1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Микробиология
  4. T. 92, № 1, 2023

Микробиология, 2023, T. 92, № 1, стр. 42-46

Обнаружение микроцистин-продуцирующих цианобактерий MICROCYSTIS, Planktothrix и Dolichospermum с помощью мультипраймерной амплификации генов mcy

С. И. Сиделев *

Ярославский государственный университет
150057 Ярославль, Россия

* E-mail: Sidelev@mail.ru

Поступила в редакцию 19.05.2022
После доработки 22.06.2022
Принята к публикации 24.06.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

На основе мультипраймерной ПЦР разработан способ одновременной молекулярной детекции продуцентов микроцистинов ‒ планктонных цианобактерий родов Microcystis, Planktothrix и Dolichospermum. Отобраны три пары родоспецифичных праймеров для амплификации генов mcy биосинтеза микроцистинов; четвертая пара праймеров использована для амплификации межгенного спейсера (IGS) cpcBA, служащего внутренним положительным контролем присутствия цианобактериальной ДНК в анализируемых образцах. Успешно амплифицированы четыре ПЦР-продукта ожидаемого размера с использованием смеси матриц ДНК микроцистин-продуцирующих штаммов Microcystis aeruginosa, Planktothrix agardhii и природных колоний Dolichospermum lemmermannii, а также матрицы “природной” ДНК из озерного планктона. Предлагаемый способ может найти применение для разработки удобных тест-систем мониторинга водоемов с целью предотвращения и/или оценки риска накопления опасных цианобактериальных токсинов.

Ключевые слова: гены mcy, микроцистины, мультипраймерная ПЦР, цианобактерии

Токсичные цианобактериальные цветения, вызванные неконтролируемым антропогенным загрязнением водоемов фосфором и азотом, весьма распространены (Toxic Cyanobacteria…, 2021). В пресной воде чаще всего встречаются гепатотоксичные микроцистины (МС). Они относятся к классу циклических пептидов и имеют общую структуру: цикло-(DAla–X–DMeAsp–Z–AddA–DGlu–Mdha), где DAla – D-аланин, X и Z – L-аминокислоты (лейцин, аргинин и др.), DMeAsp – D-эритро-β-метиласпарагиновая кислота, AddA – (2S,3S,8S,9S)-3-амино-9-метокси-2,6,8-триметил-10-фенилдека-4,6-диеновая кислота, DGlu – D-глутаминовая кислота и Mdha – N-метилдегидроаланин. МС продуцируются планктонными цианобактериями из родов Microcystis, Dolichospermum и Planktothrix; неоднократно были описаны случаи массового отравления животных и людей, в том числе со смертельным исходом (Toxic Cyanobacteria…, 2021).

В отношении биологической активности МС являются ингибиторами эукариотических протеинфосфатаз 1 и 2А; они вызывают окислительный стресс с разрушением гепатоцитов, а также служат канцерогенными и мутагенными факторами (Toxic Cyanobacteria…, 2021). Из-за их чрезвычайно высокой токсичности ВОЗ ввела безопасный норматив содержания MC-LR в питьевой воде – 1 мкг/л, который был недавно утвержден СанПи-Ном РФ 1.2.3685-21 в качестве ПДК для поверхностных водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования.

Генетические основы биосинтеза МС хорошо изучены. Кластер генов микроцистинсинтетаз (mcyS) обнаружен и секвенирован, в частности, у представителей родов Microcystis (Tillett et al., 2000), Planktothrix (Christiansen et al., 2003) и Dolichospermum (Rouhiainen et al., 2004). МС синтезируются мультиферментным комплексом, состоящим из пептидсинтетаз (NRPS), поликетидсинтаз (PKS) и ряда модифицирующих ферментов. Он осуществляет активацию, модификацию и включение аминокислот в состав молекул МС. Кластер генов mcy M. aeruginosa имеет размер 55 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) и состоит из 10 генов, объединенных в опероны mcyAВC и mcyDEFGHIJ, которые транскрибируются в противоположных направлениях от промоторного участка, расположенного между генами mcyA и mcyD (Tillett et al., 2000). Установлено (Molecular Tools…, 2017), что кластеры mcyS  у вышеуказанных родов цианобактерий различаются как в расположении и количестве, так и в нуклеотидных последовательностях генов. Это заложило основу для разработки способов обнаружения токсичных цианобактерий в природных образцах с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Таксономическое определение продуцентов МС играет важную роль во всех существующих программах контроля и предупреждения вредоносных цианобактериальных цветений (англ. cyanoHAB – cyanobacterial Harmful Algal Blooms), притом что токсигенные и нетоксигенные штаммы цианобактерий морфологически не отличаются друг от друга (Molecular Tools…, 2017). После идентификации потенциальных продуцентов МС рекомендуется мониторинг их природного развития, особенно в водоемах питьевого назначения, с использованием доступных и дешевых методов, таких как световая микроскопия (Toxic Cyanobacteria…, 2021).

Одно время единственным способом диагностики потенциальных продуцентов МС было выделение штаммов из природных образцов и подтверждение этого свойства в культуре. Однако для рутинного экологического мониторинга данный подход слишком трудоемок.

Диагностика планктонных продуцентов МС на уровне рода без выделения и культивирования штаммов стала возможной благодаря использованию родоспецифичных праймеров для амплификации генов биосинтеза МС с использованием матрицы природной ДНК (англ. environmental DNA). Для молекулярной детекции МС-продуцирующих цианобактерий в обход их таксономической идентификации разработано и апробировано много надежных протоколов монопраймерной ПЦР (Molecular Tools…, 2017).

В настоящей работе исследована возможность одновременной идентификации в природных образцах продуцентов МС из родов Microcystis, Planktothrix и Dolichospermum с использованием мультипраймерной амплификации генов mcy.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализируемые объекты. МС-продуцирующие коллекционные штаммы M. aeruginosa (PCC 7806) и P. agardhii (NIVA–CYA 126/8) были любезно предоставлены профессором Элькой Диттманн (Университет Потсдама, Германия) и выращивались в питательной среде BG11 (Rippka et al., 1979) при температуре 25°C и 12-часовом световом периоде (плотность потока ФАР 30 мкмоль квантов м–2 с−1). Природные колонии D. lemmermannii были изолированы из планктона оз. Рюмниково (Ярославская обл.) согласно методике, описанной в работе (Kurmayer, 2017), и использовались для выделения из них ДНК.

“Природная” ДНК была выделена из планктона водоемов, в которых ранее (Сиделев, 2014; Chernova et al., 2020): а) были обнаружены МС-продуцирующие представители родов Microcystis, Planktothrix и Dolichospermum с помощью молекулярных методов; б) были детектированы эти токсины в биомассе фитопланктона и в воде с помощью хромато-масс-спектрометрии.

Выделение ДНК. Препараты ДНК были выделены сорбционным методом с помощью набора Diatom DNA Prep 200 (“Лаборатория Изоген”, Россия) согласно инструкции производителя.

Подбор праймеров. Ключевым критерием подбора праймеров из имеющихся в свободном доступе была их специфичность в отношении генов mcy Microcystis, Planktothrix и Dolichospermum. Причем были отобраны те пары праймеров, специфичность которых ранее была доказана как для культивируемых штаммов МС-продуцирующих цианобактерий, так и образцов планктона (Vaitomaa et al., 2003; Ouahid et al., 2005; Ostermaier, Kurmayer, 2009). Кроме того, при подборе праймеров были учтены различия в температуре плавления и размерах ПЦР-продуктов. Все праймеры были проанализированы с помощью программы OligoAnalyzer 1.0.2 (“Teemu Kuulasmaa”, Финляндия) на возможность образования вторичных структур (гомо- и гетеродимеров, шпилек) при проведении мультиплексной ПЦР. В итоге для мультипраймерной амплификации генов mcy были отобраны три пары родоспецифичных праймеров. В качестве внутреннего положительного контроля присутствия в образцах цианобактериальной ДНК была использована четвертая пара праймеров – PCβF/PCαR, специфичных для спейсера срсBA-IGS между генами срсА и срсВ (Neilan et al., 1995), участвующими в синтезе фикоцианина (табл. 1).

Таблица 1.

Общие сведения о мультипраймерной амплификации трех генов mcy и межгенного спейсера срсВА-IGS

Амплифицируемый ген Пара праймеров Нуклеотидная последовательность праймера (5'→3') Температура отжига, °С Размер ампликона, п.н.
mcyD (у микроцистин-продуцирующих видов р. Microcystis) PKDF2
PKDR2 		AGTTATTCTCCTCAAGCC
CATTCGTTCCACTAAATCC (Ouahid et al., 2005) 		52 859
mcyB (у микроцистин-продуцирующих видов р. Planktothrix) mcyBA1F
mcyBA1R 		ATTGCCGTTATCTCAAGCGAG
TGCTGAAAAAACTGCTGCATTAA (Ostermaier, Kurmayer, 2009) 		60 76
mcyE (у микроцистин-продуцирующих видов р. Dolichospermum) mcyEF2
AnamcyE-12R 		GAAATTTGTGTAGAAGGTGC
CAATCTCGGTATAGCGGC (Vaitomaa et al., 2003) 		58 250
срсВА-IGS (у фикоцианин-содержащих цианобактерий) PCβF
PCαR 		GGCTGCTTGTTTACGCGACA
CCAGTACCACCAGCAACTAA (Neilan et al., 1995) 		55 685

Условия проведения ПЦР. Реакция амплификации была проведена с использованием набора GenPak PCR Core (“Лаборатория Изоген”, Россия). Реакционная смесь объемом 40 мкл содержала по 2 мкл ДНК (исходная концентрация 10–100 нг/мкл) и 2 мкл каждого из праймеров (10 пкмоль/мкл). Программа амплификации: предварительная денатурация – 95°С/3 мин; 37 циклов амплификации – 95°С/30 с, 58°С/30 с, 72°С/1 мин; элонгация – 72°С/10 мин. Продукты ПЦР (ампликоны) были разделены методом электрофореза в геле 2%-ной агарозы и визуализированы в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты проведения мультипраймерной амплификации генов mcy приведены на рис. 1. На дорожке 1 находятся полосы, соответствующие четырем ампликонам ожидаемых размеров, полученным из смеси ДНК M. aeruginosa PCC 7806, P. agardhii NIVA–CYA 126/8 и D. lemmermannii. Такой же результат был получен для “природной” ДНК (дорожка 6). Для сравнения приведены результаты независимо проведенных (в четырех ПЦР-системах) амплификаций ДНК разных МС-продуцирующих цианобактерий (дорожки 2–5).

Рис. 1.

Электрофореграмма продуктов мультипраймерной амплификации трех генов mcy и межгенного спейсера с-рсВА-IGS. Дорожки: 1 – ампликоны срсВА-IGS и трех генов биосинтеза МС P. agardhii, M. aeruginosa и D. lemmermannii; 2 – ампликон гена mcyB P. agardhii; 3 – ампликон гена mcyE D. lemmermannii; 4 – ампликон cpcBA-IGS; 5 – ампликон гена mcyD M. aeruginosa; 6 – ампликоны срсВА-IGS и трех генов биосинтеза МС “природной” ДНК. М – маркер молекулярной массы (п.н.).

Ранее были предприняты успешные попытки мультипраймерной амплификации генов mcy с детекцией результатов методом гель-электрофореза (Ouahid et al., 2005; Valério et al., 2010). Однако эти исследования проводились с целью повышения надежности обнаружения продуцентов МС за счет амплификации в одной реакционной пробирке нескольких генов из кластера mcy. В настоящей работе продемонстрирована возможность идентификации родов МС-продуцирующих цианобактерий в ходе одной мультипраймерной ПЦР. Подобный подход по сравнению с монопраймерной ПЦР удобен тем, что значительно экономит реактивы и сокращает время получения результата при проведении экологического мониторинга токсичных цианобактерий.

Таким образом, на основе мультиплексной ПЦР разработан эффективный способ одновременной молекулярной детекции продуцентов МС – цианобактерий родов Microcystis, Planktothrix и Dolichospermum. Данный способ может найти применение для разработки удобных тест-систем мониторинга водоемов с целью предотвращения и/или оценки риска накопления опасных цианобактериальных токсинов.

Список литературы

  1. Сиделев С.И. Молекулярно-генетическая идентификация микроцистин-продуцирующих таксонов цианобактерий в озере Неро (Россия) // Микробиология. 2014. Т. 83. С. 626–628.

  2. Sidelev S.I. Molecular genetics identification of microcystin-producing cyanobacteria taxa in Lake Nero (Russia) // Microbiology (Moscow). 2014. V. 83. P. 709–711.

  3. Chernova E., Sidelev S., Russkikh I., Korneva L., Solovyova V., Mineeva N., Stepanova I., Zhakovskaya Z. Spatial distribution of cyanotoxins and ratios of microcystin to biomass indicators in the reservoirs of the Volga, Kama and Don rivers, the European part of Russia // Limnologica. 2020. V. 84. Art. 125819.

  4. Christiansen G., Fastner J., Erhard M., Börner T., Dittmann E. Microcystin biosynthesis in Planktothrix: genes, evolution and manipulation // J. Bacteriol. 2003. V. 185. P. 564–572.

  5. Molecular Tools for Detection and Quantification of Toxigenic Cyanobacteria / Eds. Kurmayer R., Sivonen K., Wilmotte A., Salmaso N. Hoboken, NJ: Wiley, 2017. 402 p.

  6. Kurmayer R. Isolation of single cyanobacteria colonies/filaments // Molecular Tools for Detection and Quantification of Toxigenic Cyanobacteria / Eds. Kurmayer R., Sivonen K., Wilmotte A., Salmaso N. Hoboken, NJ: Wiley, 2017. P. 32–34.

  7. Neilan B., Jacobs D., Goodman A.E. Genetic diversity and phylogeny of toxic cyanobacteria determined by DNA polymorphisms within the phycocyanin locus // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. P. 3875–3883.

  8. Ostermaier V., Kurmayer R. Distribution and abundance of nontoxic mutants of cyanobacteria in lakes of the Alps // Microb. Ecol. 2009. V. 58. P. 323–333.

  9. Ouahid Y., Pérez-Silva G., del Campo F.F. Identification of potentially toxic environmental Microcystis by individual and multiple PCR amplification of specific microcystin synthetase gene regions // Environ. Toxicol. 2005. V. 20. P. 235–242.

  10. Rippka R., Deruelles J., Waterbury J.B., Herdman M., Stanier R.Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria // J. Gen. Microbiol. 1979. V. 111. P. 1–61.

  11. Rouhiainen L., Vakkilainen T., Siemer B.L., Buikema W., Haselkorn R., Sivonen K. Genes coding for hepatotoxic heptapeptides (microcystins) in the cyanobacterium Anabaena Strain 90 // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 686–692.

  12. Tillett D., Dittmann E., Erhard M., von Döhren H., Börner T., Neilan B.A. Structural organization of microcystin biosynthesis in Microcystis aeruginosa PCC7806: an integrated peptide polyketide synthetase system // Chem. Biol. 2000. V. 7. P. 753–764.

  13. Toxic Cyanobacteria in Water / Eds. Chorus I., Welker M. Boca Raton: CRC Press, 2021. 839 p.

  14. Vaitomaa J., Rantala A., Halinen K., Rouhiainen L., Tallberg P., Mokelke L., Sivonen K. Quantitative real-time PCR for determination of microcystin synthetase gene E copy numbers for Microcystis and Anabaena in lakes // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 7289–7297.

  15. Valério E., Chambel L., Paulino S., Faria N., Pereira P., Tenreiro R. Multiplex PCR for detection of microcystins-producing cyanobacteria from freshwater samples // Environ. Toxicol. 2010. V. 25. P. 251–260.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал