Микология и фитопатология, 2022, T. 56, № 2, стр. 127-139

ВВЕДЕНИЕ

Род Colletotrichum Corda (Sordariomycetes, Glo-merellales, Glomerellaceae) включает в себя широко распространенные фитопатогенные грибы, представляющие особое значение для сельского хозяйства (Zhang et al., 2006; Réblová et al., 2011). Болезни культурных растений, вызываемые этими грибами, главным образом антракнозы, ожоги и гнили, приводят к значительным экономическим потерям во всем мире. Вред, наносимый грибами этого рода, распространяется на злаковые, бобовые, овощные, плодово-ягодные, декоративные и другие культуры (Cannon et al., 2012). В России нередки вспышки ранее зарегистрированных заболеваний, таких как антракнозы люпина, клевера и фасоли, а также сравнительно новых: антракноза овса и земляники (Kotova, Kungurtseva, 2014). Широко распространены антракнозы пасленовых (Belov et al., 2018) и тыквенных культур (Varivoda, Maslennikova, 2019). Также известно, что данные грибы наносят существенный вред и в послеуборочный период при хранении сельскохозяйственной продукции.

Большинство видов рода Colletotrichum проявляют гемибиотрофный способ питания, последовательно совмещая биотрофную и некротрофную фазы, длительность которых варьирует в зависимости от конкретного вида патогена, хозяина и условий окружающей среды. Грибы также могут, изначально колонизировав хозяина, затем продолжительное время оставаться в латентной форме или в состоянии покоя, проявляя патогенные свойства спустя некоторое время (Jayawardena et al., 2021).

Colletotrichum spp. часто регистрируют в качестве эндофитов. Вступая в мутуалистические отношения, они способны обеспечивать растениям резистентность к болезням, засухоустойчивость и стимулировать их рост (Redman et al., 2001; Busby et al., 2016). Однако следует отметить, что такие отношения со стороны гриба могут быстро перерасти в паразитические вследствие изменения внешних факторов.

В настоящее время насчитывают около 250 актуальных видов, которые распределены между 14 видовыми комплексами (caudatum, graminicola, spaethianum, destructivum, acutatum, dematium, gigasporum, gloeosporioides, boninense, truncatum, orbiculare, dracaenophilum, magnum и orchidearum) и 13 отдельными видами на основании молекулярно-генетических данных (Damm et al., 2019; Jayawardena et al., 2021). Имеются упоминания некоторых видов Colletotrichum на дикорастущих растениях в нашей стране, но они по большей части не систематизированы и отрывочны (Gasich et al., 1999; Mel’nik et al., 2008; Gannibal et al., 2010; Gasich et al., 2015; Gasich et al., 2016). Более того, имеющиеся в литературе данные базируются на определении грибов по морфологическим признакам и их связи с питающим растением. Сейчас результаты такой идентификации с трудом поддаются проверке и интерпретации в связи с тем, что современное представление о видовом разнообразии этого рода основывается преимущественно на молекулярно-генетических данных.

Современное фитосанитарное состояние агроценозов и биологические особенности Colletotrichum spp. позволяют выделить их в топ 10 фитопатогенов, наиболее важных для науки и экономики (Dean et al., 2012). В связи с этим спектр изучаемых растений (и соответственно выделяемых из них грибов) смещен в сторону именно сельскохозяйственных культур, дикорастущие растения-хозяева реже представлены в микологических сборах, хотя и являются богатым резервуаром биоразнообразия данного таксона. Грибы рода Colletotrichum и синтезируемые ими фитотоксины рассматриваются как важные агенты биологического контроля сорных растений, некоторые штаммы Colletotrichum зарегистрированы как микогербициды (Chakraborty, Ray, 2021). Сведения относительно видового разнообразия, встречаемости и специализации грибов этого рода на территории России и сопредельных государств, в сравнении с накопленным массивом данных мирового уровня, недостаточны и требуют ревизии. Данная работа посвящена молекулярно-генетической идентификации и оценке патогенности изолятов Colletotrichum spp. (из коллекции чистых культур микромицетов лаборатории микологии и фитопатологии ФГБНУ ВИЗР), собранных на территории европейской части России, Сибири, Дальнего Востока, а также Украины.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение и культивирование грибов. В работе были использованы изоляты, предварительно идентифицированные как Colletotrichum spp. и выделенные из культурных и дикорастущих растений в период с 1995 по 2019 г. преимущественно на территории России (дополнительно изучены четыре образца из Украины, Сумская обл.). Для изоляции грибов в чистую культуру небольшие фрагменты пораженной растительной ткани промывали водопроводной водой, поверхностно дезинфицировали 0.1%-м раствором нитрата серебра в течение 1 мин, затем промывали несколько раз в стерильной воде и переносили в чашки Петри с картофельно-сахарозным агаром (КСА) (Samson et al., 2000). Изоляты культивировали при 24°С, диаметр колоний измеряли на седьмые сутки, описание колоний и идентификацию видов производили на 14-е сутки. Все выделенные культуры в настоящее время хранятся в коллекции микроорганизмов ФГБНУ ВИЗР. Происхождение изолятов приведено в табл. 1.

Выделение и секвенирование ДНК. Для экстракции ДНК изолятов Colletotrichum spp. применяли стандартный CTAB-хлороформ метод (Doyle, Doyle, 1987). Последующая амплификация была проведена для внутренних транскрибируемых спейсеров рДНК (ITS), а также генов β-тубулина (Tub2) и актина (Act) с соответствующими праймерами ITS1F (Gardes, Bruns, 1993)/ITS4 (White et al., 1990); βtub2Fw/βtub4Rd (Aveskamp et al., 2009); Act-512F/Act-783R (Carbone, Kohn, 1999). Продукты амплификации разделяли электрофоретически в 1%-м агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Фрагменты нужной длины очищали с использованием порошка оксида кремния (Malferrari et al., 2002). Секвенирующую ПЦР осуществляли по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977) с использованием набора BigDye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI, США), а последовательности нуклеотидов определяли на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500. Последовательности корректировали в программах SeqScape и VectorNTI и сравнивали с депонированными в Генбанке (GenBank) с помощью алгоритма Blast-n (Altschul et al., 1990). Секвенированные последовательности ITS были помещены в Генбанке под номерами OL647872–OL647906, последовательности Tub2 – под номерами OL676734–OL676768, а последовательности Act – под номерами OL676699–OL676733.

Биоинформатический анализ. Выравнивание последовательностей выполняли в программе MegaX c использованием алгоритма Muscle (Kumar et al., 2018; Edgar, 2004). Поиск оптимальной модели нуклеотидных замен для построения филогенетических деревьев методом максимального правдоподобия (ML) для всех локусов по отдельности осуществляли в программе ModelFinder c использованием байесовского информационного критерия (Bayesian information criterion, BIC) (Kalyaanamoorthy et al., 2017). В качестве оптимальной для локуса ITS была выбрана модель K2P + + R2 (Kimura, 1980), для Tub2 – TNe + G4 (Tamura, Nei, 1993), для ACT – K2P + I (Kimura, 1980). Объединение последовательностей трех локусов выполнили в программе SequenceMatrix 1.7.8 (Vaidya et al., 2011). Реконструкция мультилокусного ML дерева и оценка достоверности топологии UFBoot (Minh et al., 2013) с использованием 10 000 бутстрэп-итераций проведена в программе IQ-tree (Kimura, 1981; Nguyen et al., 2015).

Оценка патогенности. Для оценки патогенности изоляты выращивали при комнатной температуре на жидкой соевой среде [KH₂PO₄ – 2 г, (NH₄)₂SO₄ – 1 г, MgSO₄ – 1 г, глюкоза – 20 г, соевая мука – 10 г, вода – 1 л; 50 мл среды на 250 мл колбу] на орбитальной качалке (200 об./мин) в течение четырех суток. Среду инокулировали тремя мицелиальными дисками (5 мм), вырезанными при помощи бура из 2-недельных колоний, выращенных на КСА. Мицелий отделяли от культуральной жидкости, обсушивали и измельчали. Отрезки листьев растений раскладывали в чашки Петри на увлажненную стерильной водой фильтровальную бумагу. В центр листового отрезка при помощи автоматического дозатора помещали каплю (10 мкл) мицелиальной суспензии (С = 100 мг/мл). Инокулюм наносили на абаксиальную или адаксиальную поверхность интактных или надколотых в центре иглой листовых отрезков. В качестве отрицательного контроля использовали листовые отрезки, инокулированные стерильной водой. Чашки инкубировали на лабораторном столе при естественном освещении, а диаметр некрозов измеряли на четвертые, седьмые и 14-е сутки. Впоследствии для выполнения постулатов Коха из зараженных растений был выделен возбудитель и произведена его идентификация.

Изоляты, проявившие наибольшую патогенность на листовых отрезках сорных растений, были оценены на целых растениях, выращенных в вегетационных сосудах объемом 250 мл. Растения проращивали из семян по 5 штук на емкость на светоустановке при переменном освещении (12/12 ч). К моменту инокуляции галинсога мелкоцветковая, одуванчик лекарственный и портулак огородный были в стадии двух пар настоящих листьев, а амброзия полыннолистная в стадии трех пар настоящих листьев. Изоляты культивировали на соевой среде в течение четырех суток. Мицелий отделяли от культуральной жидкости и измельчали при помощи блендера. Обработку проводили суспензией с концентрацией 50 мг/мл, около 5 мл на сосуд. Растения после инокуляции помещали во влажные камеры на 24 и 48 ч для имитации росяного периода, а затем переносили на светоустановку. Площадь пораженной поверхности каждого листа определяли на вторые, третьи и седьмые сутки по 6-балльной шкале (0 – нет симптомов, 1 – 0–5%; 2 – 6–25%; 3 – 26–75%; 4 –76–95%; 5 – более 95%; 6 – гибель листа). Площадь пораженной поверхности растения определяли по формуле: (2.5xn₁ + 15xn₂ + 50хn₃ + 85xn₄ + + 97.5xn₅ + 100xn₆)/N, где n_x – число листьев с данным баллом, N – общее число листьев (Pfirter, Defago, 1998).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Молекулярная филогения. В результате молекулярно-генетической идентификации грибов рода Colletotrichum по трем локусам (ITS, Act, Tub2) установлено, что более трети всех изолятов (34%) относится к виду C. coccodes (Wallr.) S. Hughes (рис. 1). Этот вид встречался как на диких (галинсога мелкоцветковая, амброзия полыннолистная, конопля посевная, портулак огородный), так и культурных (рапс, свекла) растениях от Приморского края России до Украины. Остальные изученные изоляты относились к двум видовым комплексам – destructivum (40%) и dematium (26%).

Рис. 1.

Филогенетическое дерево для изолятов Colletotrichum spp., реконструированное методом максимального правдоподобия (ML) по нуклеотидным последовательностям локуса ITS, генов Tub2 и Act. Полужирным шрифтом выделены референсы, относящиеся к типовым штаммам. Для изученных изолятов приведены значения бутстреп-поддержки, превышающие 50%. В качестве внешней группы использован вид Colletotrichum phaseolorum.

Изоляты MF-13.20, MF-13.23 и MF-13.24 из комплекса видов destructivum по исследованным локусам имели полное сходство с типовым (ex-epitype) штаммом C. destructivum O’Gara CBS 136228, что позволяет отнести их к этому виду. Изолят MF-13.10 может быть уверенно идентифицирован как C. lini (Westerd.) Tochinai. Остальные изоляты комплекса destructivum были не настолько близки к имеющимся референсам, в связи с чем их уверенная идентификация до вида была затруднена. Так, например, изоляты MF-20.1, MF-20.2, MF-20.3 из Амурской обл., выделенные из сои, не только сформировали отдельную базальную группу по отношению к виду C. destructivum, но также имели различия между собой. Поэтому в контексте данного исследования представляется возможным идентифицировать их только как Сolletotricum cf. destructivum. Изолят MF-3.5, выделенный из рапса, оказался в группе, образованной видами C. americae-borealis Damm и С. lini, и его окончательная идентификация также представляется затруднительной. Группа изолятов MF-13.2, MF-13.25, MF-13.27 из комплекса видов destructivum, выделенных из галинсоги, собранной в России (Псковская обл., Великолукский р-н) и на Украине (Сумская обл., Середино-Будский р-н), с высокой долей вероятности могут представлять новый еще не описанный вид. Изоляты MF-13.11 и MF-19.5, выделенные из щавеля туполистного и одуванчика лекарственного соответственно, оказались филогенетически близки видам C. panacicola Uyeda et S. Takim. и C. utrechtense Damm. Изолят MF-13.13 из вьюнка полевого вошел в группу, образованную видами C. antirrhinicola Damm, C. bryoniicola Damm и C. vignae Damm.

Из числа представителей комплекса видов dematium удалось уверено идентифицировать изолят MF-13.21 как C. lineola Corda, выделенный из борщевика сибирского. Близкий к нему изолят MF-17-018 из сои, вошедший в группу с С. lineola и C. menispermi Chethana, Jayaward., Bulgakov et K.D. Hyde, до вида по использованным локусам идентифицирован не был. Изоляты MF-17-012, MF-17-013, MF-13.22 отличались на одну нуклеотидную замену в гене Tub2 от типового (ex-epitype) штамма C. dematium (Pers.) Grove CBS 125.25, но имели полное сходство с другим референсным штаммом С. dematium CBS 125340, что позволяет причислить эти изоляты к данному виду. Изолят MF-16-008 из капусты был идентифицирован как Colletotrichum cf. spinaciae Ellis et Halst. Установить видовую принадлежность изолятов MF-13.19, MF-19.2, MF-19.6, вошедших в видовой комплекс dematium, не удалось.

Патогенность. Оценка патогенности 20 изолятов Colletotrichum spp., выделенных из сорных растений, выявила у 11 изолятов способность вызывать симптомы болезни на тех растениях, из которых эти изоляты были выделены (табл. 2). Наибольшую патогенность проявил изолят MF-13.17 в отношении портулака огородного, уже в первые дни после инокуляции было зарегистрировано развитие некрозов вокруг мест уколов, а на четвертые сутки крупные некрозы развились также в случае нанесения инокулюма на верхнюю неповрежденную поверхность листьев. Раннее развитие симптомов отмечено также на амброзии полыннолистной (изолят MF-13.14) и козлобороднике луговом (изолят MF-19.2). На седьмые сутки после нанесения инокулюма изолятов MF-13.2, MF-13.25, MF-13.27 отмечено развитие пятен на верхней поверхности листьев галинсоги мелкоцветковой, а на 14-е сутки ограниченные некрозы развивались также и на нижней поверхности. Изоляты MF-13.13 и MF-19.6 вызывали, соответственно, у вьюнка полевого и одуванчика лекарственного ограниченные, не распространяющиеся за область нанесенной капли некрозы. Изоляты MF-13.24 на одуванчике лекарственном, MF-13.3 и MF-13.26 на галинсоге мелкоцветковой, напротив, приводили к более позднему (на 14-е сутки) развитию симптомов. Остальные изоляты не продемонстрировали патогенность на листьях тестируемых растений.

В эксперименте на целых растениях изоляты MF-13.24 (C. destructivum) и MF-13.17 (C. coccodes) проявили довольно слабую патогенность в отношении одуванчика лекарственного и портулака огородного, соответственно, развитие симптомов отмечалось только на седьмые сутки при 48-часовом росяном периоде (табл. 3). Степень поражения растений амброзии изолятом MF-13.14 (C. coccodes) составила более 50%. Изоляты MF-13.2, MF-13.25 и MF-13.27 (видовой комплекс destructivum) проявили высокую патогенность для целых растений галинсоги, степень поражения растений на вторые сутки превышала 70%, на седьмые сутки отмечалась 100% гибель растений.

Оценена патогенность 15 изолятов, выделенных из свеклы, сои, рапса и капусты в отношении этих растений (табл. 4). Все изоляты, выделенные из свеклы (MF-16-014, MF-16-015, MF-17-014) проявили патогенность для свеклы огородной. Изоляты из сои (MF-20.1, MF-20.2, MF-20.3) характеризовались слабой патогенностью и приводили к развитию ограниченных некрозов на отрезках листьев сои, изолят MF-17-018 не проявил патогенности для сои. Среди изолятов, выделенных из Brassica spp., только изоляты MF-3.2 (из рапса) и MF-16-008 (из капусты) вызывали развитие некрозов на отрезках листьев рапса, остальные изоляты оказались не патогенными.

ОБСУЖДЕНИЕ

Значительная доля наших изолятов, собранных на территории Восточной Европы, Сибири и Дальнего Востока, относилась к виду C. coccodes. Считается, что этот вид является космополитным фитопатогеном с широкой специализацией. Помимо традиционно упоминаемых растений из семейства пасленовых, описано значительное количество растений, которые способен поражать данный вид (Farr, Rossman, 2021). В том числе имеются отрывочные сведения, что данный вид поражает свеклу (Ginns, 1986), рапс (Nitzan et al., 2006), капусту и коноплю (McPartland et al., 2000). Большинство сообщений о выделении C. coccodes из разнообразных растений зачастую базируется исключительно на культурально-морфологических данных, и встречаемость этого вида может оказаться преувеличена (Jayawardena et al., 2021). Наши изоляты C. сoccodes были выделены также из галинсоги мелкоцветковой, амброзии полыннолистной и портулака огородного, которые ранее в качестве растений-хозяев в литературе не встречались. В отношении последних трех видов растений выделенные штаммы проявляли патогенные свойства.

Остальные изоляты относились к двум видовым комплексам – dematium и destructivum. Последний включает в себя непосредственно вид C. destructivum, а также 16 близких видов, являющихся преимущественно патогенами растений. C. destructivum (как и C. coccodes) встречается на широком круге хозяев из семейств Asteraceae, Convolvulaceae, Fabaceae, Magnoliaceae, Menispermaceae, Lamiaceae, Poaceae, Polygonaceae и Solanaceae (Damm et al., 2014). Три изолята, идентифицированные в этой работе как C. destructivum и выделенные из дикорастущих растений, собранных в Ленинградской обл. и Камчатском крае, также указывают на то, что данный вид не специализирован и имеет широкое географическое распространение, хотя по имеющимся у нас сведениям ранее его присутствие на территории России не фиксировалось. Это, по-видимому, объясняется сложностью его идентификации без привлечения молекулярно-генетических методов. В связи с этим дополнительно следует отметить группу филогенетических близких изолятов (Colletotrichum cf. destructivum), которые были выделены из сои в Амурской обл. Другой вид из комплекса destructivum C. lini, первоначально выделенный из льна, нередко поражает растения семейства бобовые (Medicago sativa, Trifolium sp.) и в нашем случае был выделен из чины.

Видовой комплекс dematium в настоящее время включает в себя 18 видов, некоторые из которых узко специализированы и ассоциированы с одним видом растений. Среди изолятов этого видового комплекса в данной работе было достоверно определено три вида – Colletotrichum dematium, C. lineola, C. spinaciae. Вид C. dematium в литературных источниках был отмечен как патоген, эндофит и сапротроф с широкой субстратной специализацией (Damm et al., 2009). В проведенных нами тестах на патогенность изоляты этого вида были не способны вызывать симптомы болезни.

Гриб C. lineola представлен на значительном круге питающих растений (в том числе Heracleum sp.) и встречается практически повсеместно в зонах с умеренным климатом (Damm et al., 2009; Jayawardena et al., 2021). В нашем случае выделенный из борщевика изолят не показал патогенности на соответствующем растении.

Первоначально вид C. spinaciae был выделен из шпината огородного, однако в последствии был также изолирован из других растений (марь белая, люцерна посевная, портулак огородный, Damm et al., 2009). В настоящем исследовании изолят этого вида был выделен из капусты и в тесте на патогенность был способен вызывать некрозы.

Некоторые изоляты (MF-3.5, MF-13.2, MF-13.11, MF-13.13, MF-13.19, MF-13.25, MF-13.27, MF-17-018, MF-19.2, MF-19.5, MF-19.6) из исследованной коллекции не удалось отнести ни к одному из существующих актуальных видов. Это с высокой степенью вероятности демонстрируют наличие еще неописанных видов внутри видовых комплексов destructivum и dematium и свидетельствует о высоком видовом разнообразии данных видовых комплексов.

Неоднократно показано, что представители Colletotrichum sp. проявляют гербицидную активность в отношении ряда сорных растений. Ранее на основе штаммов C. gloeosporioides (Penz.) Penz. et Sacc. созданы препараты BioMal, Collego, Lubao для контроля мальвы, эшиномены, повилики и сесбании; изучается возможность использования C. dematium для борьбы с партениумом позднеплодным, C. orbiculare Damm, P.F. Cannon et Crous – с дурнишником колючим, C. coccodes – с канатником Теофраста, Colletotrichum truncatum (Schwein.) Andrus et W.D. Moore – с сесбанией рослой (Chakraborty, Ray, 2021). Из культуральной жидкости C. gloeosporioides были выделены фитотоксины коллетохлорин А и тирозол, приводящие к развитию некрозов и увяданию амброзии полыннолистной (Masi et al., 2018). Коллетохлорин F из C. higginsianum Sacc. вызывал обширные некрозы на осоте полевом (Masi et al., 2017).

Среди изученных нами культур наибольший интерес в качестве агентов биоконтроля сорной растительности представляют изоляты MF-13.2, MF-13.25, MF-13.27 (видовой комплекс destructivum) в отношении галинсоги мелкоцветковой, а изолят MF-13.14 (C. coccodes) для борьбы с амброзией полыннолистной.

Авторы выражают искреннюю благодарность А.Г. Ковалю за помощь со сбором пораженных растений. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-76-30005).