Микология и фитопатология, 2022, T. 56, № 4, стр. 284-293

ВВЕДЕНИЕ

Вироид веретеновидности клубней картофеля (ВВКК или PSTVd – Potato spindle tuber viroid) – опасный патоген многих видов растений, включая картофель, у которого он вызывает карантинное заболевание – готическую болезнь картофеля, проявляющуюся в угнетенном росте растения, пожелтении и деформации листьев, а также образовании мелких деформированных клубней иногда веретеновидной формы. Проявление симптомов болезни зависит от штамма вироида и сорта картофеля (Pfannenstiel, Slack, 1980).

ВВКК относится к роду Pospiviroid семейства Pospiviroidae РНК-содержащих вирусов и состоит из кольцевой одноцепочечной РНК длиной 356–363 нуклеотида. ВВКК – наименьший среди растительных патогенов, лишенных способности кодирования белков, размножается с использованием механизма транскрипции хозяина (Yanagisawa et al., 2019; Katsarou et al., 2022). Известно, что вироид реплицируется в ядрах живых клеток растений-хозяев, подвергается деградации под воздействием ферментов растений с образованием малых РНК, которые нарушают экспрессию хозяйских генов путем РНК-интерференции (Avina-Padilla et al., 2018; Navarro et al., 2021).

Хозяевами ВВКК является широкий круг видов растений – не менее 138 видов из 10 семейств (Singh, 1973). Основные хозяева относятся к семейству Solanaceae (Owens et al., 1992; Mertelik et al., 2010; Mackie et al., 2016). Описаны механизмы передачи вироида от одного хозяина к другому механическим путем и с помощью насекомых (тлей) (Syller et al., 1997; Hadidi et al., 2022). Роль фитопатогенных грибов в процессах передачи вироидов остается неясной. Проведенные недавно исследования показали, что фитопатогенные грибы трех видов аскомицетов – Cryphonectria parasitica, Valsa mali и Fusarium graminearum, искусственно зараженные семью видами вироидов, относящихся к семействам Pospiviroidae и Avsunviruidae, способны поддерживать репликацию некоторых вироидов (Wei et al., 2019). Нами показано, что оомицет Phytophthora infestans может инфицироваться вироидом ВВКК в процессе колонизации растения картофеля, зараженного вироидом, сохранять вироид в чистой культуре Ph. infestans в мицелии и зооспорангиях в течение, по крайней мере, трех генераций патогена в чистой культуре и может быть переносчиком в здоровые растения картофеля и томата (Afanasenko et al., 2022). Логично предположить, что и в природных условиях в патосистеме “виды картофеля – Ph. infestans”, эволюционирующей в течение многих тысяч лет, происходит двунаправленный обмен вироидами, в частности ВВКК.

Целью данного исследования был скрининг природных изолятов Ph. infestans на наличие ВВКК для выявления возможной роли оомицета в сохранении и передаче вироида.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ

Изоляты 2020 г. через пять пассажей на питательной среде (один пассаж составляет 30 дней) тестировали на наличие вироида ВВКК методом ОТ-ПЦР с праймерами Р3/Р4. 19% изолятов показали положительный результат диагностики ВВКК и продукты амплификации двух изолятов (№№ 3 и 40, выделенные из сортов Гала и Sarpo Mira соответственно) были секвенированы в обоих направлениях без клонирования (ампликоны KFH3 и SM4, ON211304 и JN211305) (табл. 2).

Все изоляты 2022 г. выделения были вначале тестированы методом ОТ-ПЦР-РВ с использованием тест-системы собственной разработки. В 72% изолятов данным методом было подтверждено наличие ВВКК. Для подтверждения полученных результатов была проведена диагностика ВВКК с наборами праймеров Р3/Р4 и 6Pospi F/R методом ОТ-ПЦР. Выборочные данные по ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными для семейства вироидов Pospiviroidae, представлены на рис. 1 и 2.

Рис. 1.

ОТ-ПЦР диагностика ВВКК в изолятах Phytophtora infestans с праймерами Р3/Р4 (а) и праймерами 6 Pospi F/R (б): 1 – изолят № 79 (сорт Аляска); 2 – № 43 (сорт Эволюшен); 3 – № 78 (с. Аляска); 4 – сорт томата Rutgers, зараженный ВВКК; 5 – вода; М – маркер молекулярных весов 100 п.н. (Gene Ruller, Fermentas).

Рис. 2.

Диагностика полевых изолятов Phytophthora infestans методом ОТ-ПЦР с праймерами 6Pospi F/R. Размер диагностического ампликона 260 п.н. По краям геля – маркеры молекулярных весов: слева 100 bp (Gene Ruller, Fermentas), справа 50 п.н. (Primetech DNA Ladder) и 50 п.н. (Gene Ruller, Fermentas). Образцы: 1–4 и 6–12 – изоляты Ph. infestans №№ 107, 43, 62, 83 и 57, 54, 106, 90, 96, 91, 70; 5 – томат сорта Rutgers, зараженный ВВКК в качестве позитивного контроля; 13 – вода (негативный контроль). Звездочкой отмечены слабые продукты амплификации.

Для внутреннего контроля способности РНК изолятов Ph. infestans к амплификации использовали праймеры, специфичные для области ITS рРНК Ph. infestans. Этот тест имеет особое значение для верификации негативных результатов ОТ-ПЦР с вироид-специфичными праймерами. На рис. 3 приведен пример ОТ-ПЦР амплификации РНК нескольких изолятов Ph. infestans, у которых ранее не были получены продукты амплификации с вироид-специфичными праймерами, несмотря на способность кДНК этих образцов к амплификации (рис. 3).

Рис. 3.

ОТ-ПЦР диагностика изолятов Ph. infestans с праймерами ITS4/ITS5 (диагностический фрагмент 946 п.н.). 1–6 – изоляты, показавшие негативный результат амплификации с вироид-специфичными праймерами; 7 – вода (негативный контроль); М – маркеры молекулярных весов 1 КБ (Gene Ruller, Fermentas).

Для доказательства наличия вироидов в изолятах Ph. infestans 2022 г. продукты амплификации 5 изолятов №№ 87, 91, 79, 43 и 78 c праймерами, специфичными для вироидов семейства Pospiviroidae (6Pospi F/R) и изолята № 79 с праймерами Р3/Р4 были секвенированы по 3 клона каждого ампликона. В табл. 2 представлены результаты секвенирования отдельных клонов продуктов амплификации: идентификация вида в системе BLAST, депонированная нуклеотидная последовательность, представленная GenBank N ON211287-ON211305 и процент идентичности с филогенетически наиболее близким штаммом ВВКК.

Ампликоны с ВВКК-специфичными праймерами всех проанализированных изолятов Ph. infestans были идентифицированы как ВВКК. Большинство нуклеотидных последовательностей оказались филогенетически наиболее близки к имеющимся в базе данных BLAST (viruses and viroids) штаммам ВВКК российского происхождения (Kastalyeva et al., 2009; Owens et al., 2012) (табл. 2). Клоны Ph7-2 и Ph5-1 показали 100%-ю идентичность с частью генома (74%) штамма ODN, выделенного из картофеля в Китае в 2012 г. (GenBank N KR611362) 1 (рис. 4). Ампликон изолята SM4 показал 99.72% гомологии с изолятом ВВКК MK330993.1 (79% нуклеотидной последовательности), выделенным из Solanum anguivi в Гане (Западная Африка) в 2016 г. Этот же ампликон показал 91.23% идентичности со штаммом другого вида рода Pospiviroid – Tomato chlorotic dwarf viroid (TCDV) (GenBank N EU729744), выделенного из Solanum lycopersicum во Франции (Condresse et al., 2010) (рис. 5).

Рис. 4.

Идентификация ампликона Ph5-1 по сходству нуклеотидных последовательностей в системе BLAST.

Рис. 5.

Идентификация ампликона SM4 по сходству нуклеотидных последовательностей в системе BLAST.

На рис. 2 показано, что у части изолятов Ph. infestans получены слабые продукты амплификации с праймерами 6Pospi F/R. В коллекционном штамме Ph. infestans MP4118 был секвенирован слабый ампликон с праймерами Р3/Р4, который оказался на 99.4% гомологичен гену, кодирующему гипотетический белок мРНК Ph. infestans и других оомицетов (Tyler et al., 2006) (рис. 6).

Рис. 6.

Идентификация ампликона MP1841 по сходству нуклеотидных последовательностей в системе BLAST.

Нуклеотидные последовательности штаммов ВВКК, выделенных из мицелия изолятов Ph. infestans, имеют отличия как от референсного штамма ВВКК VP87 (LC523667.1), так и между собой. Варианты сиквенсов каждого ампликона в отдельности также различаются между собой. Наиболее дивергентными вариантами сиквенсов ампликонов относительно референсного штамма можно считать KFH3, Ph701, Ph703, SM4 и Ph202 (рис. 7).

Рис. 7.

Филогенетические отношения между штаммами ВВКК, выявленными в мицелии полевых изолятов Phytophthora infestans. В качестве внешней группы использовали штамм VP87 (LC523667.1).

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что вироиды заражают широкий круг растений-хозяев и могут реплицироваться как в растениях (Diener, 1995), так и других организмах – например, ASBV (avocado sunblotch viroid) из семейства Avsunviruidae в дрожжах (Delan-Forina et al., 2011) и цианобактерях (Latifi et al., 2016).

Имеется только одна работа, в которой показаны возможность успешного заражения вироидами трех видов мицелиальных грибов и способность вироидов размножаться в грибном мицелии (Wei et al., 2019). Изучена возможность инфицирования вироидом трех видов фитопатогенных аскомицетов – Cryphonectria parasitica, Valsa mali и Fusarium graminearum – возбудителей гнили каштана, язвенной болезни яблока и фузариоза пшеницы/ячменя/початков кукурузы соответственно. Сферопласты этих трех грибов инфицировали in vitro транскриптами РНК, полученными из кДНК семи вироидов. Для инокуляции использовали кДНК-клоны вироидов, относящихся к семействам Pospiviroidae [PSTVd; chrysanthemum stunt viroid (CSVd), hop stunt viroid (HSVd), apple scar skin viroid (ASSVd)] и Avsunviroidae [avocado sunblotch viroid (ASBVd), peach latent mosaic viroid (PLMVd)]. Ранее было показано, что вироиды передаются через гифальные анастомозы и конидиями, т.е. механизмами, которые известны как горизонтальная и вертикальная трансмиссия миковирусов (Eusebio-Cope et al., 2015). В грибах наблюдается стабильная аккумуляция вироидов, что указывает на возможность их репликации (Wei et al., 2019). Эти же авторы указывают на дополнительное свидетельство способности вироидов реплицироваться в грибах – факты обнаружения нуклеотидных замен в геноме вироидов HSVd и ASVd через восемь пассажей инокулированных вироидами грибов Fusarium graminearum и Cryphonectria parasitica (Wei et al., 2020). Двунаправленный перенос вироида между растением и грибами показан для триады Fusarium graminearum – HSVd – Nicotiana benthamiana (Wei et al., 2019). Таким образом, в лабораторных условиях показана способность вироидов реплицироваться в мицелиальных грибах, которые могут передавать их другим хозяевам. Нами на основании ранее полученных результатов о возможности трансмиссии ВВКК от картофеля в мицелий Phytopthora infestans и обратно в лабораторных условиях (Afanasenko et al., 2022) была выдвинута гипотеза, что возбудитель фитофтороза картофеля оомицет Ph. infestans в процессе коэволюции с растениями семейства Solanaceae приобрел и сохранил в качестве своего внутриклеточного паразита или эндофита вироид(ы), способные паразитировать также на растениях-хозяевах. Основанием для такой гипотезы было предположение, что вироиды являются “живыми ископаемыми”, сохранившимися из доклеточного мира РНК (Diener, 1989) и, по-видимому, являются первичными патогенами и растений, и оомицетов.

В нашей работе большинство изолятов Ph. infestans были выделены из инфекционного материала, собранного на делянках госсортоучастка Московской обл., на котором ежегодно возделывается более 50 сортов картофеля различного происхождения. Известно, что наибольшей изменчивостью отличаются популяции фитопатогенов в генетически неоднородных посадках растений-хозяев. В связи с этим предполагалось, что генетическое разнообразие полевых изолятов Ph. infestans повысит вероятность обнаружения у них различных штаммов ВВКК. Из листьев растений картофеля с типичными симптомами фитофтороза были выделены чистые культуры Ph. infestans. Методом ОТ-ПЦР с вироидоспецифичными праймерами ампликоны были получены практически у всех изолятов. У большинства этот фрагмент был слабым, но часть изолятов показала ярко выраженный диагностический фрагмент, который можно было элюировать из геля и секвенировать. Часто встречаемые неяркие фрагменты продуктов амплификации, по-видимому, можно объяснить как наличием вироида, так и неспецифическим праймированием хозяйского гена. Удалось секвенировать слабый ампликон с праймерами Р3/Р4 для одного изолята Ph. infestans МР 1841, который оказался идентичен гену, кодирующему рибосомальный белок оомицетов, т.е. являлся результатом неспецифического праймирования хозяйского гена Ph. infestans.

Восемь ампликонов были клонированы, секвенированы и идентифицированы по сходству с последовательностями, представленными в GenBank. Всего в системе BLAST нами проанализировано 20 нуклеотидных последовательностей. Подавляющее большинство (19 клонов) были идентифицированы как ВВКК. Из них четыре полногеномные последовательности (~360 п.н.), остальные представляют часть (~260 п.н.) генома ВВКК.

Малое количество проанализированных сортов и клонов ВВКК не позволяет делать какие-либо выводы о связи между устойчивостью сорта к возбудителю фитофтороза и изменчивостью вироида.

Выявленные нами различия между клонами одного ампликона согласуются с представлением о существовании вироида ВВКК в форме квазивида, т.е. в виде популяции молекул с некоторыми нуклеотидными отличиями, динамика которых меняется в процессе патогенеза (Adkar-Purushothama et al., 2020).

Таким образом, нами представлены доказательства совместного существования возбудителя фитофтороза картофеля и вироида, идентичного по молекулярной характеристике вироиду ВВКК. Наиболее интересным направлением будущих исследований станет изучение патогенных свойств штаммов ВВКК, обитающих в мицелии Ph. infestans.

Работа поддержана грантом РНФ № 20-46-07001.