., 2016).

В то же время математические модели (Egilmez et al., 2018, 2021) предсказывают, что исход экологических взаимодействий между популяциями бактерий и бактериофагов может зависеть от достаточно большого набора особенностей среды, таких, как, например, мутность воды рисовых чеков, которая влияет на проникновение УФ радиации в поверхностные слои воды. Действием таких не вполне очевидных “тонких” факторов предположительно можно объяснить наблюдаемые существенные различия в годовой динамике заболеваемости мелиоидозом в районах, весьма схожих между собой по общим физико-географическим и агрономическим характеристикам.

В этой связи обнаружение в числе химических факторов, которые могут присутствовать в агроландшафтах, оказывающих сильное влияние на стабильность и инфекционность AMP1-подобных фагов, представляет существенный интерес как с точки зрения экологии самих этих вирусов, так и с позиций эпидемиологии мелиоидоза. В контексте полученных данных сама по себе высокая распространенность данной группы фагов представляет собой экологическую загадку. В почвах рисовых полей, периодически подвергаемых затоплению, неизбежно образование обширных зон с восстановительными условиями. Так, по данным Katoh и соавт. (Katoh et al., 2004), в составе перколяционной воды пахотного горизонта рисовых полей (Япония) концентрация Fe²⁺ достигала 3.5 мМ. Как следует из наших результатов, значительно меньших концентраций свободных ионов железа(II) достаточно для полной необратимой инактивации бактериофага. Для разрешения данного парадокса необходимо проведение полевых исследований в естественных местообитаниях данных вирусов и их хозяев, например, в СВ Таиланде. При этом необходимо учитывать, в каких именно химических формах преимущественно находится железо(II) в реальных почвенных растворах.

Аналогично, существенное влияние концентрации NaCl на инфекционность фага требует экологической интерпретации. В СВ Таиланде, где было выделено большинство изолятов AMP1-подобных фагов (Gatedee et al., 2011; Egilmez et al., 2018), засоленность почв широко распространена и носит при этом мозаичный характер (Shrestha, Farshad, 2009). Большая часть почв территории СВ Таиланда не засолены, и для них характерны значения электропроводности почвенных растворов менее 3 дСм/м (Shrestha, Farshad, 2009; Cl-ermont-Dauphin et al., 2010), а часто и менее 0.5 дСм/м (Chookietwattana, Yuwa-Amornpitak, 2019), что приблизительно соответствует эквиваленту 0.3‒2 г NaCl на 1 л. Это меньше пороговой концентрации в 3‒4 г NaCl на 1 л, которая была необходима для заметной активации перехода к необратимой адсорбции в наших экспериментах. В то же время, на территории СВ Таиланда пятнами присутствуют средне и сильно засоленные почвы со значениями удельной электропроводности 5‒15 дСм/м и более, что уже превышает определенную нами пороговую величину концентрации NaCl. Таким образом, степень засоления почв может быть существенным фактором, влияющим на экологию AMP1-подобных фагов, не учтенным в предложенных на данный момент математических моделях (Egilmez et al., 2018, 2021).

Интересно, что скорость обратимой адсорбции бактериофага оказывается значительно выше при низких концентрациях NaCl (Egilmez et al., 2018). Тем не менее, эффективность посева и видимый размер бляшек возрастали в наших опытах вплоть до концентрации NaCl 136‒160 мM (0.8–1%) (рис. 3, 4). По-видимому, в условиях эксперимента in vitro, осуществляемого с использованием богатых сред, увеличение способности фага инфицировать клетки при более высоких концентрациях NaCl с лихвой компенсирует потери, связанные с уменьшением константы адсорбции. Однако в природных местообитаниях оптимальное соотношение скорости обратимой адсорбции и эффективности перехода к необратимой адсорбции (а следовательно, оптимальные для размножения фага значения солености среды) могут быть иными.