Микробиология, 2022, T. 91, № 5, стр. 631-637

Наиболее перспективные современные технологии очистки сточных вод от фосфора основаны на биологической очистке с использованием активного ила, формирующегося в биореакторах непрерывного или последовательно-периодического действия (sequencing batch reactor, SBR). Способность к удалению фосфора обусловлена функционированием фосфат-аккумулирующих организмов (ФАО) – физиологической группой микроорганизмов, способных к циклическому поглощению‒высвобождению фосфатов и накоплению фосфора в виде полифосфатов при чередовании анаэробной и аэробной фаз культивирования. Динамика формирования фосфат-аккумулирующего микробного сообщества, его состав и пространственная организация во многом определяются режимами работы реакторов (Weissbrodt et al., 2013; Gómez-Basurto et al., 2019; Zhou et al., 2019). Исследованию ФАО, разработке и оптимизации режимов работы биореакторов, обеспечивающих эффективную очистку сточных вод от фосфора, посвящено большое количество работ (Izadi et al., 2020; Roy et al., 2021; Rajesh Banu et al., 2021). В России такие исследования были начаты недавно (Пелевина и соавт., 2021).

В задачу наших исследований входило получение обогащенного ФАО микробного сообщества с высокой плотностью биомассы, исследование динамики клеточных фосфатов с использованием спектроскопии комбинационного рассеяния (КР-спектроскопия), определение таксономического состава сообщества и доминирующих представителей ФАО.

Культивирование микробного сообщества проводили в лабораторном реакторе (SBR) с рабочим объемом 2 л. Основные характеристики биореактора описаны ранее (Пелевина и соавт., 2021). В настоящей работе режим SBR включал фазу отстаивания, что обеспечило получение высокой плотности биомассы. Каждый SBR-цикл включал пять последовательных фаз: 1) подача среды в анаэробных условиях – 30 мин; 2) анаэробная фаза потребления субстрата – 2 ч 25 мин; 3) аэробная фаза роста биомассы – 2 ч 30 мин; 4) фаза отстаивания – 30 мин; 5) слив надосадочной жидкости – 5 мин. В каждом SBR-цикле проводили замену 0.8 л среды, обеспечивая гидравлическое время пребывания 15 ч. Для удаления избыточной (приросшей) биомассы, в каждом 28-ом SBR-цикле исключали фазу отстаивания, и отводили часть биомассы вместе со сливной жидкостью, поддерживая среднее время удержания биомассы 17.5 сут. Выращивание проводили при оптимальных для развития ФАО условиях: температура 18°С, рН 7.5–8.2, источник углерода и энергии – ацетат, соотношение фосфора к ацетату в среде ‒ 0.09 моль/моль (Lopez-Vazquez et al., 2010; McMahon et al., 2010).

В работе использовали синтетическую среду следующего состава (г/л): CH₃COONa (3H₂O) – 0.670; (NH₄)₂SO₄ – 0.139; КH₂PO₄ – 0.109; дрожжевой экстракт – 0.009; MgSO₄ · 7H₂O – 0.150; раствор микроэлементов – 1 мл/л. Состав раствора микроэлементов (г/л): ЭДТА натрия – 10; FeCl₃ · 6H₂O – 1.5; H₃BO₃ – 0.15; CuSO₄ · 5H₂O – 0.03; MnCl₂ · · 4H₂O – 0.12; Na₂MoO₄ · 2H₂O – 0.06; ZnSO₄ · · 7H₂O – 0.12; KI – 0.18; CoCl₂ · 6H₂O – 0.15. Для предотвращения образования нитратов и развития денитрифицирующих бактерий, конкурирующих с ФАО за субстрат, в среду добавляли тиомочевину до конечной концентрации 2.5 мг/л; рН поддерживали автоматическим титрованием 0.5 М раствором HCl.

Посевным материалом служил флоккулированный активный ил очистных сооружений г. Москвы.

Концентрацию растворенного кислорода, ацетата, фосфат-ионов (P-${\text{PO}}_{4}^{{3 - }}$) и вес сухой биомассы (СБ) проводили, как было описано ранее (Пелевина и соавт., 2021). Зольность и концентрацию фосфора в биомассе определяли в соответствии с (Rice et al., 2017).

Морфологию клеток исследовали на микроскопе Olympus CX41 с фазовым контрастом (“Olympus”, Япония).

Фосфат-аккумулирующих представителей в составе микробного сообщества биореактора определяли методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с использованием меченых цианином 3 (Cy3) 16S рРНК олигонуклеотидных зондов: PAO651, специфичных к “Ca. Accumulibacter” (Crocetti et al., 2000). Процедуру гибридизации проводили по методике, описанной ранее (Каллистова и соавт., 2014). Клетки с зондами визуализировали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа Axio Imager M2 (“Carl Zeiss Microscopy GmbH”, Германия), оснащенного цифровой камерой 503mono и светофильтром Zeiss 43 (возбуждение 545/25 нм, эмиссия 605/70 нм). Фотографии обрабатывали с использованием программного обеспечения ZEN 2 (“Carl Zeiss Microscopy GmbH”, Германия).

Содержание и конформационное состояние молекул внутри клеток исследовали с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния (Рамановская спектроскопия, КР) (Carey, 1999). Регистрацию сигнала КР осуществляли на конфокальном микроскоп-спектрометре NTEGRA-SPECTRA (“NT-MDT”, Россия) в диапазоне частотного сдвига 200‒3000 см^–1 с шагом измерения 1 см^–1, охлаждение CCD камеры ‒60°С, объектив 5× с апертурой 0.15, решетка 600, мощность лазера на образце 3 мВт, длина волны возбуждения 532 нм. Для регистрации сигнала КР 5 мкл раствора наносили на предметное стекло и накрывали вторым предметным стеклом, после чего помещали на предметный столик прибора. Через 5 мин после нанесения образца проводили регистрацию спектров с выбранных областей. Время регистрации одного спектра – 30 с. Количество повторов – не менее 10. После получения сигнала, спектр КР обрабатывали в программе Origin2017 (“Origin Lab Corporation”, США). Обработка сигнала включала в себя вычитание базовой линии и сглаживание спектра.

Выделение ДНК, амплификацию и секвенирование фрагментов генов 16S рРНК проводили по методике, описанной ранее (Пелевина и соавт., 2021).

В течение всего периода культивирования органический субстрат (ацетат) полностью потреблялся микробным сообществом в анаэробную фазу каждого цикла работы SBR. Достоверного поглощения и выброса фосфора в среду в SBR-циклах за первые 10 сут не наблюдалось (рис. 1а). Дальнейшее культивирование приводило к увеличению количества выбрасываемого фосфора в анаэробной фазе каждого цикла SBR и падению его содержания в среде при переходе в аэробную фазу, что свидетельствовало о развитии в реакторе фосфат-аккумулирующего микробного сообщества. К 150 сут культивирования максимальная концентрация фосфатов в среде в анаэробную фазу составила 100–110 мг P-PO₄/л (рис. 1б). К этому моменту отношение количества выброшенного фосфора к потребленному ацетату в анаэробную фазу цикла достигло значения 0.72 ± 0.05 (Р-моль/С-моль), что свидетельствовало о том, что весь потребленный ацетат использовался фосфат-аккумулирующими микроорганизмами. Концентрация биомассы в реакторе и ее зольность составили 3.5 ± 0.3 г СБ/л и 36.0 ± 1.0% соответственно. Содержание фосфора увеличилось до 16.5 ± 0.15% от веса сухого беззольного вещества биомассы, что многократно превышало содержание фосфора в биомассе большинства микроорганизмов (1–2.5%) (Henze et al., 2002).

Рис. 1.

Динамика концентрации фосфатов и ацетата в среде в течение одного SBR-цикла: а – 10 сут работы реактора; б – 150 сут работы реактора. Концентрации ацетата и фосфатов показаны зеленой и фиолетовой линиями соответственно.

Микроскопическое исследование микробного сообщества SBR выявило большое разнообразие морфологических форм. Среди них четко выделялись овальные клетки с крупными включениями (рис. 2а), большинство из которых формировали агрегаты (рис. 2б).

Рис. 2.

Клетки с включениями в составе фосфат-аккумулирующего микробного сообщества ферментера: а – отдельные клетки; б – агрегаты клеток. Масштабная линейка ‒ 5 мкм.

Исследование этих клеток с помощью метода КР-спектроскопии позволило обнаружить полосы, характерные для колебания различных связей органических соединений и фосфора (рис. 3а, 3б; табл. 1). Были выявлены полосы колебаний, характерные для белков и жирных кислот, а также для связей О‒Р‒О, фосфатных групп РО, РО₄, С‒Н деформации ${\text{РО}}_{4}^{{3 - }},$ антисимметричные растяжения РО₂ и полоса колебаний растяжения связи Р‒ОН.

Рис. 3.

КР-спектроскопия клеток с включениями: а – микрофотография с обозначением места проведения анализа; б – КР-спектр исследуемых клеток на 150 сут культивирования; в – КР-спектр исследуемых клеток в конце анаэробной фазы (спектр 1) и в конце аэробной фазы SBR-цикла (спектр 2). Представленные графики нормированы на максимум интенсивности полосы стекла ‒ 916 см^–1.

Наличие полос КР-спектра, характерных для С‒Н-, С‒С-связей органических соединений и связей РО₄ (полоса 1128 см^–1 ‒ С‒Н деформации, ${\text{РО}}_{4}^{{3 - }}$ v3 колебание, 1152 см^–1 – колебания С‒С связи, антисимметричные растяжения РО₂), указывает на существование центров связывания фосфатов с молекулами в клетке. На рис. 3в представлены КР-спектры образцов клеток, отобранных в разных фазах SBR-цикла. Сравнение интенсивности полос 478, 748 и 1152 см^–1, полученных для клеток, находящихся в различных фазах SBR-цикла, показало, что содержание фосфатов в клетках в конце аэробной фазы (спектр 2) существенно выше, чем в конце анаэробной фазы SBR-цикла (спектр 1) (рис. 3в). Эти результаты полностью соответствует данным по динамике концентрации фосфатов в среде ферментера. Несмотря на то, что интенсивность полос спектра меняется, никакого их смещения не происходит, что свидетельствует об отсутствии конформационных изменений внутриклеточных фосфатов при их потреблении клетками или высвобождении в среду. Отметим, что при минимальном содержании в клетках фосфора в спектрах КР выявлена полоса 1440 см^–1, характеризующая N=N растяжения в молекулах (рис. 3в, табл. 1), которой не наблюдается в клетках при максимальном содержании фосфора. Этот сопряженный с динамикой фосфора процесс требует дальнейшего исследования.

Анализ микробных агрегатов методом FISH выявил высокое содержание в нем “Ca. Accumulibacter” – типичного представителя фосфат-аккумулирующих бактерий (рис. 4).

Рис. 4.

“Ca. Accumulibacter” в составе микробного сообщества агрегатов: а – фазовый контраст; б – клетки, гибридизованные с зондом РАО651 (светофильтр Zeiss 43). Масштабная линейка ‒ 20 мкм.

Таксономический анализ исследуемых образцов показал, что в исходном активном иле доминировали представители домена Bacteria, относящиеся к четырем основным филумам: Proteobacteria, Bacteroidota, Chloroflexota и Patescibacteria, тогда как археи составляли 5.9% от общего числа представителей микроорганизмов. В процессе работы биореактора доля архей снизилась до нуля, и стали преобладать представители филума Proteobacteria. Их доля к 150 сут возросла более чем в 5 раз, достигнув 68%. Proteobacteria в основном были представлены родами “Ca. Accumulibacter”, “Ca. Competibacter”, Thiothrix, Propionivibrio, Dechloromonas, Thauera, Zoogloea, которые характерны для биореакторов по удалению фосфатов (McIlroy et al., 2014, 2015; Albertsen et al., 2016; Terashima et al., 2016). Несмотря на то, что некоторые из этих родов включают в фосфат-аккумулирующие микроорганизмы (“Ca. Accumulibacter”, Thiothrix, Dechloromonas, Thauera), доминирующим представителем этой физиологической группы бактерий был “Ca. Accumulibacter”, численность которого существенно возросла по сравнению с исходным микробным сообществом активного ила с 0.9 до 13% от всех последовательностей генов 16S рРНК.

Таким образом, в ходе работы биореактора произошла смена таксономического состава активного ила. К 150 сут культивирования в SBR было получено стабильно функционирующее фосфат-аккумулирующее микробное сообщество с высоким накоплением фосфора в биомассе (16.5% от веса сухого беззольного вещества биомассы) и типичным для ФАО-фенотипа накоплением и высвобождением фосфатов в аэробную и анаэробную фазу SBR-цикла. Основным представителем ФАО в сообществе был “Ca. Accumulibacter”.