Микология и фитопатология, 2022, T. 56, № 4, стр. 276-283

ВВЕДЕНИЕ

Микромицет Aspergillus flavus Link, часто встречающийся контаминант агропродукции, обладает способностью к продуцированию обширной группы токсичных метаболитов (Frisvad et al., 2019), в которой особое место принадлежит афлатоксинам (Klich, 2007) и циклопиазоновой кислоте (Chang et al., 2009; Ostry et al., 2018). У изолятов этого гриба были выявлены отличия по интенсивности продуцирования афлатоксинов, а также по числу и размерам образуемых склероциев – многочисленных мелких (d < 400 мкм) или крупных (d > 400 мкм), обозначенных как S- и L-морфотипы. По первым оценкам, S-форма обеспечивала интенсивное накопление афлатоксинов, а L-форма чаще всего была менее токсигенной (Wang et al., 1993). В наши дни связь между процессами биосинтеза вторичных метаболитов и образованием склероциев уже доказана на генном уровне (Calvo, Cary, 2015). Современные исследователи при описании природных популяций, наряду с оценкой морфологической изменчивости, дифференцируют до пяти хемотипов этого гриба и среди них – образующие раздельно и совместно афлатоксины В и G групп, циклопиазоновую кислоту, а также нетоксигенные формы (Vaamonde et al., 2003; Razzaghi-Abyaneh et al., 2006; Chang et al., 2009). На популяционном уровне исследований по способности грибов рода к биосинтезу циклопиазоновой кислоты недостаточно (Vaamonde et al., 2003; Pildain et al., 2004), в нашей стране подобные проекты не проводились, были тестированы лишь отдельные группы и виды рода Aspergillus (Burkin et al., 2006; Kononenko, Burkin, 2008).

Целью работы стала оценка популяции гриба Aspergillus flavus, ассоциированной с зерновыми объектами, по характеру токсинообразования и размерам образуемых склероциев.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культуры A. flavus выделяли из 92 образцов зерновой продукции – зерна (35 образцов), продуктов его переработки (29 образцов) (табл. 1) и зерновых смесей (28 образцов), направленных для микотоксикологического анализа в разные годы агропромышленными предприятиями центральных областей Европейской части России (табл. 1).

Посевы серийных разведений водных взвесей измельченного материала выполняли в чашках Петри на агаре Чапека–Докса (ЧДА), содержащего 10% медицинской консервированной желчи и антибиотики (50 тыс. единиц действия – ЕД – пенициллина и 100 тыс. ЕД стрептомицина на 1 л среды). Далее колонии, предположительно отнесенные к виду A. flavus, высевали на чашки Петри с ЧДА и антибиотиками, а затем, после подтверж-дения их чистоты, – на пробирки со скошенным ЧДА (Piryazeva, Malinovskaya, 2013). Видовую идентификацию чистых культур проводили по определителю (Raper, Fennel, 1965). Выборку для дальнейших исследований формировали по принципу “1 изолят – 1 образец”, при этом из шести образцов (зерно пшеницы, зерно ячменя, соевый шрот и три зерносмеси) было взято по 2 изолята из-за замеченных особенностей в структуре колоний при осмотре первичных посевов.

Для оценки токсинообразования инокулюм, 10-суточные культуры грибов на ЧДА, помещали во флаконы вместимостью 10 мл и диаметром дна около 18 мм, каждый из которых содержал по 1.5 мл суслового агара (wort agar, Liofilchem®, Italy). Флаконы закрывали ватно-марлевыми пробками и слоем лабораторной пленки Parafilm M. После инкубации в темноте в течение семи суток при 25°С в каждый флакон добавляли по 1.5 мл смеси ацетонитрил – вода в объемном соотношении 84 : 16 и дважды с 16-часовым интервалом интенсивно встряхивали содержимое. Экстракты после 10-кратного разведения буферным раствором анализировали на содержание афлатоксина В₁ (АВ₁), стеригматоцистина (СТЕ) и циклопиазоновой кислоты (ЦПК) с помощью трех аттестованных тест-систем для непрямого конкурентного иммуноферментного анализа (Burkin et al., 2000; Kononenko et al., 2003; Kononenko, Burkin, 2008), нижние пределы количественных измерений соответствовали 85% уровню связывания антител. Результаты выражали как средние арифметические значения (M) со стандартной ошибкой среднего (± SEM) и как минимальные – средние – максимальные показатели для групп изолятов и общей выборки.

Для получения склероциев использовали агар Чапека, содержащий 3% нитрата натрия, и 2%-й агар с 5%-й добавкой овощных соков “5/2 agar”, pH 5.2 (Cotty, 1989) в виде аналога, приготовленного на основе мульти-сока “J-7 Тонус Фитнес” (ООО “Лебедянский”, Россия). В чашки Петри диаметром 90 мм вносили по 35 мл вышеуказанных сред, поверхность засевали 10-суточными культурами, выращенными на ЧДА, инкубировали в темноте при температуре 31°С и через пять суток ежедневно контролировали на наличие склероциев. По окончании эксперимента штаммы классифицировали как S-тип (диаметр <400 мкм), L-тип (диаметр >400 мкм) и NS-тип (не образующий склероции) по ранее предложенной шкале (Cotty, 1989). Оценку диаметра склероциев проводили с помощью микроскопа Nikon Eclipse E200 (Nikon, Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изоляты A. flavus, полученные из всех объектов, при культивировании на ЧДА образовывали быстрорастущие колонии с обильным спороношением различных оттенков желто-зеленого цвета, у которых наблюдалась значительная изменчивость по двум признакам – объему воздушного мицелия (от обильного до крайне слабого) и окрашиванию обратной стороны (от почти полного его отсутствия до розовато-коричневых тонов).

Эксперимент по оценке токсинообразования показал, что около половины изолятов не способны образовывать АВ₁ и ЦПК, а другие продуцируют ЦПК (табл. 2). Только два изолята, наряду с ЦПК, образовывали АВ₁, при этом в малых количествах, находящихся у предела определения методов (табл. 2). Примерно равномерное распределение между хемотипами (AB₁–/ЦПК+) и (AB₁–/ЦПК–) было свойственно не только всей изученной совокупности, но и каждой группе объектов – зерна, продуктов его переработки и зерновых смесей. У изолятов морфотипа (AB₁–/ЦПК+) содержание ЦПК варьировало от 20 до 468 нг/г, за одним исключением (1350 нг/г), при этом 80% из них образовывали ЦПК в количествах от 20 до 200 нг/г и средний по выборке уровень накопления составил 165 нг/г (табл. 2).

Не были выявлены изоляты, исключительной особенностью которых является биосинтез АВ₁, а также образующие СТЕ – биосинтетический предшественник афлатоксинов, редкий среди метаболитов грибов Aspergillus секции Flavi (Frisvad et al., 2019). Полученные данные свидетельствуют о слабом токсигенном потенциале популяции A. flavus, представленной в отечественной зернопродукции. Редкое обнаружение продуцентов АВ₁ (2%) вполне согласуется с ранее проведенной оценкой афлатоксигенности этого гриба, часто встречающегося на зерновых кормах в разных климатических зонах СССР, которую либо не находили вовсе, либо определяли с частотой не более 6.8% (Malinovskaya, Soboleva, 1980).

Изоляты из образцов зерна пшеницы и соевого шрота, проявившие способность к биосинтезу АВ₁ совместно с ЦПК, находились среди повторов (дублей), при этом совмещенные с ними культуры относились к типичным формам (табл. 3). Если бы результаты осмотра первичных посевов не были учтены, этот редкий формат токсинообразования мог остаться незамеченным. По двум изменчивым у данного вида визуальным признакам все четыре культуры не отличались – колонии имели развитый воздушный мицелий и обратную сторону без окраски.

Парные изоляты из трех других образцов – зерна ячменя (№ 454) и двух зерновых смесей (№№ 44, 107) – были одинаковы и либо соответствовали хемотипу с накоплением ЦПК на уровнях 100–400 нг/г, либо не образовывали токсины (табл. 3), при этом у них колонии были без воздушного мицелия и имели розовато-коричневую обратную сторону. Напротив, среди изолятов из зерновой смеси (№ 426) один относился к хемотипу со слабым продуцированием ЦПК (менее 100 нг/г), а второй не образовывал токсины. В этом случае и колонии резко отличались по степени развития мицелия и окраски на реверсе. Очевидно, для более полной информации по структуре популяции этого вида гриба целесообразно для каждого образца проводить внимательный осмотр первичных посевов и при выявлении каких-либо особых черт проводить подробное описание их морфологических признаков.

При определении морфотипов гриба путем культивирования изолятов на агаре Чапека с добавлением 3%-го нитрата натрия процесс образования склероциев был длительным и в отдельных случаях занимал до 21 сут, при этом склероции, как правило, были многочисленными и довольно крупными (рис. 1).

Рис. 1.

Общий вид (а) и фрагмент (б) колонии изолята Aspergillus flavus № 87/5 из белковой добавки после 20 сут культивирования на агаре Чапека с 3% нитрата натрия при 31°С без освещения.

На аналоге среды “5/2 agar” процесс завершался гораздо быстрее – как правило, за 10 сут. Более того, образование склероциев было в 1.5 раза эффективнее, и склероции удалось получить у 78 культур из 98 (табл. 4). На трудности при попытках индуцировать этот процесс у A. flavus и на других средах – картофельно-глюкозном агаре (potato-dextrose agar, PDA), ЧДА, агаре Чапека с добавками нитрата натрия в разных количествах и сахарозы – указывали авторы нескольких работ (Cotty, 1989; Razzaghi-Abyaneh et al., 2006; Mamo et al., 2018), но эта проблема так и остается нерешенной. По мнению авторов, среда “5/2 agar” достаточно эффективна для определения морфотипов этого гриба и может быть использована как основа для развития методологии при популяционных исследованиях.

Диаметр склероциев, образованных изолятами на обеих средах, превышал 400 мкм, следовательно, все культуры относились к L-морфотипу (табл. 4). S-морфотипы среди них отсутствовали. Факт образования крупных склероциев у 78 из 98 обследованных культур позволяет считать L-морфотип доминирующим в популяции, ассоциированной с зерновой агропродукцией в Европейской России, и служит еще одним аргументом в пользу положительной корреляции этого признака со слабым токсигенным потенциалом гриба.

Согласно данным зарубежных исследователей, абиотические факторы способны активно влиять на интенсивность токсинообразования этого вида (Abdel-Hadi et al., 2012). Так, у одного из изолятов A. flavus с повышением влажности, температуры, продолжительности роста, а также при смене агаризованных субстратов, накопление ЦПК резко возрастало (Astoreca et al., 2014). Действительно, проблема обширной контаминации агропродукции токсичными метаболитами A. flavus особенно актуальна для регионов с тропическим и субтропическим климатом (Cotty, Jaime-Garcia, 2007; Giray et al., 2007; Hussaini, 2011) и признается менее значимой в Европе (Streit et al., 2012; Perrone et al., 2014). Однако в 2003 г. на севере Италии произошел неожиданный инцидент с интенсивной контаминацией зерна кукурузы АВ₁ и накоплением афлатоксина М₁ в коровьем молоке в концентрациях, превышающих норматив ЕС (Piva et al., 2006: Giorni et al., 2007). Известно, что европейская популяция A. flavus состоит преимущественно из L-штаммов, но смещение средних температур в сторону их повышения может способствовать распространению высокотоксигенных S-штаммов A. flavus и кардинально изменить ситуацию с загрязненностью агропродукции (Pietri et al., 2012).

В России АВ₁ и ЦПК крайне редко были обнаружены при регулярном мониторинге зерновой продукции из 39 субъектов 7 федеральных округов в период с 2009 по 2019 г. (Kononenko et al., 2020), но, судя по региональным данным, возможно усиление контаминации – так, в 2004–2014 гг. на юге страны аспергиллотоксины в зерне и зерносмесях находили довольно часто и нередко с превышением ПДК (Drobin et al., 2015). В связи с этим важно продолжить исследования в тех географических районах, где климатические условия могут приводить к изменениям в токсинообразовании этого гриба, а также провести эксперименты с зерновыми культурами в условиях с контролируемыми внешними параметрами. Подобные обследования целесообразно распространить и на популяцию A. flavus из травянистых луговых растений, в которых контаминация ЦПК гораздо более выражена (Burkin et al., 2018) и среди изолятов найдены высокоактивные продуценты (Burkin et al., 2006).

Повышенный интерес к штаммам A. flavus, лишенным способности к токсинообразованию, объясняется успешной практикой их применения для биологической коррекции ситуаций в зонах с высоким риском контаминации продукции микотоксинами (Alaniz Zanon et al., 2018). До сих пор продолжается активный поиск культур с частичной или полной утратой генов, обеспечивающих биосинтез афлатоксинов и ЦПК, в частности, с использованием первичных и вторичных генных маркеров (Mamo et al., 2018). Исчерпывающая оценка их безопасности и стабильности не менее важна и в биотехнологической отрасли, поскольку A. flavus и таксономически близкий ему вид A. oryzae (Ahlb.) Cohn, а также A. niger Tiegh., A. foetidus Thom et Raper, A. fumigatus Fresen. и A. ochraceus G. Wilh. давно используются для получения протеолитических ферментов (Osmolovskiy et al., 2019), а с недавнего времени – в качестве пептидно-аминокислотных ингредиентов в пищевых и кормовых добавках (Serba et al., 2020).

Таким образом, реализация комплексного подхода с описанием хемо- и фенотипических характеристик для объемной выборки изолятов гриба A. flavus позволила установить слабый потенциал токсигенности природной популяции и ее однородный состав, представленный исключительно L-морфотипами. Дана оценка рисков контаминации афлатоксином В₁, циклопиазоновой кислотой и стеригматоцистином зернопродукции из центральных областей Европейской части России. В ходе выполнения работы выявлены методологические приемы, требующие доработки, и обозначены перспективные направления будущего научного поиска, имеющие фундаментальное и прикладное значение.

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013–2020 гг. (ГП 14, направление 160, номер государственной регистрации АААА-А19-119071690020-2).