Молекулярная биология, 2019, T. 53, № 1, стр. 64-73

ВВЕДЕНИЕ

Длинные некодирующие РНК (lncRNA) – группа некодирующих РНК, состоящих обычно более чем из 200 н. и транскрибируемых РНК-полимеразой II. lncRNA играют важную роль в таких процессах, как эмбриогенез, метастазирование и апоптоз [1]. Однако механизмы регуляторного действия lncRNA, число которых постоянно возрастает, а функции активно изучаются, установлены только в незначительном числе случаев.

В 2012 г. был открыт новый функциональный класс lncRNA, антисмысловых по отношению к мРНК С-концевой убиквитин-гидролазы L1 (AS Uchl1), которые могут способствовать посттранскрипционной регуляции трансляции смысловой мРНК путем рекрутирования полисом на мРНК [2]. В нашей лаборатории [3], а также в других работах [4] на основе AS Uchl1 разработан универсальный инструмент для усиления трансляции специфических мРНК млекопитающих, названный “RNA enhancement” (RNAe) и SINEUP соответственно. Кроме того, с использованием медаки в качестве модели болезней человека показано, что SINEUP-cox7B позволяет избежать проявлений гаплонедостаточности [5], а у трансгенных мышей RNAe-mGH (гормон роста мыши) повышен размер и вес [6]. Результаты этих исследований показывают, что RNAe (SINEUP) можно использовать in vivo, раскрывая потенциал их применения в генотерапии для усиления экспрессии генов-мишеней при так называемых болезнях гаплонедостаточности. Кроме того, создан набор методов скрининга оптимизированных доменов RNAe-lncRNA, которые расширяют возможности применения этого подхода к любому представляющему интерес гену-мишени [7].

RNAe-lncRNA содержит два важных элемента – сегмент длиной 72 н., узнающий мРНК-мишень, и функциональный элемент 167 н. SINEB2. SINEB2 относится к подсемейству SINE, представленному ретротранспозонами, охарактеризованными у различных многоклеточных организмов [8]. Насколько нам известно, нет данных о том, что SINEB2 регулируют трансляцию. Исключением является AS Uchl1. Выяснение механизма этого особого типа регуляции важно для получения дополнительных знаний о семействе SINE.

Важную роль в функционировании RNAe-lncRNA играет вторичная структура lncRNA. Чтобы получить RNAe-lncRNA в функциональном состоянии, мы подобрали условия фолдинга RNAe-lncRNA в опытах по рефолдингу. Механизм действия RNAe-lncRNA изучали, анализируя вторичную структуру SINEB2 [9]. В представленной работе биохимические основы процесса RNAe изучены путем поиска lncRNA-связывающих белков, сопровождающих процесс трансляции.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культуры клеток. Клетки линии HEK 293T культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (“Gibco”, C11885500BT, США), содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) (“Gibco”, 16000-044) и 1× раствор пенициллина-стрептомицина (“Corning”, 30-002-CI) при 37°C в атмосфере с 5% CO₂.

Клетки Escherichia coli. Клетки E. coli Trans1-T1 (“Transgene Biotech.”, Индия, CD501-03) и BL21 (DE3) (“Transgene Biotech.”, CD601-02) культивировали в среде Luria-Bertani (LB), содержащей соответствующие антибиотики, при постоянном перемешивании при 200 об./мин при 37°C.

Конструирование плазмид. Детали конструирования плазмид приведены в дополнительной табл. 1S (см. Приложение на сайте http://www.molecbio.ru/ downloads/2019/1/supp_Jin_rus.pdf). Ферменты для манипуляций с ДНК получены в “Fermentas” (США).

Трансфекция клеток. Клетки HEK 293T пассировали до достижения 70–90% монослоя. Проточную цитометрию (FCM) проводили, используя клетки, трансфицированные 0.2 мкг плазмиды pEGFP-C1 и 1.2 мкг плазмидной ДНК для RNAe на лунку 12-луночного планшета. Аффинность РНК-связывающих белков определяли с использованием 9.0 мкг плазмиды для определения белка и 6.0 мкг плазмиды pminRNAe или p8×MS2bs на чашку диаметром 100 мм. EMSA проводили, используя клетки, трансфицированные 15 мкг плазмидной ДНК, экспрессирующей белок, на чашку диаметром 100 мм. Трансфекцию проводили с использованием линейного полиэтиленимина (PEI) (мол. масса 25 000, “Polysciences” ФРГ, 23966-2) при соотношении ДНК : PEI = 1 : 2). Клетки инкубировали в течение 48 ч, а затем собирали.

Проточная цитометрия (FCM). Через 48 ч после трансфекции клетки обрабатывали трипсином и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS). Флуоресценцию зеленого флуоресцентного белка (GFP) измеряли на цитометре Flow Cytometry instrument (“BD Biosciences”, США, BD LSRFortessa) при длине волны возбуждения и эмиссии 488 и 501 нм соответственно.

Транскрипция in vitro. В качестве матриц для транскрипции in vitro использовали расщепленные HindIII линеаризованные плазмиды (pFL-RNAe, pminRNAe-HindIII, pSINEB2, pGFP-PS). Транскрипцию проводили, используя набор HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit (“New England Biolabs”, США, E2050S). Транскрибированные РНК экстрагировали, используя TRIzol® LS Reagent (“Ambion”, США 10296010), в соответствии с протоколом производителя. Затем РНК денатурировали и подтверждали ее целостность с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле (РНК > 1 т.н.) или в 10%-ном денатурирующем полиакриламидном геле (PAGE) (РНК < 1 т.н.).

Опыты по рефолдингу РНК. В ходе первых опытов оценивали пригодность протоколов рефолдинга РНК. С этой целью определяли состояние фолдинга в 6%-ном PAGE с использованием следующих буферов и протоколов.

Буферы для рефолдинга: дважды деионизированная вода (DDW) и Трис-буфер получали в системе обработки воды Milli-Q (“Millipore”, США). Tрис-буфер: 50 мM Tрис-HCl (pH 8.0), 150 мM NaCl, 3 мM MgCl₂.

Процедуры рефолдинга: быстрое охлаждение, резкое охлаждение, медленное охлаждение.

Быстрое охлаждение: раствор РНК подвергали денатурации при 80°C в нагревательном блоке в течение 5 мин, а затем немедленно охлаждали во льду.

Резкое охлаждение: РНК после денатурации при 80°C в течение 5 мин в нагревательном блоке сразу же охлаждали во льду в течение 5 мин, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин.

Медленное охлаждение: после денатурации при 80°C в течение 5 мин в нагревательном блоке РНК медленно охлаждали до комнатной температуры, инкубируя в выключенном нагревательном блоке, после чего выдерживали при комнатной температуре в течение 20 мин.

РНК pull-down анализ белков. РНК транскрибировали in vitro и тагировали по 3'-концу, используя набор Pierce™ RNA 3' End Desthiobiotinylation Kit (“Thermo Scientific”, 20163, CША). Полученную биотинилированную РНК подвергали рефолдингу в DDW, используя протокол медленного охлаждения, и проводили “pull down” цитоплазматических белков с помощью Pierce™ Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit (“Thermo Scientific”, 20164). Цитоплазматические белки клеток HEK 293T экстрагировали, используя набор PARIS™ Kit (“Ambion”, AM1921), в соответствии с инструкциями производителя.

Минорные преципитированные белки детектировали, используя окрашивание серебром (“Beyotime”, P0017s), после разделения в 10%-ном SDS-PAGE. Кроме того, после SDS-PAGE и окрашивания Сoomassie brilliant blue (“Huaxingbio”, 04808274, Китай) основные белки отправляли в Центр биомедицинского анализа Университета Цингуа (Center of Biomedical Analysis, Tsingua University) для идентификации методом LC-MS/MS-масс-спектрометрии (“Thermo Scientific”, Q-Exactive). Критерием отсечения для идентификации потенциальных RNAe-lncRNA-связывающих белков считали 10 [10].

Вестерн-блот-анализ. Белки, полученные методом “pull-down”, анализировали с помощью Вестерн-блотинга. Белки разделяли в 10%-ном SDS-PAGE. Анти-eEF1A1, -ILF3, -NCL и -eIF4A1-антитела мыши получали от фирмы “Santa Cruz Biotechnology” (sc-377315, sc-377406, sc-8031, sc-377315). Моноклональные антитела мыши с His-тагом и вторые антимышиные антитела козы, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), получены от “Huaxingbio” (HX1804, HX2032). Блоты проявляли, используя реагенты для хемилюминесценции (ECL) (“Huaxiobio”, HX1868) и имиджер (GE, ImageQuant LAS 4000) для визуализации.

Аффинность РНК-связывающих белков. Через 48 ч после трансфекции плазмидами, обеспечивающими экспрессию РНК и белков, клетки HEK 293T подвергали УФ-облучению (254 нм, 2000 Вт, 400 мДж/cм²), дважды промывали холодным PBS (4 мл на чашку диаметром 100 мм), после чего добавляли 1 мл лизирующего буфера 1 (50 мM фосфат натрия pH 7.4, 300 мM NaCl, 2% Tритона X-100, 10% глицерина, 1 мM фенилметилсульфонилфторила (PMSF) (“Beyotime”, Китай, ST506-10 ml) и 400 ед./мл ингибитора РНКаз (“TaКaRa Bio”, КНР, 2313A), лизаты инкубировали с HisPur™ Cobalt Resin (“Thermo Scientific”, 89964) в течение 30 мин при 4°C. После промывки 20 мM раствором имидазола, оставшиеся белки элюировали 150 мM имидазолом. Затем РНК экстрагировали из элюата, используя TRIzol® LS Reagent (“Ambion”, 10296010). кДНК для анализа РНК синтезировали с помощью Fastquant RT Kit (“Tiangen”, Китай). Полуколичественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (RT-PCR) проводили с использованием SuperReal PreMix Plus (“SYBR Green”) master mix (“Tiangen”, FP205-02) на 7500 Fast Real-Time PCR System (“Applied Biosystems”, США, 7500 fast). В качестве внутреннего контроля при детекции РНК использовали 18S рРНК. RT-PCR проводили со следующими праймерами:

18S рРНК: F – CGAACGTCTGCCCTATCAACTT и R – ACCCGTGGTCACCATGGTA; minRNAe: F – TTGCTCACCATGGTGGCG и R – CAGTGTTTGGAACTCAATATCCATC; MS2bs: F – ACACGACGCTCTTCCGATCT и R – CACCATGGAAACAGACT.

Очистка белков. Через 48 ч после трансфекции плазмидами, обеспечивающими экспрессию белков с His-таг (p6×His-eEF1A1/ILF3/NCL/eIF4A1 соответственно), клетки HEK 293T снимали с подложки, добавляли 1 мл лизирующего буфера 2 (50 мM фосфата натрия, pH 7.4, 300 мM NaCl и 2% Tритона X-100, 10% глицерина, 1 мM PMSF). Лизат инкубировали с HisPur™ Cobalt Resin (“Thermo Scientific”, 89964) в течение 30 мин при 4°C. Отмывали 20 мM имидазолом, а затем оставшиеся белки элюировали 150 мM имидазолом и концентрировали ультрафильтрацией через Amicon® Ultra 3K Centrifugal Filter Device (“Millipore”, UFC501096) в соответствии с протоколом производителя, и определяли концентрацию белка, используя BCA Protein Assay Kit (“Tiangen”, 03522) и бычий сывороточный альбумин (ВSА) в качестве стандарта.

Очистка белков из клеток E. coli BL21 (DE3). После трансформации плазмидами, обеспечивающими экспрессию тагированных белков (p6×His-eEF1A1/ILF3/NCL/eIF4A1-BL21 соответственно), мы выбрали единичные колонии и перенесли их в 5 мл среды LB, а затем в 100 мл среды. После культивирования в течение 12 ч и индукции в течение 6 ч IPTG (“Sigma”, США), клетки собирали центрифугированием при 4000 g и обрабатывали ультразвуком в лизирующем буфере 3 (50 мM фосфат натрия pH 7.4, 300 мM NaCl, 0.1% Tритона X-100, 5% глицерина и 1 мM PMSF). Супернатант после центрифугирования лизата наносили на HisPur™ Cobalt Resin (“Thermo Scientific”, 89964). Промывали 20 мM имидазолом, а затем элюировали связавшиеся белки 150 мM имидазолом, концентрировали ультрафильтрацией через Amicon® Ultra 3K Centrifugal Filter Device (“Millipore”, UFC501096) и определяли концентрацию белков, используя BCA Protein Assay Kit (“Tiangen”, 03522) c BSA в качестве стандарта.

Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA). Транскрибированную in vitro РНК (0.5 мкг) подвергали рефолдингу и инкубировали с белками (6.0, 3.6, 1.8, 0.6, 0.0 мкг), очищенными из клеток HEK 293T или E. coli BL21 (DE3), в связывающем буфере (50 мM фосфат натрия pH 7.4, 100 мM NaCl, 5 мM MgCl₂) при 4°C в течение 30 мин. Затем комплексы разделяли в 6%-ном PAGE на льду при 200 мВ в течение 1–2 ч. Нуклеиновые кислоты и белки окрашивали по отдельности SYBR® Green и SYPRO® Ruby, соответственно, используя Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Kit (“Molecular Probes”, E33075, США), и визуализировали с помощью системы имиджинга (Ultra-Violet Products, GelDoc-It Ts) с УФ-эпииллюминатором при 254 нм.

Статистический анализ. Статистический анализ проводили, используя парный t-тест Стъюдента. Результаты представлены в виде средних значений (n ≥ 3) ± стандартная ошибка (SD). Значимыми считали величины при P < 0.05, P < 0.01 или P < 0.001 (отмечено одной, двумя или тремя звездочками соответственно).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Медленное охлаждение в DDW – подходящий протокол фолдинга RNAe-lncRNA

SINEB2 – функциональный элемент RNAe-lncRNA, с помощью которого в комбинации со спаривающимся сегментом minRNAe-lncRNA может выполнять свои функции (рис. 1a, б) [3, 4]. Мы транскрибировали полноразмерную RNAe (FL-RNAe) lncRNA, minRNAe-lncRNA и SINEB2 in vitro (рис. 1a) и после подтверждения чистоты полученных РНК (рис. 1в) проверяли возможность использования для их рефолдинга DDW и Трис-буфера (pH 7.4) (рис. 1г). Мониторинг состояния РНК осуществляли с помощью PAGE, в котором из-за формирования компактной 3D структуры “свернутые” РНК должны мигрировать быстрее, чем “развернутые”. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при использовании DDW или Трис-буфера отсутствуют различия в фолдинге FL-RNAe-lncRNA и SINEB2. Однако minRNAe-lncRNA не может полностью “сворачиваться” в Трис-буфере, что подтверждается появлением четырех полос “несвернутых” РНК в дорожке геля (рис. 1г). DDW можно считать наиболее подходящей для системой для РНК, имеющих отношение к RNAe.

Рис. 1.

Определение условий фолдинга RNAe-lncRNA. а – Схема FL-RNAe-lncRNA, minRNAe-lncRNA их мишени – мРНК egfp. Показан паттерн спаривания. б – 0.2 мкг pEGFP-C1 и 1.2 мкг ДНК pRNAe-mock, pFL-RNAe или pminRNAe на лунку 12-луночного планшета использовали для котрансфекции клеток HEK 293T. После инкубации в течение 48 ч клетки собирали и детектировали флуоресценцию GFP с помощью FCM для оценки влияния FL-RNAe-egfpc1 и minRNAe-egfpc1 на мРНК egfpc1. в – Проверка чистоты РНК, транскрибированных in vitro, с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле (FL-RNAe-lncRNA) или в 10%-ном денатурирующем PAGE (minRNAe-lncRNA и SINEB2). г – Анализ фолдинга РНК в DDW и Трис-буфере (50 мM Трис-HCl pH 8.0, 150 мM NaCl, 3 мM MgCl₂) с помощью PAGE в 6%-ном геле. U – несвернутая РНК (отсутствие рефолдинга), F – свернутая РНК. д – Анализ рефолдинга РНК с использованием различных процедур (F1, F2 и F3) с помощью PAGE в 6%-ном нативном геле. U – несвернутая РНК (отсутствие рефолдинга); F1 – быстрое охлаждение (после денатурации при 80°C в течение 5 мин в нагревательном блоке раствор РНК немедленно охлаждали во льду); F2 – резкое охлаждение (после денатурации при 80°C в течение 5 мин в тепловом блоке РНК немедленно охлаждали во льду в течение 5 мин с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 20 мин; F3 – медленное охлаждение (после денатурации при 80°C в течение 5 мин в нагревательном боксе РНК медленно охлаждали до комнатной температуры, инкубируя в выключенном нагревательном боксе, после чего выдерживали в течение 20 мин при комнатной температуре. е – Проверка влияния DMSO и магния на рефолдинг RNAe-lncRNA. U – несвернутая РНК, инкубированная в DDW, 0/3/10; в растворе, содержащем 0/3/10 мM магния; D – в растворе, содержащем 25% DMSO.

Мы сравнили также три разных метода отжига при рефолдинге РНК в DDW: быстрое, резкое и медленное охлаждение (F1, F2, F3 на рис. 1д). Обнаружено, что полнота рефолдинга изменяется в следующем порядке при разных режимах охлаждения: медленное > резкое > быстрое. РНК, имеющие отношение к RNAe, особенно SINEB2, могут сворачиваться в режиме медленного охлаждения с образованием единственной формы (рис. 1д). Напротив, быстрое охлаждение дает худший результат, поскольку при низкой (комнатной) температуре РНК остается в денатурированном состоянии (расплавленном при нагревании до 80°C). Обнаружено, что большая часть нативного SINEB2 (несвернутая группа) уже находится в свернутом состоянии (рис. 1д). Кроме того, выше свернутой РНК находится небольшое количество отстающих полос, содержащих несвернутые РНК.

С целью улучшения фолдинга разных видов РНК в буфер для фолдинга (DDW) добавляли 25% диметилсульфоксида (DMSO) или магний в различной концентрации, чтобы проверить могут ли эти агенты способствовать фолдингу RNAe-lncRNA (рис. 1е). Однако DMSO и магний не влияли на фолдинг РНК, имеющих отношение к RNAe. Таким образом, медленное охлаждение в DDW – наиболее подходит для фолдинга РНК, связанных с RNAe.

Обнаружение шести белков, потенциально связывающих RNAe-lncRNA

Известно, что RNAe действует на посттранскрипционном уровне, но детали этого процесса не установлены. Однако RNAe-lncRNA не может активировать инициацию трансляции, так как не действует на некепированную РНК (данные не приведены). Поэтому мы предположили, что RNAe-lncRNA может ускорять трансляцию мРНК-мишени, действуя преимущественно как гидовая РНК, привлекающая и связывающая белки, имеющие отношение к трансляции, к 5'-концу мРНК-мишени. Чтобы понять детали этого механизма, мы начали изучение белков, связывающих RNAe-lncRNA. С помощью in vitro транскрипции были получены FL-RNAe-lncRNA, minRNAe-lncRNA, SINEB2 и GFP-PS (сегмент спаривания: сегмент мРНК egfpc1 длиной 72 н., спаривающийся с RNAe-egfpc1) (GFP-PS и minRNAe-lncRNA образуют другую группу) (рис. 2a). Чтобы предотвратить интерференцию ядерных белков, которые могут не вовлекаться в трансляцию, из клеток НЕК 293Т экстрагировали цитоплазматические белки. Затем 3'-концы этих РНК биотинилировали с помощью набора для биотинилирования. Методом медленного охлаждения провели рефолдинг полученных тагированных РНК в DDW и pull-down-анализ РНК с помощью набора RNA-protein pull-down kit. Полученные результаты проанализировали также с помощью SDS-PAGE с окрашиванием серебром для подтверждения отмывки неспецифически связавшихся белков (Suppl. Fig. 1 , см. Приложение на сайте http:// www.molecbio.ru/downloads/2019/1/supp_Jin_rus.pdf). Из гелей вырезали полосы, содержащие белки-мишени (рис. 2б), и идентифицировали их с помощью масс-спектрометрии (MS).

Рис. 2.

Поиск и идентификация RNAe-lncRNA-связывающих белков. а – Схема РНК, использованных в опытах по “RNA pull-down protein”. б – SDS-PAGE и окрашивание серебром элюатов каждой группы. в – Клетки HEK 293T котрансфицировали, используя 9.0 мкг pEGFP-C1, p6×His-eEF1A1, p6×His-ILF3, p6×His-NCL или p6×His-eIF4A1 и 6.0 мкг pminRNAe на чашку диаметром 100 мм. После инкубации в течение 48 ч клетки подвергали УФ-облучению и собирали для анализа аффинности РНК-связывающих белков. Результаты RT-PCR показывают повышение относительного содержания minRNAe-lncRNA с помощью белков, предположительно связывающих RNAe-lncRNA. В качестве внутреннего контроля использовали 18S рРНК, и каждую группу нормировали по индивидуальной РНК. г – Вестерн-блот-анализ фракций в ходе очистки белков-мишеней, представленных на рис. 2в.

Белки, способные связывать РНК на посттранскрипционной стадии, выбирали на основе их аннотаций в базе данных UniProt [11] и подразделили на пять групп (табл. 1). В группе негативного контроля (NC) обнаружено несколько РНК-связывающих белков, но только один белок – фактор элонгации 1альфа1 (eEF1A1) – найден во всех пяти группах. Три других белка – фактор 3, связывающий энхансер гена интерлейкина (ILF3), фактор 2, связывающий энхансер гена интерлейкина (ILF2) и нуклеолин (NCL) – обнаружены в четырех экспериментальных группах и характеризуются высокими значениями MS, что указывает на высокую вероятность связывания с RNAe-lncRNA. В группах minRNAe и FL-RNAe обнаружен белок 1, связывающий мРНК инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF2BP1). Напротив, несмотря на то, что эукариотический фактор инициации 4A-I (eIF4A1) появляется только в группе FL-RNAe, его роль в процессинге мРНК хорошо соответствует характеру процесса RNAe, поэтому мы решили, что этот фактор может быть кандидатом на роль RNAe-lncRNA-связывающего белка.

ILF2, один из шести потенциальных RNAe-lncRNA-связывающих белков всегда образует комплекс с ILF3, необходимый для выполнения его функций [12], поэтому ILF2 мог быть непрямо выявлен с помощью pull-down-анализа через ILF3. IGF2BP1 рекрутирует транскрипты-мишени на цитоплазматические мРНП, обеспечивая их транспорт и временное хранение [13]. После связывания с ними мРНК секвестрируются из пулов деградации и трансляции, что не согласуется с RNAe. Поэтому для дальнейшего изучения мы выбрали eEF1A1, ILF3, NCL и eIF4A1.

ILF3 и eIF4A1 могут взаимодействовать с RNAe-lncRNA in vivo и in vitro

Проверять взаимодействие белков и РНК in vivo можно методом анализа аффинности РНК-связывающих белков. Используя MS2 и MS2-связывающие сайты (MS2bs) в качестве положительного контроля (Suppl. Fig. 2 ), мы определили аффинность связывания RNAe-lncRNA с eEF1A1, ILF3, NCL и eIF4A1 соответственно. Обнаружено, что ILF3 и eIF4A1 существенно усиливают связывание, что свидетельствует о том, что RNAe-lncRNA действительно взаимодействует с этими белками. Напротив, eEF1A1 и NCL характеризовались слабым связыванием (рис. 2в, г).

После этого мы провели EMSA с целью проверки возможности прямого взаимодействия ILF3/eIF4A1 с RNAe-lncRNA. Белки сверхэкспрессировали и выделяли из клеток HEK 293T (рис. 3в). Затем белки инкубировали со свернутой minRNAe-lncRNA в течение 30 мин при 4°C и разделяли комплексы в 6%-ном нативном PAGE. Из рис. 3a,б видно, что по мере снижения количества ILF3/eIF4A1 количество свободной minRNAe-lncRNA возрастает, а количество “смещенной” minRNAe-lncRNA снижается. К таким же результатам привел анализ белков, продуцируемых в E. coli (Suppl. Fig. 3a ,б). Наконец, тот факт, что миграция minRNAe-lncRNA не изменяется в присутствии разных количеств BSA, подтверждает, что minRNAe-lncRNA не взаимодействует неспецифически со случайными белками (Suppl. Fig. 4a ). Кроме того, ILF3 (Suppl. Fig. 4b ) и eIF4A1 (Suppl. Fig. 4c ) не влияют на миграцию РНК MS2bs, не связанной с RNAe-lncRNA, т.е. они не взаимодействуют со случайными РНК. Таким образом, результаты EMSA показали, что minRNAe-lncRNA может взаимодействовать с ILF3 и eIF4A1 in vitro, и это взаимодействие является прямым и специфическим.

Рис. 3.

Идентификация прямого взаимодействия minRNAe-lncRNA с ILF3 и eIF4A1. а, б – Клетки НЕК 293Т котрансфицировали плазмидной ДНК – 15 мкг p6×His-ILF3 или p6×His-eIF4A1 на чашку диаметром 100 мм. После инкубации в течение 48 ч из клеток выделяли белки ILF3 или eIF4A1, очищали их и использовали для EMSA с транскрибированной in vitro minRNAe. minRNAe окрашивали SYBR Green после инкубации с ILF3 (a) или eIF4A1 (б) и разделения в 6%-ном PAGE. В дорожках “–” отсутствуют minRNAe-lncRNA, в дорожки “+” добавляли 0.5 мкг minRNAe-lncRNA. Количество экспрессированных в клетках HEK 293T белков ILF3 и eIF4A1, нанесенных на дорожки, составляло 6.0, 6.0, 3.6, 1.8, 0.6 и 0.0 мкг соответственно. в – Вестерн-блотинг фракций в ходе очистки белков-мишеней из а и б. г – Гипотетический механизм RNAe: спаривающийся сегмент узнает мРНК-мишень, SINEB2 усиливает трансляцию, рекрутируя ILF3 и eIF4A1 для ускорения сборки сканирующего комплекса и процесса инициации трансляции.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Наши попытки применить RNAe в клетках дрожжей (данные не приведены) были безуспешными, что может указывать на отсутствие в клетках дрожжей некоторых факторов, необходимых для RNAe, таких как ILF3. Белок ILF3, названный также NF90, DRBP76, MPP4 и NFAR, экспрессируется в клетках животных, но не дрожжей [14]. Это белок, связывающий дцРНК (DRBP), который содержит два мотива для взаимодействия с дцРНК (RBM). ILF3 связан с функциями РНК, включая регуляцию транскрипции и трансляции [15], репликацию и трансляцию вирусного генома [16], а также с функциями некодирующих РНК [17]. ILF3 способен связываться с 3'-нетранслируемыми участками (3'-UTR) определенных мРНК, способствуя загрузке полисом на мРНК и облегчая рекрутирование факторов (40S и eIF2), необходимых для инициации трансляции в определенных условиях [18]. Поэтому мы предположили, что ILF3 может связываться с SINEB2 для рекрутирования полисом или факторов инициации трансляции, и усиливать таким образом трансляцию мРНК.

EIF4A1 – компонент комплекса eIF4F, играющий важную роль в инициации трансляции. Обладая активностью ATPaзы с DEAD-боксом и ATP-зависимой РНК-хеликазы, этот фактор может расплетать вторичную структуру вблизи 5'-конца мРНК с помощью eIF4G, eIF4B или eIF4H, что способствует связыванию преинициаторного комплекса 43S и скринингу стартового кодона [19]. Нами показано, что SINEB2 может прямо связывать eIF4A1 и in vitro, и in vivo, что указывает на возможную способность RNAe-lncRNA рекрутировать дополнительные белки eIF4A1 на мРНК-мишени для ускорения расплетания 5'-структуры и формирования комплексов 43S.

Ранее предполагали, что такие регуляторные белки, как ILF3 и eIF4A1 могут только связываться с 5'- или 3'-UTR мРНК, а петля кеп-поли(А) способствует тому, что белок, связывающий 3'‑UTR, может регулировать трансляцию. Другими словами, полагали, что только сама мРНК является единственной РНК, участвующей в регуляции собственной трансляции. Однако полученные нами результаты позволяют думать, что другая lncRNA также может усиливать трансляцию мРНК, действуя как гидовая РНК, которая направляет регуляторные белки на мРНК-мишени или даже частично замещает функции 5'/3'-UTR (рис. 3г). Предложенный механизм дает новое представление о регуляции трансляции. Более того, поскольку lncRNA этого типа, регулирующие инициацию трансляции, уникальны среди lncRNA, регулирующих экспрессию генов, выяснение механизма особого типа регуляции позволит понять, каким образом в регуляцию трансляции вовлечены какие-то еще неизвестные lncRNA.

Авторы признательны Hongwei Wang (Университет Цингуа, Китай) и Xiaohua Shen (Университет Цингуа, Китай) за обсуждение и советы, Lele Wang (Университет Цингуа, Китай) и Chuya Niu (Университет Цингуа, Китай) за помощь в проведении опытов по рефолдингу, Lichao Liu (Университет Цингуа, Китай) за помощь в определении аффинности РНК-связывающих белков.

Работа поддержана Natural Sciences Foundation of China (гранты № 31470933 31670991) и National High Technology Research and Development (863 Program) (грант № 2013AA020301).