1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Микробиология
  4. T. 91, № 4, 2022

Микробиология, 2022, T. 91, № 4, стр. 433-450

Синтез биогенных аминов молочнокислыми бактериями на средах растительного и животного происхождения

Е. Ф. Шаненко a, Ю. А. Николаев b, *, В. И. Ганина a, И. Н. Серых a, А. В. Олескин c, Т. Г. Мухамеджанова a, Н. В. Григорьева b, Г. И. Эль-Регистан b

a ФГБОУ ВО “Московский государственный университет пищевых производств”
125080 Москва, Россия

b Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского, ФИЦ Биотехнологии РАН
119071 Москва, Россия

c МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра общей экологии и гидробиологии
119234 Москва, Россия

* E-mail: nikolaevya@mail.ru

Поступила в редакцию 14.03.2022
После доработки 17.03.2022
Принята к публикации 22.03.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Роль микробиоты кишечника в метаболизме и жизнедеятельности организма-хозяина хорошо известна. Одним из механизмов их взаимодействия базируется на биогенных аминах (БА). По этой причине синтез БА молочнокислыми бактериями (МКБ) интенсивно исследуется и рассматривается как важное свойство МКБ-пробиотиков. В настоящей работе исследован синтез БА молочнокислыми бактериями трех видов (13 штаммов), выделенных из разных местообитаний и с разными экофизиологическими функциями, выращенными на четырех разных средах. Показано, что среды существенно различаются по исходному содержанию БА. МКБ могут как потреблять БА из сред, так и синтезировать их в ходе роста, что необходимо учитывать при конструировании пробиотиков. На основании полученных данных скорректированы пути биосинтеза БА молочнокислыми бактериями и обсуждается вопрос о роли микробной продукции нейроактивных соединений в функционировании микробного сообщества организма человека, его нервной и иммунной систем, а также перспективы создания “биофабрик нейромедиаторов” на основе тестированных симбиотических и пробиотических микроорганизмов.

Ключевые слова: молочнокислые бактерии, биогенные амины, пробиотики, синтез на разных средах, пути метаболизма

Внимание к биологическим препаратам, действующим началом которых являются живые культуры молочнокислых бактерий (МКБ) симбиотической микробиоты человека, изначально было обусловлено возрастающей частотой возникающих различных патологий человека, связанных с дисбактериозом.Особенно актуальным использование этих препаратов стало в эпоху массового применения противомикробных лекарственных средств, которые подавляют не только патогенные микроорганизмы, но и собственную симбиотическую микробиоту. Видовой состав микроорганизмов, используемых в пробиотических препаратах, достаточно широк и не исчерпывается представителями МКБ. В препаратах могут присутствовать бифидобактерии, дрожжи, мицелиальные грибы.

Хотя традиционно препараты МКБ использовали для коррекции кишечной микробиоты, оказалось, что, помимо этого воздействия, МКБ способны корректировать деятельность многих органов и физиологических систем человека, повышать иммунологическую реактивность и общую неспецифическую резистентность в условиях стрессовых нагрузок.

В последние десятилетия появилось множество данных, свидетельствующих о том, что роль симбиотической микробиоты, особенно желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), не сводится к ее коррекции и защите организма хозяина от патогенных микроорганизмов. Установлено, что микробиота ЖКТ находится в тесной взаимосвязи с организмом хозяина, что реализуется посредством передачи сигналов в нервную, эндокринную, иммунную и гуморальную системы. Организм хозяина, в свою очередь, может влиять на микробиоту ЖКТ через изменение моторики, кишечной проницаемости, выработки слизи и активации иммунной системы (Foster et al., 2016).

Взаимодействие между кишечной микробиотой и иммунной системой хозяина начинаются с его рождения, и они взаимно влияют на развитие друг друга (Nicholson et al., 2012) на протяжении всей жизни хозяина. В результате формируется сложный суперорганизм, в котором микробиота кишечника становится органом, обладающим множественными регуляторными функциями. Для обозначения этого органа используется термин “микробиом”. Взаимодействие микробиома и хозяина осуществляется посредством множественных прямых химических взаимодействий, передающих сигналы в центральную нервную систему (ЦНС), вегетативную нервную систему (ВНС) и нервную систему кишечника − энтеральную нервную систему (ЭНС) хозяина. Кишечный микробиом рассматривается в настоящее время как составляющая так называемой системы “кишечник−мозг”, которая трансформировалась, с учетом современных знаний, в ось “микробиом‒кишечник−мозг”, двунаправленную коммуникационную систему, обеспечивающую функционирование супрасимбиотического организма. У здоровых людей эта система осуществляет мониторинг и интеграцию различных функций кишечника и связывает эмоциональные и когнитивные центры головного мозга с периферическими кишечными функциями, такими как иммунная активация, кишечная проницаемость и энтероэндокринная передача сигналов (Siragusa et al., 2007). Поскольку ось “микробиом−кишечник−мозг” является двунаправленной, нейроэндокринный ответ организма хозяина на стресс вызывает изменения в количестве и составе микробиоты кишечника. Существенные различия наблюдаются в составе микробиоты здоровых людей и при ожирении; тревожных расстройствах, заболеваниях рассеянным склерозом, болезнью Паркинсона и болезнью Альцгеймера, аутизмом. Исследователями выявлена высокая степень корреляции между составом и соотношением микроорганизмов кишечника и функциональными способностями мозга (Barbara et al., 2005; Heijtz et al., 2011; Naseribafrouei et al., 2014; Carabottia et al., 2015; Foster et al., 2016).

На животных показано, что перенесение кишечного микробиома от одной особи к другой приводит к приобретению реципиентом поведенческих особенностей, характерных для донора. Внесение определенного микробиома на ранних этапах жизни приводит к воссозданию стереотипных для этих животных моделей поведения. Внесение микробиома взрослым особям в меньшей степени влияет на поведенческие реакции, но снижает уровень тревожности и повышает когнитивные функции (Foster et al., 2016). Изучение формирования функций мозга у грудных детей также показало участие в этом процессе микробиома (Siragusa et al., 2007; Ravel et al., 2011; Nicholson et al., 2012). Другим важным направлением в исследовании влияния микробиоты на мозг является изучение роли микробиома в формировании поведенческих и когнитивных особенностей (Siragusa et al., 2007).

Взаимодействие кишечной микробиоты и нервной системы организма хозяина осуществляется посредством синтезируемых ими нейроиммуноэндокринных нейромедиаторов. К ним относятся: нейроактивные аминокислоты (γ-аминомасляная и другие органические кислоты, янтарная и другие), ацетилхолин, биогенные амины (серотонин, норадреналин, адреналин и другие) (Tsigos, Chrousos, 2002).

Исследования взаимодействий в оси “микробиом−кишечник−мозг” показали, что в их основе лежат механизмы синтеза и рецепции нейротрансмиттеров бактериями кишечника (Tsigos, Chrousos, 2002). Сам факт наличия у клеток про- и эукариот рецепторов, позволяющих им распознавать нейроэндокринные гормоны, известен уже несколько десятилетий. Бактерии могут продуцировать самые разные гормоны: от соматостатина до ацетилхолина и прогестерона, причем количество этих соединений, связываемых рецепторами клеток кишечника, достаточно, чтобы вызвать нейрофизиологический сдвиг в организме хозяина (Tsigos, Chrousos, 2002; Bravo et al., 2011; Heijtz et al., 2011).

Секретируемые бактериями нейротрансмиттеры (нейромедиаторы) могут непосредственно воздействовать на нервные окончания в ЖКТ, а также стимулировать эпителиальные клетки кишечника, которые в ответ освобождают молекулы, модулирующие нейропередачу в ЭНС, оказывая влияние на мозг и поведение человека. Эта функция микробиома обеспечивает профилактику неврологических и нейрофизиологических расстройств человека.

Исследования на животных показали, что микробиота влияет на их стрессовую реактивность и состояние тревоги. Микробиота влияет на активность ЭНС, продуцируя молекулы, действующие как локальные нейромедиаторы, такие как ГАМК, серотонин, мелатонин, гистамин и ацетилхолин, а также генерируя активную форму катехоламинов в просвете кишечника. Синтезируемые микробиотой короткоцепочные органические кислоты (масляная, пропионовая, уксусная) способны стимулировать высвобождение серотонина в слизистую оболочку, оказывая влияние на память и когнитивные способности (Ravel et al., 2011; Gordon, 2012; Carabottia et al., 2015).

Изучение способности пробиотических микроорганизмов синтезировать нейротрансмиттеры привело к формированию группы штаммов, объединяемых названием “психобиотики” (Dhakal et al., 2012; Zhao et al., 2015; Lim et al., 2016).

Поиск активных продуцентов нейротрансмиттеров среди пробиотических бактерий стал одним из активно развиваемых направлений в области направленного позитивного воздействия на организм человека через ось “микробиом−кишечник−мозг”. Так, методом ВЭЖХ было определено содержание катехоламинов в культурах многих про- и эукариотических микроорганизмов (Цавкелова и соавт., 2000). Например, норадреналин в концентрациях 0.2‒2 мкМ присутствовал в биомассе Bacillus mycoides, B. subtilis, Proteus vulgaris, Serratia marcescens; дофамин в количестве 0.5‒2 мкМ – в биомассе большинства тестированных прокариот (Олескин и соавт., 2020). Серотонин в низкой концентрации был обнаружен в клетках Rhodospirillum rubrum (Олескин и соавт., 1998), а в клетках Bacillus subtilis и Staphylococcus aureus (Цавкелова и соавт., 2000) в концентрациях порядка 1 мкМ. DA и 5-НТ в микромолярных концентрациях детектирован также у Morganella morganii, Klebsiella pneumonia и Hafnia alvei (Özogul, 2004). На модели E. coli К-12 (Шишов и соавт., 2009) показано, что максимальные (микромолярные) концентрации катехоламинов и 5-НТ накапливаются в лаг-фазе роста культуры, на основании чего можно предположить, что нейромедиаторные амины являются своеобразными “триггерами”, активирующими рост и деление клеток в начальной фазе онтогенеза микробной культуры.

Как показали исследования, способностью к синтезу нейромедиаторов обладают заквасочные молочнокислые бактерии, используемые в производстве сыров, йогуртов и других кисломолочных продуктов. Нейромедиаторы в количествах, сопоставимых с их концентрацией в кровотоке человека, обнаружены во многих ферментированных продуктах (Lim et al., 2016; Siragusa et al., 2017).

Основные обнаруживаемые в культуральной жидкости заквасочных культур нейроактивные соединения ‒ это дофамин (DA), норадреналин (NA), адреналин (А), их предшественники L-тирозин и дигидрофенилаланин (DOPA) и продукты окислительного дезаминирования этих нейромедиаторов − 3-метокситирамин (3-МТ), дигидроксифенилуксусная (DOPAC) и гомованилиновая (HVA) кислоты, а также серотонин (5-НТ) и его предшественники и продукты распада ‒ L-триптофан, 5‑гидроксиметилтриптофан (5-НТР) и 5-гидроксииндолилуксусная кислота (5-HIAA) и нейроактивные аминокислоты (глицин, γ-аминомасляная и глутаминовая кислоты).

Важно отметить, что на способность микробиоты синтезировать нейротрансмиттеры влияет тип питания хозяина. Так, мыши, которые получали говяжий фарш, имели более разнообразный состав микробиоты, повышенную физиологическую активность, память и пониженную тревожность по сравнению с получающими зерно (Foster et al., 2016).

Открываются новые возможности в диетотерапии при различных неврологических расстройствах, в геронтологии, в диетологии профессиональных групп людей, деятельность которых сопряжена со стрессовым воздействием. Другое направление исследования – это способность синтезировать нейротрансмиттеры с учетом ее видовой и штаммовой специфичности. В частности, подбор определенных пробиотических штаммов позволит разработать новую стратегию коррекции при метаболических нарушениях различного характера в организме хозяина (Heijtz et al., 2011; Foster et al., 2013; Naseribafrouei et al., 2014).

Бактерии-продуценты нейротрансмиттеров могут найти широкое применение в создании нового поколения функциональных продуктов с выраженной нейрохимической направленностью (Bercik et al., 2011; Жиленкова и соавт., 2013).

Однако, разрабатывая продукты питания, обогащенные живыми психобиотиками или нейроактивными соединениями, нельзя не учитывать состав питательных сред, так как известно, что количество, вид и соотношение элементов питания в среде определяет характер метаболизма продуцента (Bravo et al., 2011; Carabottia et al., 2015).

Расширение поиска активных продуцентов нейротрансмиттеров позволит создать банк продуцентов этих соединений для создания пребиотических продуктов различного назначения, а изучение влияния состава питательной среды на синтез нейротрансмиттеров позволит помимо этого разработать диетологические рекомендации для стимулирования синтеза нейротрансмиттеров собственной микробиотой (Жиленкова и соавт., 2013).

Целью работы было провести сравнительное исследование способности коллекционных штаммов молочнокислых бактерий продуцировать внеклеточные нейромедиаторы (биогенные амины) при росте культур на средах животного и растительного происхождения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Штаммы бактерий и условия культивирования. В работе были использованы 13 штаммов молочнокислых бактерий (МКБ) 4 родов (табл. 1). Бактерии были выделены из молока, сквашенных продуктов, кислого дробленого зерна, желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и вагины человека, ротовой полости человека, а также с поверхности цветов и листьев растений (табл. 1). Бактерии выращивали в микроаэрофильных условиях (статически, в пробирках объемом 50 мл в 20 мл среды) при 28°С в течение 24 ч в следующих средах:  гидролизат молока (ГМ); мясо-пептонный бульон (МПБ); солодовое ячменное сусло 7°Б (С); капустный сок (КС). Среды готовили по традиционным прописям (Теппер, Переверзева, 2004). Для приготовления сусло-агара к пивному суслу (8°Б) добавляли агар-агар (2.5%, по весу), кипятили до расплавления, фильтровали через вату и стерилизовали при 0.5 атм. В качестве молочной среды использовали обезжиренное молоко, стерилизованное при 0.5 атм. Гидролизованное молоко готовили с использованием сухого панкреатина (“Фармстандарт”, Россия) (1 г/л) и хлороформа. Капустный сок получали с применением соковыжималки, используя листья из середины кочана; после фильтрации через слой ваты pH доводили до значения 7 ± 0.1 и стерилизовали при 0.5 атм.

Таблица 1.

Отобранные для исследований молочнокислые бактерии

Штамм Номер во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, ВКПМ Источники выделения
Lactococcus lactis subsp. cremoris LL-52 ВКПМ В-8557 Цветы, растения
Lactococcus: Lactococcus lactis subsp. lactis LLN -E2 ВКПМ В-8558 Молоко, сквашенные продукты
Lactococcus lactis subsp. lactis 125 * Молоко, сквашенные продукты
Lactococcus lactis subsp. lactis В-102 * ЖКТ млекопитающих
Lactococcus lactis subsp. cremoris LCN-98 ВКПМ B-8559 Цветы, растения
Lactococcus lactis subsp. cremoris 36c * Цветы, растения
Lactococcus lactis subsp. cremoris 18АК * Цветы, растения
Lactobacillus acidophilus АСТ-41 ВКПМ В-9644 ЖКТ и вагина млекопитающих и человека
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus БГ-G ВКПМ В-8554 Кислое дробленое зерно (sour grain mash)
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus VG-9 * Йогурт, сметана, ЖКТ болгар
Streptococcus salivarius thermophilus СТ-14 ВКПМ В-7765 Ротовая полость человека
Streptococcus salivarius thermophilus СТ-160 ВКПМ В-7988 Ротовая полость человека
Streptococcus salivarius thermophilus ТP-20 ВКПМ В-7983 Ротовая полость человека

* Штамм из коллекции культур МГУПП.

Определение биогенных аминов. Биогенные амины определяли в средах и культуральной жидкости культур МКБ стационарной фазы роста, которую получали центрифугированием выросших культур (5000 g, 20 мин). Содержание биогенных аминов определяли методом ВЭЖХ на хроматографической установке LC-304E (“BAC”, West Lofayette, США) при разделении биогенных аминов в обращенной фазе на колонке ReproS11 – Pur (Dr. Majsch GMBH, “Элсико”, Москва) с последующей амперометрической детекцией на стеклянно-угольном электроде как описано ранее (Шендеров, 2014а).

Статистическая обработка. Все эксперименты проведены в трех биологических повторностях для каждого варианта. При определении концентраций гормонов проводили 4‒6 независимых измерений. С применением программы Excell-2004 рассчитывали среднее арифметическое и среднее абсолютных значений отклонений точек данных от среднего. Последнее значение соответствует экспериментальному разбросу и не превышает 5%. Результаты представлены в виде средних арифметических значений.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследовании определяли нейроактивные амины: DА, НА и 5-НТ, а также их предшественники, образующиеся в путях метаболизма L-тирозина и L-триптофана, и продукты их окислительного дезаминирования (рис. 1). Анализ их количественных превращений (в наномолях или микромолях на 1 л) дает представление о путях синтеза биогенных аминов у МКБ определенного таксономического положения (на уровне рода, вида, подвида). Дополнительную важную информацию авторы прогнозировали получить при росте МКБ на средах различного состава, отражающих (моделирующих) типы питания человека (растительная или животная пища). В качестве питательных сред были использованы гидролизат молока, мясо-пептонный бульон, ячменное солодовое сусло и сок капусты.

Рис. 1.

Метаболические пути образования биогенных аминов молочнокислыми бактериями. Обозначения: дофамин (DA), норадреналин (NA), адреналин (А), дигидрофенилаланин (DOPA), 3-метокситирамин (3-МТ), дигидроксифенилуксусная кислота (DOPAC), гомованилиновая кислота (HVA), серотонин (5-НТ), 5-гидроксиметилтриптофан (5‑НТР), 5-гидроксииндолилуксусная кислота (5-HIAA) (по Hoffmann, 2014).

Концентрации биогенных аминов представлены в табл. 2‒5 и обобщены на рис. 2а‒2г. Изложим основные результаты по каждой из групп нейроактивных продуктов.

Таблица 2.

Содержание биогенных аминов в среде роста МКБ: при выращивании на гидролизате молока

Штамм NA DOPA A DOPAC DA 5-HIIA 5-HTP HVA 3MT 5-HT
L. lactis subsp. lactis LLN-E2 243.01 5.6 14.42 32.44 22.98 1.55 15.06 79.29 10.08 15.04
L. lactis subsp. lactis 125 245.4 2.04 14.7 40.52 18.42 48.75 11.74 3.95 10.8 13.06
L. lactis subsp. lactis В-102 156.35 6.47 8.21 41.67 3.15 23.95 6.89 22.01 6.71 4.71
L. lactis subsp. cremoris 36c 251 6.99 13.75 39.85 21.42 0.55 21.72 8.77 11.57 12.68
L. lactis subsp. cremoris 18АК 131.61 10.31 12.75 46.49 5.789 20.47 3.49 24.11 4.94 5.4
L. lactis subsp. cremoris LL-52 165.71 20.08 12.48 32.86 6.31 0 0.06 1.52 10.21 12.69
L. lactis subsp. cremoris LCN-98 243.01 7.03 19.1 13.79 4.4 0.57 7.72 0.11 8.72 7.6
S. salivarius thermophilus СТ 14 141.9 31.34 8.76 9.44 6.48 19.19 3.8 19.39 9.18 7.06
S. salivarius thermophilus СТ-9 193.35 4.5 13.11 24.64 6.02 0.85 6.44 63.95 7.06 17.16
S. salivarius thermophilus СТ 160 210.22 9.33 35.14 36.08 4.78 0.51 2.4 5.69 12.33 20.29
S. salivarius thermophilus ТР-20 197.83 117.92 20.23 40.62 20.57 0.25 9.52 49.92 22.08 1.95
L. acidophilus АСТ-41 198.77 15.53 11.94 40.62 24.62 1.4 7.48 0.37 30.91 8.09
L. acidophilus АE-5 171.04 0 26.34 28.42 3.77 29.93 2.94 3.88 6.3 18.82
L. acidophilus АД-3 229.19 9.53 20.72 56.44 23.64 34.46 2.05 23.5 12.26 13.7
L. delbrueckii subsp. bulgaricus БГ-G 188.56 8.23 19.03 12.37 21.82 0.18 4.89 44.66 9.59 10.61
L. delbrueckii subsp. bulgaricus VG-9 217.23 19.64 16.32 53.95 5.02 36.97 5.15 6.04 17.4 23.11
Среда ГМ (контроль) 10.3 10.0 0.00 5.35 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Штаммовый разброс продуктивности 130‒240 0–10 12‒25 5‒50 3–24 1‒48 3‒20 20‒50 10‒30 10‒20
Усредненный уровень накопления нейромедиаторов 170‒220 5–20 12‒25 10‒35 5–20 1‒30 4‒15      
Таблица 3.

Содержание биогенных аминов в среде роста МКБ: при выращивании на среде МПБ

Штамм NA DOPA A DOPAC DA 5-HIIA 5-HTP HVA 3MT 5-HT
L. lactis subsp. lactis LLN-E2 40.5 2.32 145.12 26.07 17.37 0.33 39.56 39.07 78 30.31
L.lactis subsp. lactis 125 19 0.03 73.8 29.4 3.8 0.54 25.83 24.3 101.15 38.16
L. lactis subsp. cremoris 18АК 39/09 29.59 65.98 25.47 19.51 0.79 3.25 41.25 94.85 28.22
L. lactis subsp. cremoris LL-52 121.46 38.74 41.72 14.72 17.3 6.35 3.46 7.18 94.84 36.82
L. lactis subsp. cremoris LCN-98 17.59 1.25 52.39 17.28 16.67 11.4 18.29 289.32 89.92 34.73
S. salivarius thermophilus СТ 14 40.34 32.18 31.24 11.98 6.92 3.52 3.77 2.87 141.62 28.31
S. salivarius thermophilus СТ 9 11.09 2.82 62.71 1.12 3.44 0.99 1.28 2.13 97.45 35.29
S. salivarius thermophilus ТР-20 34.52 22.42 75.7 10.01 3.91 1.15 2.89 1.57 119.04 31.4
L. acidophilus АСТ-41 37.54 44.63 45.32 2.22 191.95 0.57 15.35 0.52 121.42 20.78
L. acidophilus АE-5 37.75 19.28 66.01 26.01 6.47 2.11 3.93 11.01 98.1 26.22
L. acidophilus АД-3 32.29 22.14 48.76 10.25 105.81 0.51 13.71 6.9 107.76 35.85
L. delbrueckii subsp. bulgaricus БГ-G 24.92 0.14 22.72 10.11 11.48 0.03 4.74 40.27 >50.17 10.76
L. delbrueckii subsp. bulgaricus VG-9 15.58 27.12 54.05 5.1 88.29 0 0 0.1 >58.48 17.86
Среда МПБ (контроль) 97.2 0.00 0.00 36.8 9.95 53.25 0.00 0.00 0.00 0.00
Штаммовый разброс уровня накопления нейромедиаторов 0 0.5‒44 22‒150 0 7‒180 0 3‒40 10‒280 50‒120 10‒38
Усредненный уровень накопления нейромедиаторов 0 20‒40 50‒140 0 20‒100 ? 3‒20 2‒180 50‒100 20‒35
Таблица 4.

Содержание биогенных аминов в среде роста МКБ: при выращивании на среде с суслом

Штамм NA DOPA A DOPAC DA 5-HIIA 5-HTP HVA 3MT 5-HT
L. lactis subsp. lactis LLN-E2 298.4 0 618.9 101.54 3988.22 719.21   47 362.85 0 1275.05
L. lactis subsp. lactis 125 0 0 854.69 113.27 3692.67 971.52   50 717.91 0 1075.57
L. lactis subsp. lactis B-102 175.28 0 625.57 219.28 4445.88 755   53 160.37 0 1413.42
L. lactis subsp. cremoris 36c 0 0 266.75 12.38 2552.2 957.79   40 421.07 0 770.85
L. lactis subsp. cremoris 18АК 0 0 451.8 115.66 2670.82 1011.83   45413 0 1019.41
L. lactis subsp. cremoris LL-52 249.04 0 0 327.77 4202.44 474.62   228.14 76.2 1473.72
L. lactis subsp. cremoris LCN-98 0 0 410.38 134.07 389.32 585.97   196.9 118.05 1459.22
S. salivarius thermophilus СТ 14 397.83 0 432.57 62.44 3511.49 680.43   48 781.55 0 1269.9
S. salivarius thermophilus СТ 160 55.23 0 543.45 88.2 3736.15 581.9   162.86 32.83 1504.0
S. salivarius thermophilus ТР-20 508.03 0 296.74 15.12 3834.12 637.66   350 9.27 1239.66
L. acidophilus АСТ-41 0 0 0 52.33 1908.16 1684.67   601.78 0 1279.44
L. delbrueckii subsp. bulgaricus БГ-G 180.25 0 180.25 403.39 4483.62 459.8   200.75 82.93 1581.81
L. delbrueckii subsp. bulgaricus VG-9 0 0 715.7 198.24 4856.47 805.61   60 170.05 0 1594.6
Среда С (контроль) 0.00 0.00 0.00 0.00 3570.15 329.24 0.00 236.48 88.0 915.29
Штаммовый разброс уровня накопления нейромедиаторов 55‒500   180‒800 15‒400 200‒1000 150‒1300   100‒59 000 0‒118 100‒600
Усредненный уровень накопления нейромедиаторов 180‒400   300‒700 50‒200 200‒800 300‒1000   300‒45 000 0‒70 300‒600
Таблица 5.

Содержание биогенных аминов в среде роста МКБ: при выращивании на капустном соке

Штамм NA DOPA A DOPAC DA 5-HIIA 5-HTP HVA 3MT 5-HT
L. lactis subsp. lactis LLN-E2 253.81 0 1911.08 1077.86 1350.36 497.75   11 742.12 0 1092.04
L. lactis subsp. lactis 125 227.21 0 789.36 0 1123.91 442   15 628.45 0 364.07
L. lactis subsp. lactis В-102 0 0 2885.3 2213.19 1977.54 722.81   15 743.62 0 466.17
L. lactis subsp. cremoris 36c 407.79 0 573.02 741.62 984.89 1011.83   1251.09 0 242.72
L. lactis subsp. cremoris 18АК 160.69 0 2034.18 1214.42 1040.39 473.55   14 980.68 0 237.32
L. lactis subsp. cremoris LL-52 294.45 0 1955.7 1327.61 1564.99 470.98   11 407.5 0 692.09
L. lactis subsp. cremoris LCN-98 110.21 0 21.95 1220.98 1135.25 427.28   12 590.7 0 170.65
S. salivarius thermophilus СТ 14 152.97 0 2633.91 1227.11 1581.64 557.28   13 653.15 0 286.13
S. salivarius thermophilus СТ 160 235.49 0 1382.36 571.62 1184.61 382.18   9378.46 0 200.48
S. salivarius thermophilus ТР-20 268.2 0 1036.87 106.99 718.48 246.22   6783.23 0 222.44
L. acidophilus АСТ-41 0 0 0 597.89 28.35 708.21   12 551.36 0 10.75
L. acidophilus АE-5 0 0 235.81 511.78 1436.78 122.09   240.79 0 0
L. delbrueckii subsp. bulgaricus БГ-G 245.15 0 245.15 363.65 1226.49 380.75   13 286.65 41.13 183.17
L. delbrueckii subsp. bulgaricus VG-9 202.91 0 1195.36 970.69 1072.27 323.41   8342.61 0 180.73
Среда КС (контроль) 164.24 0.00 2403.01 692.20 2039.09 315.29   16 400.63 18.07 353.9
Штаммовый разброс уровня накопления нейромедиаторов 40‒240   20‒200 150‒1500 0 60‒800   0 0 100‒800
Усредненный уровень накопления нейромедиаторов 40‒80   0‒10 300‒600 0 100‒300        
Рис. 2.

Уточненные по итогам настоящей работы метаболические пути образования биогенных аминов молочнокислыми бактериями: (а) Lactococcus lastis; (б) Streptococcus salivarius; (в) Lactobacillus acidophilus; (г) Lactobacillus delbueckii. Обозначения: дофамин (DA), норадреналин (NA), адреналин (А), дигидрофенилаланин (DOPA), 3-метокситирамин (3-МТ), дигидроксифенилуксусная кислота (DOPAC), гомованилиновая кислота (HVA), серотонин (5-НТ), 5-гидроксиметилтриптофан (5-НТР), 5-гидроксииндолилуксусная кислота (5-HIAA).

Катехоламины являются производными аминокислоты тирозина, гидроксилирование которой дает диоксифенилаланин (DOPA) – непосредственный предшественник катехоламинов. Синтез катехоламинов (рис. 2) идет с помощью ферментов тирозингидроксилазы (1), DOPA-декарбоксилазы (2), дофамингидроксилазы (3), фенилэтаноламин-N-метилтрансферазы (4).

DOPA, представляющая первое звено в катехоламинном пути, способна в организме человека проникать из кишечника в кровоток и далее из кровяного русла в головной мозг, проходя гемато-энцефалический барьер (ГЭБ). С этим связан интерес к DOPA, которая, как показано в предшествующих работах, синтезируется и выделяется в среду культивирования в микромолярных концентрациях Escherichia coli K-12 (Шишов и cоавт., 2009), Bacillus cereus (Шишов, 2010) и, что представляется особенно важным в контексте настоящей работы, молочнокислыми бактериями тестированных штаммов видов Lactobacillus helveticus (причем, наиболее продуктивный штамм NK-1 выделяет до 3.7 мкМ DOPA на среде с гидролизатом молока), L. casei, L. delbrueckii subsp. bulgaricus (Oleskin et al., 2014; Олескин и соавт., 2014), а также L. lactis subsp. lactis (штаммами K-205, F-119 и F-116) (Vodolazov et al., 2018) – в субмикромолярных количествах (0.15‒0.21 мкМ).

В настоящей работе методом ВЭЖХ с амперометрической детекцией DOPA в концентрации около 10 нМ обнаружена в среде на основе гидролизатa молока (ГМ). На этом средовом фоне явно проявились штаммовые различия: в культурах штаммов Lactococcus lactis subsp. cremoris LL-52, S. salivarius subsp. thermophilus CT14, L. delbrueckii subsp. bulgaricus VG-9 наблюдалось некоторое накопление DOPA, хотя не в такой мере, как в тестированных ранее штаммах L. delbrueckii subsp. bulgaricus (Oleskin et al., 2014; Олескин и соавт., 2014). Наибольшая концентрация DOPA (31.3 нМ) достигнута в культуре S. salivarius subsp. thermophilus CT14. В то же время в культурах штаммов L. lactis subsp. lactis 125 и L. acidophilus ACT-41 наблюдали резкое снижение концентрации ДОФА по сравнению с уровнем в среде, т.е. поглощение DOPA с вероятной конверсией в дофамин по вышеприведенной схеме.

Мясо-пептонный бульон (МПБ) отличался отсутствием DOPA (до инокуляции тестируемых бактерий). На этом фоне DOPA в концентрациях порядка десятков наномолей содержалась в культурах L. lactis subsp. cremoris 18AK и LL-52, S. salivarius subsp. thermophilus (у двух штаммов из трех тестированных), всех штаммов L. acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus VG-9. Максимальная концентрация DOPA (44.6 нМ) продуцировалась L. acidophilus АСТ-41.

Две также использованных в настоящей работе питательных среды (солодовое сусло и капустный сок) не содержали DOPA изначально, и ни один из тестируемых штаммов не выделял DOPA на этих средах.

Дофамин (DA) отсутствовал до инокуляции бактерий в гидролизате молока (ГМ). Он на данной среде выделялся всеми штаммами. Относительно более эффективными продуцентами (выделявшими около 20 нМ DA) были: 1) L. lactis subsp. lactis (2 штамма из 3), отметим выработку DA другими штаммами того же вида в работе (Vodolazov et al., 2018), причем штамм L. lactis subsp. lactis 729 также выделял 20 нМ DA в среду; 2) L. acidophilus (2 штамма из трех); 3) L. lactis subsp. cremoris 36с; 4) S. salivarius (только штамм ТР-20); 5) L. delbrueckii subsp. bulgaricus штамм БГ-G, отметим продукцию примерно таких же концентраций DA (30 нМ) штаммом того же вида при культивации на молоке в работе (Oleskin et al., 2014).

МПБ содержал примерно 10 нМ DA до культивации бактерий. Только три штамма существенно (до уровней примерно 0.1‒0.2 мкМ) обогащали среду DA: два штамма L. acidophilus (которые выделяли и предшественник DA – DOPA, см. выше) и штамм VG-9 L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Наиболее эффективным продуцентом DA на МПБ был штамм АСТ-41 L. acidophilus. В то же время, все штаммы S. salivarius subsp. thermophilus поглощали DA из среды, особенно штаммы СТ 9 и ТР 20-, снижавшие уровень DA в среде до 3‒4 нМ. Это находит свое возможное объяснение в постоянном соприкосновении данного представителя оральной микробиоты с содержащимися в слюне нейромедиаторами, включая дофамин (Олескин и соавт., 2020). До уровня 3.8 нМ поглощал из среды DA также штамм 125 L. lactis subsp. lactis.

Сусло содержало высокие концентрации DA (3.6 мкМ) до инокуляции, и в этих условиях дополнительного синтеза не наблюдалось, более того, 4 из тестированных штаммов активно поглощали DA из среды (своего рода пример принципа Ле Шателье в случае как недостатка – ГМ и МПБ, так и избытка DA), особенно штамм L. lactis subsp. cremoris LCN-98, снижавший концентрацию DA в среде до 0.39 мкМ.

Капустный сок также изначально содержал высокие концентрации DA (2 мкМ), и в данной среде поглощение DA осуществлялась всеми штаммами, причем наиболее активно штаммом L. acidophilus ACT-41, снижавший уровень DA в среде до 28 нМ.

Норадреналин (NA), продукт гидроксилирования DA по боковой цепи, содержался в концентрации около 10 нМ в ГМ. Конверсия DOPA → DA → NA функционировала, судя по повышению уровня NA в среде до концентраций около 0.2 мкМ, у всех тестированных бактериальных штаммов. Следует отметить, что синтез субмикромолярных количеств NA на гидролизате молока всеми тестированными штаммами лактобацилл, кроме Lactobacillus casei K3III24, показан ранее (Олескин и соавт., 2014; Oleskin et al., 2014), но среди изученных в работе (Vodolazov et al., 2018) лактококков, статистически достоверный синтез NA (более 1 мкМ) детектирован лишь у штамма L. lactis subsp. lactis F-116.

МПБ изначально содержал более высокую (около 100 нМ) концентрацию NA, и в этих условиях принцип Ле Шателье работал в сторону поглощения NA из среды всеми штаммами, кроме L. lactis subsp. cremoris LL-52, существенно не менявшего концентрацию NA.

Сусло не содержало NA, побуждая многие штаммы бактерий (кроме L. lactis subsp. cremoris 36c) реализовать отмеченный принцип в сторону повышения уровня NA до концентраций от 55 нМ (S. salivarius thermophilus CT 160) до максимально 0.5 мкМ (тот же вид, штамм ТР 20); этот факт наглядно демонстрирует штаммовую специфичность уровней синтеза нейроактивных соединений, которая имеет серьезные биотехнологические последствия (см. раздел “Обсуждение”).

В капустном соке, имеющем изначально субмикромолярный уровень NA (0.16 мкМ), как и в МПБ, наблюдали поглощениe NA только у трех штаммов (виды L. acidophilus и L. lactis. subsp. lactis), которые снизили концентрацию NA до нуля. При этом остальные тестированные штаммы не снижали уровня NA в среде. Один штамм (L. lactis subsp. cremoris 36c) даже повысил уровень NA до 0.4 мкМ. Вероятное объяснение кроется в особых свойствах растительных соков, которые активно связывают нейромедиаторы, маскируя их для микроорганизмов и, тем самым, препятствуя запуску программ поддержания гомеостаза.

Адреналин (А) синтезировался в низких концентрациях (10‒30 нМ) всеми изученными штаммами при культивировании на ГМ, который не содержал А до инокуляции; при росте на МПБ и сусле (которые также не содержали А) наблюдались более высокие концентрации А, достигавшие максимально 0.15 мкМ на МПБ и 0.85 мкМ на сусле в случае штаммов подвида L. lactis subsp. lactis (штаммы LLN-E2 и 125 соответственно).

Капустный сок содержал много А (2.4 мкМ), и, следуя принципу Ле Шателье, все штаммы, кроме S. salivarius thermophilus CT 14, поглощали А из среды с разной степенью активности. В случае штамма L. acidophilus ACT-41 в среде совсем не оставалось А.

Распад катехоламинов идет под действием двух типов ферментов: моноаминооксидаз (МАО) и катехол-О-метилтрансфераз (КОМТ). Превращение DA под воздействием МАО дает дигидроксифенилуксусная кислоту (DOPAC), которая в концентрациях порядка десятков нМ присутствовала в культурах всех тестированных в настоящей работе штаммов при росте на ГМ, содержащем изначально 5 нМ DOPAC.

Дополнительного выделения DOPAC в среду, однако, не наблюдалось на МПБ, где уже до инокуляции содержалось несколько больше (37 нМ) DOPAC, что, возможно, также объяснимо с позиций принципа Ле Шателье.

DOPAC также представляется применимым к культурам на сусле, где в полном отсутствии средового DOPAC наблюдался его активный синтез до концентраций в десятки или сотни нМ (“чемпионом” выступала культура L. lactic subsp. cremoris LL-52, выделившая 0.33 мкМ DOPAC; она также единственная из всех тестированных культур синтезировала небольшое дополнительное количество DA на фоне его 3.6 мкМ в сусле).

Наконец, на капустном соке многие штаммы дополнительно обогащали среду DOPAC, несмотря на его изначально высокую концентрацию (0.69 мкМ), особенно штамм L. lactis subsp. lactis B-102, в культуре которого содержалось 2.2 мкМ DOPAC. Как уже отмечено выше, капустный сок связывает нейромедиаторы и их метаболиты, поэтому гомеостазные механизмы бактерий могут не распознавать имеющиеся в связанном виде концентрации DOPAC. Интересно, что другой испытанный штамм вида L. lactis subsp. lactis – штамм 125 – был в числе немногих штаммов, поглощавших DOPAC, причем именно данный штамм снижал концентрацию DOPAC в среде до нуля. Эти различия штаммов одного вида показывают биотехнологический потенциал тестированных видов как биотехнологических продуцентов, “биофабрик нейромедиаторов” (см. раздел “Обсуждение”), ибо причинение незначительных изменений – на уровне штаммов одного вида – оказывается достаточным для резкого повышения выхода целевого нейромедиатора.

Отметим, что аналогичная логика на базе принципа Ле Шателье приложима к ранее полученным данным о синтезе DOPAC лактобациллами. В присутствии всех тестированных бактериальных штаммов, концентрации DOPAC возрастали в 3‒5 раз на молоке. Напротив, культивация штаммов лактобацилл на пакреатическом гидролизате молока, изначально содержавшем много DOPAC (~1 мкМ), вела к снижению концентрации DOPAC в 1.5‒10 раз (Oleskin et al., 2014).

Действие фермента КОМТ на DA дает 3-метилтирамин (3-МТ). Все использованные в настоящей работе штаммы, выращенные на ГМ и МПБ имели КОМТ: они обогащали лишенные 3-МТ среды примерно 10 нМ (на ГМ) или порядка 100 нМ (на МПБ) этого соединения.

Иная картина наблюдалась на сусле и капустном соке с изначальной концентрацией 3-МТ 88 и 18 нМ соответственно: все испытанные штаммы, кроме двух штаммов подвида L. lactis subsp. cremoris и штамма L. delbrueckii subsp. bulgaricus БГ-G на сусле и только штамма БГ-G на капустном соке, активно поглощали 3-МТ, причем 8 штаммов снижали уровень 3-МТ до нуля на сусле и все штаммы (кроме БГ-G) на капустном соке. Капустный сок, по-видимому, не был способен связывать 3-МТ, другие нейроактивные агенты.

Оба отмеченных метаболита дофамина – DOPAC и 3-МТ далее энзиматически превращаются в финальный продукт пути катехоламинов – гомованилиновую кислоту (HVA). Она отсутствовала до инокуляции в средах ГМ и МПБ. При концентрационном разбросе от 0.1 до 290 нМ она выделялась в эти среды тестируемыми бактериальными штаммами.

Трудно объяснить явление “сверхсинтеза” некоторыми штаммами HVA на сусле (236 нМ до инокуляции), где штаммы подвида L. lactis subsp. lactis и штамм L. delbrueckii subsp. bulgaricus VG-9 продуцировали 47‒60 мкМ HVA. В биотехнологическом плане это кандидаты на роль биофабрик нейромедиаторов.

Однако на капустном соке (16 мкМ до инокуляции) активно работали механизмы поглощения HVA, особенно у штамма L. acidophilus AE-5, снижавшего уровень HVA в среде до 0.24 мкМ.

Серотонин, его предшественник и продукт метаболизма. Серотонин (5-гидрокситриптамин), 5-НТ, относится к классу триптаминов. Он образуется в животном организме из аминокислоты триптофана путем  ее последовательного ферментативного 5‑гидроксилирования и последующего декарбоксилирования получившегося 5-гидрокситриптофана. В растительных тканях описан альтернативный путь синтеза 5-НТ по принципу: триптофан → → триптамин → 5-НТ (Рощина, 1991).

5-Гидрокситриптофан (5-НТР). В ранее проведенных исследованиях на лактобациллах и лактококках не удалось получить достоверные данные о синтезе 5-НТР этими бактериями (Oleskin et al., 2014; Vodolazov et al., 2018). В настоящей работе на средах ГМ и МПБ (не содержавших 5-НТР) наблюдали выделение в среду небольших количеств (1‒40 нМ) 5-НТР всеми изученными штаммами. Возможно, бактерии синтезировали большие количества 5-НТР и частично трансформировали его в 5-НТ и далее в продукт его деградации (5-HIAA, см. ниже). Исключение представлял штамм L. delbrueckii subsp. bulgaricus VG-9, при росте которого на МПБ не обнаружено достоверное содержание 5-НТР.

Серотонин (5-НТ), непосредственный продукт 5-НТР, у всех тестированных культур присутствовал примерно в том же диапазоне концентраций (2‒30 нМ), что его предшественник, на средах ГМ и МПБ, исходно лишенных 5-НТ.

Однако способность к синтезу пусть и невысоких количеств серотонина не универсальна в микробном мире. Предшествующие исследования говорят о штаммоспецифическом характере этой способности. Из исследованных ранее видов и штаммов лактобацилл, лишь штамм Lactobacillus helveticus 100аш выделял в среду 5-НТ, зато в сравнительно высоких концентрациях (0.4‒0.5 мкМ) (Oleskin et al., 2014). Из длинного списка изученных методом ВЭЖХ прокариот наличие 5-ГТ в биомассе было показано только у граммположительных бактерий Bacillus subtilis и Staphylococcus aureus в концентрациях порядка 1 мкМ (Цавкелова и соавт., 2000).

Сусло и капустный сок до инокуляции содержали субмикромолярные концентрации 5-HT (0.92 и 0.35 мкМ соответственно). На сусле мы не детектировали достоверного изменения средовых концентраций 5-НТ при культивировании всех тестированных штаммов. Большинство штаммов при культивировании на капустном соке также существенно не влияли на эти средовые концентрации 5-HT, кроме штаммов L. lactis subsp. lactis LLN-E2 и L. lactis subsp. cremoris LL-52, обогащавших среду субмикромолярными количествами 5‑НТ, а также обоих исследованных штаммов L. acidophilus, активно поглощавших 5-НТ из среды.

5-Гидроксииндолилуксусная кислота (5-HIAA). Ферментативное окисление серотонина с помощью МАО приводит к формированию 5-гидроксииндолилуксусной кислоты (5-HIAA). Аналогично самому 5-НТ, 5-HIAA при культивировании тестированных в данной работе штаммов на ГМ и МПБ образуется в этих средах в низких (наномолярных) концентрациях (исключение представляли штамм L. lactis subsp. cremoris LL-52 на ГМ и L. delbrueckii subsp. bulgaricus VG-9 на МПБ, вовсе не выделявшие 5-HT в среду). При культивировании на исходно богатых 5-HIAA средах – сусле и капустном соке – мы наблюдали дальнейшее накопление 5-HIAA в них: всеми штаммами в случае сусла и большинством (кроме 4 штаммов) на капустном соке.

В целом, полученные данные свидетельствуют о функционировании у изученных бактериальных видов и штаммов “животных” путей синтеза и деградации катехоламинов и индоламина (серотонина).

ОБСУЖДЕНИЕ

Настоящая работа служит продолжением ряда исследований микробного синтеза нейроактивных соединений, в частности, биогенных аминов (БА). Ранее показано, что заквасочные штаммы лактобацилл (Lactobacillus helveticus 100аш, L. helveticus NK-1, L. casei K3III24 и L. delbrueckii subsp. bulgaricus) различались уровнем накопления нейромедиаторов: DA синтезировали только L. helveticus NK-1 и L. delbrueckii subsp. bulgaricus; все штаммы, кроме L. casei К3III24, обогащали среды NA. Штаммы также образовывали DOPA. Серотонин детектирован в культуральной жидкости L. helveticus 100аш, но не у остальных тестированных в цитируемых работах лактобацилл (Олескин и соавт., 2014; Oleskin et al., 2014). В литературе представлены данные о синтезе 5-НТ Lactococcus lactis subsp. cremoris MG 1363, L. lactis subsp. lactis IL 1403, Lactobacillus plantarum NCFB2392 (Özogul et al., 2012).

Значение настоящего исследования на фоне более ранних авторских и литературных данных состоит, во-первых, в том, что у 13 штаммов 5 видов прокариот, взаимодействующих с человеческим организмом в ролях симбионтов и/или пробиотиков, прослежены пути синтеза и деградации 1) катехоламинов и 2) серотонина. В целом, эти энзиматические пути соответствуют классическим путям, реализуемым в организмах животных и человека. Для катехоламинов они включают этапы синтеза: DOPA → DAА → NA → А, а деградация DA реализуется в двух вариантах: DA → DOPAC → → HVA и DA → 3-МТ → HVA (рис. 1 и 2).

Во-вторых, в результате исследования показана зависимость уровня накопления нейроактивных соединений от состава питательной среды. В частности, на гидролизате молока, содержащем, в отличие от других сред, DA, выражены как его синтез из предшественника DOPA, так и дезаминирование с образованием DОРАС. На МПБ, напротив, выражен путь превращения DA в 3-МТ, а затем в HVA. Обогащение среды МПБ NA подавляло его синтез, в противоположность этому был очень выражен синтез NA при росте бактерий на ГМ. Выше мы уже интерпретировали этот факт как свидетельство реализации принципа Ле Шателье и стремление системы сохранить состояние гомеостаза. При этом на МПБ отмечено большее накопление А, чем на ГМ. Путь синтеза нейробиотиков из L-триптофана был более выражен при росте бактерий на МПБ, где основным продуктом был 5-НТ, тогда как на молоке отмечено его дезаминирование в 5-HIAA. Для большинства штаммов L. lactis subsp. cremoris на сусле также в значительной степени выражен путь DA → А и путь DA → DОРАС, но это не всегда приводит к накоплению в среде HVA. Однако во всех случаях при росте на сусле количество образовавших нейромедиаторов было значительно (на порядок) больше чем при культивировании на ГМ и МПБ.

В цепи нейроактивных соединений, берущих начало от триптофана, при культивировании МКБ на сусле, также отмечен интенсивный синтез, в результате которого содержание серотонина в среде значительно превышает концентрацию этого нейромедиатора при использовании в качестве среды ГМ и МПБ. Количество серотонина и продукта его распада 5-HIAA в сусле на порядок выше, чем в ГМ и МПБ, причем это характерно для всех исследованных штаммов, за исключением одного штамма L. lactis subsp. cremoris 18АК, при культивировании которого в среде снижалось содержание 5-HIAA. При культивировании этого штамма на капустном соке, характеризующемся высоким содержанием соединений типа DA, А, HVA, 5-НТ, количество этих соединений в случае DA и HVA на два порядка превышало содержание этих соединений в ГМ и МПБ.

В-третьих, в настоящей работе рельефно выступила зависимость образующихся соединений от таксономической принадлежности МКБ. Так, для L. delbrueckii subsp. bulgaricus наблюдался значительный прирост DA и продукта его распада DОРАC, а также накопление А в количествах, значительно превышающих его образование при выращивании на МПБ и ГМ. При культивировании L. acidophilus происходило поглощение DA из среды, синтез А отсутствовал. Поглощение DA сопровождалось увеличением количества продуктов его распада DОРАС и HVA. S. salivarius при культивировании на сусле характеризовался высокой активностью синтетических процессов в цепи DA → NA → А. Количество образовавшихся БА было значительно больше на сусле, чем при культивировании на ГМ и МПБ. L. lactis также проявлял значительно более высокую синтетическую активность в цепи DA → А при выращивании на сусле в сравнении с ГМ и МПБ. Также необходимо отметить выраженный путь DA → ДОРАС → → HVA, который приводит к накоплению в среде больших количеств HVA.

В-четвертых, в рамках понятия “таксономическая принадлежность” следует особо очертить роль штаммовых различий. Так, два штамма одного и того же вида S. salivarius thermophilus СТ 160 и ТР 20- отличались по выходу NA на одной и той же среде (сусле) в ~10 раз (55 и 508 нМ). При культивировании на капустном соке штаммы L. lactis subsp. lactis демонстрировали диаметрально противоположные активности – штамм В-102 повышал уровень средового DOPAC на примерно 1.5 мкМ, а штамм 125 снижал этот уровень до нуля. Подобные факты имеют биотехнологический потенциал. Селекция на штаммовом уровне или сравнительно небольшое по объему генноинженерное вмешательство могут резко поднять эффективность синтеза интересующих нас продуктов, к числу которых, несомненно, принадлежат имеющие многочисленные применения в медицине и психиатрии нейроактивные соединения.

Понятно, что потенциально многообещающая идея превращения продуцирующих нейромедиаторы микроорганизмов в “биофабрики” нейромедиаторов (их предшественников, метаболитов, агонистов) наталкивается на проблему концентрации микробных нейромедиаторов: в большинстве случаев они слишком низки для биотехнологического производства (Олескин и соавт., 2020). В наших опытах речь идет пока лишь о микромолях или даже наномолях нейроактивных соединений. Тем не менее, современные эффективные методы селекции, в том числе с использованием генетической инженерии в современной биотехнологии, в принципе, дают нам основания ожидать создания суперпродуцентов ценных нейромедиаторов (и родственных биологически активных соединений).

Успешные примеры создания подобных суперпродуцентов касаются нейроактивных аминокислот. Так, поиски эффективных продуцентов γ‑ами-номасляной кислоты (ГАМК) и оптимизация условий их культивирования привели к созданию суперпродуцентов этой аминокислоты (Олескин и соавт., 2020; Oleskin, Shenderov, 2020). Высокопродуктивными оказались стартерные культуры лактобацилл и бифидобактерий, изолированные из ЖКТ людей, проживающих в Центральном регионе России. Штамм Bifidobacterium adolescentis 150 продуцировал до 5.6 г/л ГАМК, что соответствует примерно 50 мM ГАМК (Юнес, 2017).

Среди тестированных в настоящей работе штаммов выделяются продуцирующие субмикромолярные (>0.1 мкМ) концентрации нейромедиаторов на определенных средах. Например, в плане синтеза NA таковыми были все выращенные на гидролизате молока штаммы L. lactis subsp. lactis (при почти двукратных межштаммовых различиях), что полностью согласуется с ранее полученными данными для других штаммов того же подвида (где “чемпионом” был штамм F-116 c выходом 1.9 мкМ; Vodolazov et al., 2018). Два из трех исследованных в данной работе штамма L. acidophilus продуцировали более 0.1 мкМ дофамина на среде МПБ. Подобные субмикромолярные концентрации являются физиологически активными как для организма человека (в случае использования соответствующих МКБ как пробиотиков), так и внутри микробного сообщества.

Необходимо отметить, что многие нейромедиаторы одновременно функционируют в качестве коммуникативных сигналов у микроорганизмов. “Общение” между микробными клетками посредством нейромедиаторов носит двусторонний характер – они и продуцируют эти сигналы, и реагируют на них. Важно подчеркнуть, что они влияют на рост различных представителей симбиотической и паразитической микробиоты организма человека. Катехоламины стимулируют также рост симбиотических штаммов E. coli (Freestone et al., 2007; Ану-чин и соавт., 2008) и дрожжей Saccharomyces ce-revisiae (Маликина и соавт., 2010; Oleskin et al., 2010).

В то же время нейромедиаторы стимулируют рост и, в некоторых системах, образование токсинов у многих патогенных микроорганизмов, например, Yersinia enterocolitica, энтеротоксических, энтерогеморрагических штаммов E. coli, Shigella spp., Salmonella spp., Pseudomonas aeruginosa, Bordetella pertussis, B. bronchiseptica, Aeromonas hydrophila, Helicobacter pylori, Haemophilus influenza, Klebsiella pneumonia (Олескин и соавт., 2016, 2020; Oleskin, Shenderov, 2020). Некоторые из нейромедиаторов распознаются микроорганизмами, как сигналы QS-систем. Этим объясняются механизмы стимуляторного действия катехоламинов на рост, формирование биопленок и другие процессы у микроорганизмов, у которых обнаружены функциональные аналоги адренорецепторов, такие как киназы QseC и QseE у E. coli (Clarke et al., 2006; Hughes et al., 2009). Серотонин также выступает как сигнал одной из QS-систем P. aeruginosa (Knecht et al., 2016).

Дальнейшее рассмотрение широчайшего спектра сигнальных и регуляторных эффектов нейроактивных соединений в микробном мире лежит за пределами настоящей экспериментальной работы (Олескин и соавт., 2016, 2020; Oleskin et al., 2017; Oleskin, Shenderov, 2019, 2020).

Весьма важным аспектом микробной продукции нейроактивных соединений является воздействие производимых микробиотой нейроактивных соединений на человеческий организм, в особенности на его нервную систему. “Мы зависим от мириадов важнейших нейрохимических факторов, производимых микробами” (Dinan et al., 2015). Так, серотонергическая (зависимая от нейромедиатора серотонина) система головного мозга, ведающая многими аспектами эмоционального поведения, не может развиваться в полной мере при отсутствии микробиоты (Clarke et al., 2013). Из числа продуцируемых микроорганизмами нейрохимических факторов особое значение имеют те вещества, которые способны проходить через два барьера – барьер между кишечной слизистой и кровотоком и барьер между кровотоком и мозгом (гемато-энцефалический барьер, ГЭБ).

Что касается детектированных в настоящей работе нейроактивных соединений, то способностью проникать через указанные барьеры обладает DOPA. Это представляет интерес в рамках понимания оси микробиота‒кишечник‒мозг, ибо вырабатывающие DOPA микроорганизмы, как пробиотические (лактобациллы), так и потенциально патогенные, включая Bacillus cereus (Шишов, 2010; Oleskin et al., 2010), могут вызывать у контактирующего с ними индивида состояние эйфории в результате превращения микробной DOPA в дофамин в мозге. В нашем исследовании максимальные (субмикромолярные) концентрации DOPA получены в случае штамма S. salivarius thermophilus TP20- на гидролизате молока. Необходимо отметить, что S. salivarius thermophilus рассматриваются как условные патогены. При этом они являются важными пробиотиками для гигиены ротовой полости (предотвращения инфекций), а также для поддержания иммунитета против Staphylococcus pyogenes.

Другие, неспособные преодолеть ГЭБ, нейроактивные вещества – катехоламины, серотонин, тем не менее, могут оказывать важное локальное действие на уровне желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), если привносятся в организм с пробиотиками или вырабатываются резидентной микробиотой. Подчеркнем, что уже наномолярные и тем более субмикромолярные концентрации NA или DA имеют физиологическое значение и сопоставимы с концентрациями нейромедиаторов в физиологических жидкостях организма. В частности, кровь человека в среднем содержит 1‒10 нМ DA (в свободной форме, есть также 0.2‒0.3 мкМ сульфоконъюгированного DA) и примерно 0.1 мкМ NA, а также 0.5‒1.5 мкМ 5-НТ (Eldrup, 2004; McPherson, Pincus, 2011).

В кишечнике микробные нейромедиаторы прямо взаимодействуют с содержащей около 0.5 млн нервных клеток энтеральной нервной системой (ЭНС), которая взаимодействует с головным мозгом посредством блуждающего нерва (nervus vagus). Микробные нейромедиаторы действуют на центральную нервную систему также посредством иммунной системы, которая вырабатывает нейроактивные факторы. Иммунная система находится под непосредственным влиянием химических продуктов кишечной микробиоты, поскольку в стенке кишечника расположен ее важный отдел (gut-associated lymphoid tissue, GALT). В частности, катехоламины способны оказывать иммуносупрессорное и противовоспалительное действие, хотя их эффекты на иммунную систему носят сложный и не до конца изученный характер (Олескин и соавт., 2020; Oleskin et al., 2017; Oleskin, Shenderov, 2020).

Подводя итог полученным в настоящей работе результатам, мы можем констатировать, что симбиотические и пробиотические штаммы, выращенные на органических средах в условиях, приближенных к физиологическим, способны продуцировать физиологически значимые концентрации важнейших нейромедиаторов, их предшественников и метаболитов. Последние должны оказывать существенное влияние на человеческий организм с его иммунной и нервной системами, а также на населяющую организм микробиоту в норме и патологии. Представленные данные имеют определенный биотехнологический потенциал, поскольку создают предпосылки для создания суперпродуцентов нейроактивных соединений (“микробных биофабрик”).

Список литературы

  1. Анучин А.М., Чувелев Д.И., Кировская Т.А., Олескин А.В. Действие нейромедиаторных моноаминов на ростовые характеристики Escherichia coli К-12 // Микробиология. 2008. Т. 77. С. 758–765.

  2. Anuchin A.M., Chuvelev D.I., Kirovskaya T.A., Oleskin A.V. Effects of monoamine neuromediators on the growth-related variables of Escherichia coli K-12 // Microbiology (Moscow). 2008. V. 77. P. 674‒680.

  3. Жиленкова О.Г., Шендеров Б.А., Клодт П.М., Кудрин B.C., Олескин А.В. Молочные продукты как потенциальный источник соединений, модифицирующих поведение потребителей // Молочная промышленность. 2013. № 10. С. 16‒19.

  4. Маликина К.Д., Шишов В.И., Чувелев Д.И., Кудрин В.С., Олескин А.В. Регуляторная роль нейромедиаторных аминов в клетках Saccharomyces cerevisiae // Прикл. биохимия и микробиология. 2010. Т. 46. С. 672‒677.

  5. Malikina K.D., Shishov V.A., Chuvelev D.I., Kudrin V.S., Oleskin A.V. The regulatory role of monoamine neuromediators in Saccharomyces cerevisiae cells // Appl. Biochem. Microbiol. 2010. V. 46. P. 620‒626.

  6. Олескин А.В., Кировская Т.А., Ботвинко И.В., Лысак Л.В. Действие серотонина (5-окситриптамина) на рост и дифференциацию микроорганизмов // Микробиология. 1998. Т. 67. С. 306–311.

  7. Oleskin A.V., Kirovskaya T.A., Botvinko I.V., Lysak L.V. Effects of serotonin (5-hydroxytryptamine) on the growth and differentiation of microorganisms // Microbiology (Moscow). 1998. V. 67. P. 251‒257.

  8. Олескин А.В., Жиленкова О.Г., Шендеров Б.А., Амерханова A.M., Кудрин B.C., Клодт П.М. Заквасочные культуры лактобацилл − продуценты нейромедиаторов: биогенных аминов и аминокислот // Молочная промышленность. 2014. № 9. С. 42‒43.

  9. Олескин А.В., Эль-Регистан Г.И., Шендеров Б.А. Ме-жмикробные химические взаимодействия и диалог микробиота‒хозяин: роль нейромедиаторов // Микробиология. 2016. Т. 85. С. 3‒25.

  10. Oleskin A.V., El’-Registan G.I., Shenderov B.A. Role of neuromediators in the functioning of the human microbiota: “business talks” among microorganisms and the microbiota‒host dialogue // Microbiology (Moscow). 2016. V. 85. P. 1‒22.

  11. Олескин А.В., Шендеров Б.А., Роговский В.С. Социальность микроорганизмов и взаимоотношения в системе микробиота-хозяин: роль нейромедиаторов. М.: Изд-во МГУ, 2020. 288 с.

  12. Рощина В.В. Биомедиаторы в растениях. Ацетилхолин и биогенные амины. Пущино: Биологический Центр АН СССР, 1991. 192 с.

  13. Теппер Е.З., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии: учебное пособие для студентов вузов. 5-е изд. М.: Дрофа, 2004. 256 с.

  14. Цавкелова Е.А., Ботвинко И.Б., Кудрин В.С., Олескин А.В. Детекция нейромедиаторных аминов у микроорганизмов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Докл. Росс. Акад. Наук. 2000. Т. 372. С. 840‒842.

  15. Шендеров Б.А. Микробная экология и ее роль в поддержании здоровья // Метаморфозы. 2014а. № 5. С. 72‒80.

  16. Шишов В.А., Кировская Т.А., Кудрин В.С., Олескин А.В. Нейромедиаторные амины, их предшественники и продукты окисления в биомассе и супернатанте культуры Escherichia coli К-12 // Прикл. биохимия и микробиология. 2009. Т. 45. С. 550‒554.

  17. Shishov V.A., Kirovskaya T.A., Kudrin V.S., Oleskin A.V. Amine neuromediators, their precursors, and oxidation products in the culture of Escherichia coli K-12 // Appl. Biochem. Microbiol. 2009. V. 45. P. 489‒493.

  18. Шишов В.А. Биогенные амины в динамике роста микроорганизмов. Автореф. дис. … канд. биол. наук. М.: МГУ, 2010.

  19. Юнес Р.А. Адаптивное значение для человека бактерий рода Lactobacillus и рода Bifidobacterium. Автореф. дис. … канд. биол. наук. М.: РУДН, 2017.

  20. Barbara G., Stanghellini V., Brandi G., Cremon C., Nardo G., Giorgio R., Corinaldesi R. Interactions between commensal bacteria and gut sensorimotor function in health and disease // Am. J. Gastroenterol. 2005. V. 100. P. 2560‒2568.

  21. Bercik P., Park A.J., Sinclair D., Khoshdel A., Lu J., Huang X., Deng Y., Blennerhassett A., Fahnestock M., Moine D. et al. The anxiolytic effect of Bifidobacterium longum NCC3001 involves vagal pathways for gut-brain communication // Neurogastroenterol. Motile. 2011. V. 23. P. 1132‒1139.

  22. Bravo J.A., Forsythe P., Chew M.V., Cryan J.F. Ingestion of Lactobacillus strain regulates emotional behavior and central GABA receptor expression in a mouse via the vagus nerve // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. V. 108. P. 16050‒16055. https://doi.org/10.1073/pnas.1102999108

  23. Carabottia M., Sciroccoa A., Masellib M.A., Severia C. The gut-brain axis: interactions between enteric microbiota, central and enteric nervous systems // Ann. Gastroenterol. 2015. V. 28. P. 203‒209.

  24. Clarke M.B., Hughe D.T., Zhu C., Boedeker E.C., Sperandio V. The QseC sensor kinase: a bacterial adrenergic receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 10420‒10425.

  25. Clarke G., Grenham S., Scully P., Fitzgerald P., Moloney R.D., Shanahan F., Dinan T.G., Cryan J.F. The microbiome-gut-brain axis during early life regulates the hippocampal serotonergic system in a sex-dependent manner // Mol. Psychiatry. 2013. V. 18. P. 666‒673.

  26. Dhakal R., Bajpai V.K., Baek K.H. Production of GABA (γ‑aminobutyric acid) by microorganisms: a review // Braz. J. Microbiol. 2012. V. 43. P. 1230‒1241.

  27. Dinan T.G., Stilling R.M., Stanton C., Cryan J.F. Collective unconscious: how gut microbes shape human behavior // J. Psych. Res. 2015. V. 63. P. 1‒9.

  28. Eldrup E. Significance and origin of DOPA, DOPAC, and dopamine sulfate in plasma tissue, and cerebrospinal fluid // Dan. Med. Bull. 2004. V. 31. P. 34‒62.

  29. Foster J.A., McVey Neufeld K.A. Gut-brain axis: how the microbiome influences anxiety and depression // Trends Neurosci. 2013. V. 36. P. 305‒312.

  30. Foster J.A., Lyte M., Meyer E., Cryan J.F. Gut microbiota and brain function: an evolving field in neuroscience // Int. J. Neuropsychopharmacol. 2016. V. 19. https://doi.org/10.1093/ijnp/pyv114

  31. Freestone P.P.E., Haigh R.D., Lyte M. Blockade of catecholamine-induced growth by adrenergic and dopaminergic receptor antagonists in Escherichia coli O157:H7, Salmonella enterica and Yersinia enterocolitica // BMC Microbiol. 2007. V. 7. https://doi.org/10.1186/1471-2180-7-8

  32. Gordon J.I. Honor thy gut symbionts redux // Science. 2012. V. 336. P. 1251‒1253.

  33. Heijtz R.D., Wang S., Anuar F., Qian Y., Bjorkholm B., Samuelsson A., Hibberd M.L., Forssberg H., Pettersson S. Normal gut microbiota modulates brain development and behavior // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. V. 108. P. 3047‒3052.

  34. Hoffmann F. La Roche Ltd Roche Biochemical Pathways, 4th edn. Part 1: Metabolic Pathways 01.01.2014 // http://biochemical-pathways.com/#/map/1

  35. Hughes D.T., Clarke M.B., Yamamoto K., Rasko D.A., Sperandio V. The QseC adrenergic signaling cascade in enterohemorrhagic E. coli (EHEC) // PLoS Pathogen. 2009. V. 5. e1000553.

  36. Knecht L.D., O’Connor G.O., Mittal R., Liu X.Z., Daftarian P., Deo S.K., Daunert S. Serotonin activates bacterial quorum sensing and enhances the virulence of Pseudomonas aeruginosa in the host // EBioMedicine. 2016. V. 9. P. 161‒169.

  37. Lim H.S., Cha I.-T., Lee H., Seo M.-J. Optimization of γ‑aminobutyric acid production by Enterococcus faecium JK29 isolated from a traditional fermented foods // Microbiol. Biotechnol. Lett. 2016. V. 44. P. 26‒33.

  38. McPherson R.A., Pincus M.R. Henry’s clinical diagnosis and management by laboratory methods. Philadelphia: Elsevier Saunders, 2011.

  39. Naseribafrouei A., Hestad K., Avershina E., Sekelja M., Linlokken A., Wilson R., Rudi K. Correlation between the human fecal microbiota and depression // Neurogastroenterol. Motil. 2014. V. 26. P. 1155‒1162.

  40. Nicholson J.K., Holmes E., Kinross J., Burcelin R., Gibson G., Jia W., Pettersson S. Host-gut microbiota metabolic interactions // Science. 2012. V. 336. P. 1262‒1267.

  41. Oleskin A.V., Malikina K.D., Shishov V.A. Symbiotic biofilms and brain neurochemistry. Hauppauge, N.Y.: Nova Science Publ., 2010.

  42. Oleskin A.V., Zhilenkova O.G., Shenderov B.A., Amerhanova A.M., Kudrin V.S., Klodt P.M. Lactic-acid bacteria supplement fermented dairy products with human behavior-modifying neuroactive compounds // J. Pharm. Nutrit. Sci. 2014. V. 4. P. 199‒206.

  43. Oleskin A.V., Shenderov B.A., Rogovsky V.S. Role of neurochemicals in the interaction between the microbiota and the immune and the nervous system of the host organism // Probiot. Antimicrob. Proteins. 2017. V. 9. P. 215‒234.

  44. Oleskin A.V., Shenderov B.A. Probiotics and psychobiotics: the role of microbial neurochemicals // Probiot. Antimicrob. Proteins. 2019. V. 11. P. 1071‒1085.

  45. Oleskin A.V., Shenderov B.A. Microbial Communication and Microbiota-Host Interactivity: Neurophysiological, Biotechnological, and Biopolitical Implications. Hauppauge (N.Y.): Nova Science Publishers, 2020.

  46. Özogul F. Production of biogenic amines by Morganella morganii, Klebsiella pneumonia and Hafnia alvii using a rapid HPLC method // Europ. Food Res.Technol. 2004. V. 219. P. 465‒469.

  47. Özogul F., Kuley E., Özogul Y., Özogul I. The function of lactic acid bacteria on biogenic amines production by food-borne pathogens in arginine decarboxylase broth // Food Sci. Technol. Res. 2012. V. 18. P. 795–804.

  48. Ravel J., Gajer P., Abdo Z., Schneider G.M., Koenig S.S.K., McCulle S.L., Karlebach Sh., Gorle R., Russell J., Tacket C.C., Brotman R.M., Davis C.C., Ault K., Peralta L., Forney L. Vaginal microbiome of reproductive-age women // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. V. 108. Suppl. 1. P. 4680‒4687.

  49. Siragusa S., Angelis M.D., Cagno R.D., Rizzello C.G., Coda R., Gobbetti M. Synthesis of γ-aminobutyric acid by lactic acid bacteria isolated from a variety of Italian cheeses // A-ppl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P. 7283‒7290.

  50. Tsigos C., Chrousos G.P. Hypothalamic-pituitary-adrenal axis, neuroendocrine factors and stress // J. Psychosom. Res. 2002. V. 53. P. 865‒871.

  51. Vodolazov I.R., Dbar S.D., Oleskin A.V., Stoyanova L.G. Exogenous and endogenous neuroactive biogenic amines // Appl. Biochem. Microbiol. 2018. V. 54. P. 603–610.

  52. Zhao A., Hu X., Pan L., Wang X. Isolation and characterization of a gamma-aminobutyric acid producing strain Lactobacillus buchneri WPZ001 that could efficiently utilize xylose and corncob hydrolysate // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015. V. 99. P. 3191‒3200.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал