Молекулярная биология, 2019, T. 53, № 1, стр. 91-100

ВВЕДЕНИЕ

Вирусы семейства Herpesviridae – одни из самых распространенных патогенов в человеческой популяции. Так, антитела к вирусам простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ1 и ВПГ2) выявляют у 80–90% людей. По данным на 2012 год, ВПГ1 инфицировано более 3.7 млрд. человек в возрасте до 50 лет, или 67% населения [1]. Особенно опасна ВПГ-инфекция для лиц со сниженным иммунитетом: беременных женщин, новорожденных, ВИЧ-инфицированных, реципиентов трансплантатов. У новорожденных детей ВПГ-инфекция может вызвать хориоретиниты, микроцефалию, респираторные дисфункции, задержку развития, инвалидность и смерть [2]. Герпесвирусные инфекции (ГВИ) урогенитального тракта считаются одной из причин бесплодия [3]. Первичная инфекция может протекать как в относительно легкой (лабиальный герпес), так и в клинически тяжелой форме (рекуррентный генитальный герпес, энцефалиты), вплоть до смертельного исхода. У большинства людей первичная ГВИ переходит в латентную форму, при которой вирус находится в клетках в неактивном состоянии. Под влиянием многих факторов различной природы происходит реактивация ВПГ, приводящая к репликации вируса, к появлению клинически выраженных заболеваний, часто – в рекуррентной форме. Одна из основных проблем контроля над ГВИ состоит в том, что большинство патентованных препаратов, использующихся в терапии этой инфекции, направлено на лечение острой клинически выраженной формы, но не элиминирует латентный вирус, который может пожизненно присутствовать в организме. Другая проблема заключается в появлении штаммов, устойчивых к химическим препаратам, используемым в противовирусной терапии (например, к ацикловиру) [4, 5]. В связи с этим активно проводятся поиски новых терапевтических подходов. Один из них разработан сравнительно недавно – это технология редактирования геномов с использованием системы CRISPR/Cas9 [6–8]. На примере инфекции клеток вирусом Эпштейна–Барр продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования системы CRISPR/Cas9 в отношении ДНК-геномных вирусов [9]. Недавно показано, что система CRISPR/Cas9, встроенная в геном клеток млекопитающих в составе лентивирусных конструкций, эффективно подавляет инфекцию ВПГ1 [10–13]. Несмотря на то, что система CRISPR/Cas9 в составе интегрированных в геном конструкций способна эффективно подавлять ГВИ, встает важный вопрос о безопасности этого способа доставки целевых генов в клетки человека. Возможными последствиями применения лентивирусных векторов может быть опухолевая трансформация клеток при встраивании этих векторов поблизости от протоонкогенов [14, 15], инсерционный мутагенез высокоэкспрессируемых генов [16, 17] и подавление экспрессии вносимых конструкцией генов [18]. Более безопасными генетическими векторами считаются плазмиды эписомного типа. В отличие от лентивирусных векторов, плазмиды не встраиваются в геном или встраиваются с крайне низкой вероятностью (<10^–5 на клетку) [19]. Плазмиды легче и дешевле получать, транспортировать и хранить, а также можно использовать в повторных инъекциях [20]. Однако плазмиды можно ввести внутрь клеток только с помощью вспомогательных средств, например, липосом и биодеградируемых полимерных микро- и наночастиц, которые к тому же могут обладать свойствами адьювантов [20].

Цель работы состояла в оценке способности системы CRISPR/Cas9, гены которой экспрессируются с плазмиды, подавлять инфекцию ВПГ1. В качестве генов-мишеней системы выбраны вирусные гены UL8 и UL52 геликаза-праймазного комплекса (UL5-UL8-UL52), а также ген UL29, кодирующий белок ICP8, связывающийся с одноцепочечной ДНК и образующий комплекс с ДНК-полимеразой и белком – продуктом гена UL42 ВПГ1. Белки UL8, UL52 и ICP8 необходимы для ориджинзависимой репликации ВПГ1. Эти белки накапливаются в участках репликации ВПГ1 вместе с белком, связывающим ориджин (UL9), и вирусной ДНК-полимеразой (UL30/42) и образуют единый комплекс после сигнала инициации репликации [21]. В ранее проведенных исследованиях показано, что использование этих генов в качестве мишеней системы CRISPR/Cas значительно подавляет способность ВПГ1 к размножению в клетках млекопитающих [11].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клетки. Перевиваемые клетки линии Vero получены из коллекции клеточных культур ФГБУ “НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи” Минздрава России, Москва, РФ. Для культивирования использовали среду Игла MEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина. Перечисленные реагенты приобретены в ООО “ПанЭко” (Россия). Клетки культивировали в атмосфере 5% СО₂. В молекулярном клонировании использовали хемокомпетентные клетки Escherichia coli, штамм XL1Blue (“Евроген”, Россия).

Вирусы. Штамм F ВПГ1 получен из Государственной Коллекции вирусов ФГБУ “НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи” Минздрава России. Вирус размножали в клетках Vero, используя стандартные методы культивирования. Инфекционный титр вируса определяли модифицированным методом бляшек. Готовили серии разведений образцов вируса и вносили в 96-луночные планшеты с монослоем клеток, инкубировали при 37°С в течение 7 суток в присутствии 5% СО₂. Очаги инфицированных клеток (бляшки) выявляли и подсчитывали с использованием инвертированного микроскопа Primovert (“Zeiss”, Германия). Титр вируса определяли по формуле: А = ab/$v$, где А – число бляшкообразующих единиц на 1 клетку (БОЕ/кл); a – среднее число бляшек на одну лунку; b – разведение вируса; $v$ – объем внесенного вируссодержащего материала. Инфекционный титр вируса составлял 3.3 × 10⁶ БОЕ/кл.

Выделение геномной ДНК ВПГ1. Культуру клеток Vero, выращенную до монослоя, инфицировали ВПГ1 (штамм F). Через 48 ч собирали вируссодержащую культуральную жидкость, добавляли равный объем смеси фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (25 : 24 : 1) и встряхивали. Фазы разделяли центрифугированием. Водную фазу смешивали с гликогеном до конечной концентрации 10 мкг/мл, добавляли 1/10 объема 3 М раствора ацетата натрия (pH 5.2) и 3 объема 96%-ного спирта и инкубировали при –20°С в течение ночи. ДНК осаждали центрифугированием и ресуспендировали в деионизованной воде (mQ).

Дизайн направляющих РНК системы CRISPR/ Cas9 против генов ВПГ1. Гены-мишени системы CRISPR/Cas9 выбраны в соответствии с результатами ранее проведенных исследований [11, 13]. Участки генов UL8, UL29 и UL52 амплифицировали с помощью пар праймеров HSV1-UL8-ch-F/HSV1-UL8-ch-R, HSV1-UL29-ch-F/HSV1-UL29-ch-R и HSV1-UL52-ch-F/HSV1-UL52-ch-R соответственно, используя в качестве матрицы геномную ДНК ВПГ1. ПЦР-продукты секвенировали и направляющие РНК против генов UL8, UL29 и UL52 подбирали с помощью программы CRISPOR [22] с параметрами по умолчанию.

Получение плазмид системы CRISPR/Cas9. Плазмиды UL8-UL29 и UL52-UL29, кодирующие по две направляющие РНК против соответствующих генов ВПГ1, получали путем клонирования в плазмиду PX458 ([23]; “Addgene” (www.addgene.org), кат. номер 48138; рис. 1а) по сайтам BbsI ПЦР-фрагментов, полученных с помощью соответствующих пар праймеров: PX458-sgRNA-UL8-F/PX458-sgRNA-UL29-R и PX458-sgRNA-UL52-F/PX458-sgRNA-UL29-R (табл. 1), – используя в качестве матрицы плазмиду AIO-mCherry ([24]; “Addgene”, кат. номер 74120). Отбор колоний E. coli проводили путем ПЦР с олигонуклеотидами U6-ch-F и PX458-sgRNA-UL29-ch-R. Корректность клонированных спейсеров направляющих РНК подтверждали секвенированием с олигонуклеотидом U6-ch-F.

Рис. 1.

Сравнительный анализ эффективности трансфекции клеток Vero плазмидами, кодирующими систему CRISPR/Cas9. а – Схема расположения основных элементов системы CRISPR/Cas9 в плазмиде PX458. Аббревиатуры: sgRNA (single guide RNA) – химерная направляющая РНК; CMV (cytomegalovirus) –цитомегаловирус; SpyCas9 – Streptococcus pyogenes Cas9; NLS (nuclear localization signal) – сигнал ядерной локализации; poly(A) ‒ сигнал полиаденилирования мРНК; Amp^R – ген устойчивости к ампициллину; ori – ориджин репликации. б – Содержание клеток Vero (в %), продуцирующих репортерный белок GFP, в культурах, трансфицированных указанными плазмидами или вектором PX458 (плазмидой, кодирующей систему CRISPR/Cas9 без спейсеров против вирусных генов), через 48 ч после трансфекции. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (M ± SD). в – Влияние CRISPR/Cas9-плазмид на жизнеспособность трансфицированных клеток Vero. Результаты представлены как процентное содержание жизнеспособных клеток (не окрашенных трипановым синим) в клеточной популяции; M ± SD. В качестве контроля взяты интактные нетрансфицированные клетки Vero; вектор – плазмида PX458, кодирующая систему CRISPR/Cas9 без спейсеров против вирусных генов; трансфекция плазмидами, кодирующими компоненты CRISPR/Cas9, нацеленные против обозначенных вирусных генов. г – Флуоресценция GFP в клетках: нетрансфицированных (1), трансфицированных пустым вектором PX458 (2), плазмидой UL8-UL29-1a (3), плазмидой UL52-UL29-9a (4), плазмидой UL8-UL29-1b (5), плазмидой UL52-UL29-9b (6). Увеличение 400×.

В экспериментах использовали четыре плазмиды CRISPR/Cas9 системы, нацеленной на гены ВПГ1: UL8-UL29-1a, UL8-UL29-1b, UL52-UL29-9a и UL52-UL29-9b, – где а и b обозначают плазмиды, несущие одинаковые спейсеры направляющей РНК, но выделенные из двух разных колоний E. coli. Все конструкции кодировали Cas9 из Streptococcus pyogenes, соединенный с зеленым флуоресцентным белком (GFP) через T2А-пептид вируса Thosea asigna. Пептид Т2А обеспечивает синтез Cas9 и GFP в соотношении 1 : 1, следовательно, сигнал флуоресценции GFP прямо пропорционален количеству Cas9. В качестве отрицательного контроля использовали плазмиду PX458. Плазмиды очищали из трансформированных клеток XL1Blue (“Евроген”, Россия) с помощью набора GeneJET Plasmid Purification Kit (“Thermo Fisher Scientific”, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Препараты плазмид очищали от эндотоксина E. coli с помощью набора MiraCLEAN Endotoxin Removal Kit (“Mirus Bio LLC”, США).

Трансфекция. Клетки линии Vero трансфицировали с помощью Lipofectamine 3000 Reagent (“Thermo Fisher Scientific”, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Клетки высаживали в 24-луночный планшет в концентрации 2 × 10⁵ кл/мл в ростовой среде Игла МЕМ без антибиотиков. Через 24 ч в клетки вносили смесь исследуемых плазмид и Lipofectamine 3000 в соотношении 1 : 2. Эффективность трансфекции оценивали через 48 ч, используя инвертированный люминесцентный микроскоп Axio Scope A1 (“Zeiss”, Германия). Подсчитывали отношение числа флуоресцирующих клеток, экспрессирующих GFP, к общему числу клеток в популяции и выражали в процентах.

Цитотоксичность ДНК-конструкций оценивали по влиянию на жизнеспособность клеток и определяли методом исключения витального красителя трипанового синего. Клетки Vero трансфицировали, внося смесь исследуемых плазмид и Lipofectamine 3000 в соотношении 1 : 2 и инкубировали в течение 24 ч. После инкубации смесь удаляли и вносили ростовую среду. Через 72 ч в клетки добавляли 0.03%-ный раствор трипанового синего (ООО “БиолоТ”, Россия) и анализировали число жизнеспособных (неокрашенных) клеток при помощи инвертированного микроскопа Axio Vert A1 (“Zeiss”, Германия). В качестве контроля использовали интактные нетрансфицированные клетки Vero. Результаты представляли как процентное отношение числа жизнеспособных (неокрашенных) клеток к общему числу клеток в популяции.

Детекция ВПГ1. Клетки, продуцирующие ВПГ1, выявляли иммуноцитохимическим окрашиванием с помощью мышиных моноклональных антител против позднего структурного белка gB ВПГ1 (ab6506; “Abсam”, Великобритания). Клетки фиксировали охлажденным метанолом, обрабатывали моноклональными антителами и инкубировали 1 ч при 37°C. Антитела отмывали фосфатно-солевым буфером (PBS), наслаивали анти-мышиные антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена (anti-mouse PX, PO260; “Dako”, Дания), и инкубировали 1 ч при 37°C. Препараты промывали PBS и наносили раствор 3,3'-диаминобензидина в концентрации 1 мг/мл в буфере 0.05 М Трис-HCl (pH 7.4) с добавлением 3% пероксида водорода. Реакцию останавливали через 10 мин внесением в лунки дистиллированной воды. Результаты оценивали с использованием инвертированного микроскопа Axio Vert A1. Подсчитывали число окрашенных клеток, содержавших белок gB ВПГ1, и представляли в процентах от общего числа клеток в популяции.

Чтобы оценить количество вновь образованных вирусных частиц в культурах клеток, трансфицированных плазмидами системы CRISPR/Cas9, отбирали культуральные жидкости и добавляли их к неинфицированным клеткам Vero, выращенным до монослоя. Через 24 и 48 ч детектировали наличие белка gB ВПГ1 иммуноцитохимически, как описано выше.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили в программе GraphPadPrism 5.01. Статистическую значимость различий между средними значениями определяли с помощью двустороннего непарного t-test (критерий Стьюдента). Различия показателей считали статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эффективность трансфекции клеток Vero плазмидами CRISPR/Cas9-системы оценивали по количеству клеток, синтезирующих маркерный белок GFP. Через 48 ч после трансфекции флуоресценцию детектировали в более чем 50% клеток после введения всех полученных плазмид. Эффективность трансфекции плазмидами UL8-UL29-1a, UL8-UL29-1b, UL52-UL29-9a и UL52-UL29-9b составляла от 68.7 ± 10.5% до 73.3 ± 5.6% (рис. 1б) и значимо не отличалась от таковой для пустого вектора PX458 (p > 0.05). Следует отметить, что наиболее интенсивное свечение GFP наблюдалось в клетках, трансфицированных конструкцией UL52-UL29-9b (рис. 1г).

В результате проведенного анализа цитотоксичности ДНК-конструкций показано (рис. 1в), что через 72 ч после трансфекции содержание жизнеспособных клеток составляет 80.7–91.0% от всех клеток в популяции и статистически значимо не отличается от интактных нетрансфицированных клеток Vero (p > 0.05), из чего сделано заключение о низкой цитотоксичности всех изученных плазмид.

Противовирусную активность плазмид, экспрессирующих компоненты системы CRISPR/ Cas9, нацеленные на гены ВПГ1, оценивали в клеточной культуре Vero. Клетки, трансфицированные плазмидами, через 48 ч заражали ВПГ1 со множественностью инфекции (MOI) 0.1 БОЕ/кл и через 48 или 72 ч количество инфицированных клеток (бляшек) определяли иммуноцитохимически с использованием мышиных моноклональных антител против позднего структурного белка gB ВПГ1 (рис. 2). Подсчет инфицированных клеток проводили, как описано выше.

Рис. 2.

Подавление репликации ВПГ1 в клетках Vero, трансфицированных плазмидами системы CRISPR/Cas9. Морфология клеток Vero через 48 ч после заражения ВПГ1 при MOI 0.1 БОЕ/кл, где стрелками обозначены вирусспецифичные бляшки (а), и контрольных (неинфицированных) клеток (б). Окраска гематоксилином. Увеличение 100×. в – Анализ изменения содержания инфицированных ВПГ1 клеток в культуре, трансфицированной CRISPR/Cas9-плазмидами. Контроль – нетрансфицированные клетки Vero, зараженные ВПГ1 при MOI 0.1 БОЕ/кл; вектор – зараженные клетки Vero, трансфицированные пустым вектором PX458. Относительное содержание зараженных клеток (%) определяли по наличию в них белка gB ВПГ1, принимая за 100% число gB-позитивных клеток в контрольном образце. Результаты представлены как среднее ± SD на основании трех независимых экспериментов. *p < 0.05 (t-test); ^#p < 0.05 (t-test) при сравнении со всеми изученными вариантами.

Установлено, что через 48 ч после инфекции содержание клеток, экспрессирующих белок gB ВПГ1, в культурах, трансфицированных плазмидами системы CRISPR/Cas9, снижалось в 4–6 раз (рис. 2в) по сравнению с отрицательными контролями: нетрансфицированными клетками и клетками, трансфицированными пустым вектором (р < 0.05). Следует отметить, что при использовании плазмиды UL52-UL29-9b белок gB ВПГ1 статистически значимо не детектировали. Учитывая, что синтез белка gB происходит после репликации ДНК ВПГ1, на поздних стадиях инфекции, можно думать, что под действием CRISPR/Cas9-системы, кодируемой этой плазмидой, происходит полное подавление инфекционного цикла вируса.

Представляло интерес выяснить, в какой мере система CRISPR/Cas9 подавляет продукцию инфекционного ВПГ1. С этой целью из трансфицированных культур, зараженных вирусом, отбирали культуральные жидкости и вносили их в свежие, незараженные, культуры. Через 24 и 48 ч клетки фиксировали, окрашивали мышиными моноклональными антителами к позднему структурному белку gB ВПГ1 и подсчитывали количество окрашиваемых клеток (рис. 3). В положительном контроле заражения через 24 ч после внесения культуральной жидкости от нетрансфицированных зараженных клеток 99.8 ± 0.8% клеток содержали вирусный белок gB, через 48 ч наблюдали 100%-ную гибель клеток. После внесения культуральной жидкости от клеток, трансфицированных пустым PX458 вектором, через 48 ч наблюдали образование вирусспецифических бляшек (рис. 3а), что свидетельствовало о прохождении всех стадий инфекционного цикла ВПГ1; при этом содержание инфицированных клеток снизилось менее чем на 10% (рис. 3б).

Рис. 3.

Ингибирование продуктивной ВПГ1-инфекции в клетках Vero, трансфицированных плазмидами системы CRISPR/Cas9. а – Влияние системы CRISPR/Cas9 на накопление белка gB в клетках Vero, зараженных ВПГ1. Клетки, инфицированные ВПГ1 (MOI 0.1 БОЕ/кл) и экспрессирующие белок gB: в нетрансфицированной культуре Vero (верхний ряд), трансфицированных вектором PX458 (средний ряд), трансфицированных плазмидой UL52-UL29-9b (нижний ряд). Иммунноцитохимическая детекция белка gB ВПГ1 проведена с использованием моноклональных антител, коньюгированных с пероксидазой хрена (коричневое окрашивание), и последующего доокрашивания клеток гематоксилином (синее окрашивание). Увеличение 400×. б – Содержание неинфицированных клеток в культурах Vero после внесения в них культуральных жидкостей от зараженных культур, трансфицированных указанными плазмидами. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (M ± SD). *Различия статистически значимы при p < 0.05 (t-test); ^#различия статистически значимы по сравнению со всеми изученными вариантами при p < 0.05 (t-test).

Наиболее важные результаты получены при анализе культуральных жидкостей от ВПГ1-зараженных клеток Vero, предварительно трансфицированных плазмидами UL8-UL29-1a, UL8-UL29-1b, UL52-UL29-9a и UL52-UL29-9b. Установлено, что первые три плазмиды снижали продукцию новых вирусных частиц более чем на 80%, тогда как плазмида UL52-UL29-9b полностью подавляла репродукцию вируса (рис. 3б).

Чтобы оценить противовирусный эффект конструкции UL52-UL29-9b в течение более длительного времени, трансфицированные клетки заражали гораздо меньшей дозой ВПГ1 (MOI 0.001 БОЕ/кл) и анализировали репродукцию вируса через 3 и 6 суток после заражения. Полученные результаты представлены на рис. 4. Обнаружено, что через трое суток продукция ВПГ1 снижалась на 84.4%, а через шесть суток – на 51.3% по сравнению с контролем. Важно, что различия на обоих сроках инфекции были существенными и статистически значимыми по сравнению с контролем заражения (p < 0.001).

Рис. 4.

Динамика подавления ВПГ1-инфекции системой CRISPR/Cas9, направленной на гены UL52 и UL29 ВПГ1. Клетки Vero заражали ВПГ1 (MOI 0.001 БОЕ/кл) и трансфицировали пустым вектором PX458 (вектор) или плазмидой UL52-UL29-9b. Репликативную активность вируса оценивали по числу клеток, экспрессирующих gB ВПГ1. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (M ± SD). *p < 0.05.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Технология редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9 открыла новые возможности в изучении важных генов вирусов, в том числе одного из самых распространенных альфагерпесвирусов – ВПГ1. Так, эффективность мутагенеза альфагерпесвирусов с использованием традиционных технологий составляет менее 1%, тогда как эффективность мутагенеза с помощью системы CRISPR/Cas9 – более 50% [25]. О необходимости получения новых данных свидетельствуют недостаточно полные знания о вирусных белках и их функциях, что объясняет как трудности, возникающие при лечении заболеваний герпесвирусной этиологии, так и отсутствие эффективных вакцин. Уже в первых работах [9–13] продемонстрирована перспективность использования CRISPR/Cas9-системы в поиске важных генов ВПГ1 и исследовании их структуры и функций. Получены новые сведения о белках тегумента – аморфного компонента, находящегося между оболочкой вируса и капсидом и содержащего более 20 белков, многие из которых пока не изучены. С помощью системы CRISPR/Cas9 впервые показано, что внесение мутации в ген белка тегумента UL7 приводит к 10-кратному снижению репликации ВПГ1 и аттенуации вирулентности. Отмечено, что ингибирующее влияние мутантный белок оказывал, воздействуя на транскрипцию сверхраннего гена α4 [12]. Недавно определена кристаллическая структура белка UL21 тегумента ВПГ [26], но это не позволило прояснить участие белка в жизненном цикле вируса и необходимость UL21 для репликации. С помощью системы CRISPR/Cas9 авторы получили панель мутантных штаммов ВПГ с делециями гена UL21 [27]. В результате сравнительного анализа мутантов выявлено, что белок UL21 участвует в распространении вируса, однако отсутствие белка UL21 в разной степени влияет на передачу ВПГ1 и ВПГ2 от клетки к клетке; типоспецифические различия выявлены также и при репликации мутантных вирусов.

Большой интерес представляет сверхранний белок ВПГ ICP0, который участвует в индукции ВПГ-инфекции, активируя экспрессию вирусных и клеточных генов. Roehm и соавт. [13] обнаружили, что внесение мутаций в экзон 2 гена ICP0 с помощью системы CRISPR/Cas9 в составе лентивирусного вектора значительно ингибировало развитие ВПГ-инфекции и защищало клетки от заражения. В то же время полного подавления репродукции ВПГ удалось достичь в результате воздействия CRISPR/Cas9-системы, направленной одновременно на три регуляторных гена ВПГ1: ICP0, ICP4 и ICP27. Это наводит на мысль, что для эффективного подавления инфекционного процесса необходимо воздействовать одновременно на два и более вирусных генов. К такому же заключению пришли Van Diemen и соавт. [11]. Они использовали CRISPR/Cas9-систему, нацеленную на 12 генов ВПГ1, с 4 направляющими РНК на ген, и показали, что эффективность подавления ВПГ-инфекции зависит от того, на какой ген нацелена система. Оказалось, что только система CRISPR/Cas9, нацеленная одновременно на 2 определенных гена, полностью ингибировала продукцию вирусных частиц в клетках человека. Следует отметить, что для доставки компонентов CRISPR/Cas9-системы van Diemen и др. использовали лентивирусный вектор [11].

Учитывая все вышеизложенное, в качестве мишеней CRISPR/Cas9-системы мы выбрали гены, участвующие в репликации ВПГ1 при литической инфекции (UL8, UL29 и UL52), потому что из всех исследованных к настоящему времени генов они считаются наиболее важными для жизненного цикла ВПГ1, и их “отключение” может привести к подавлению вирусной инфекции. Нами показано, что система CRISPR/Cas9, направленная одновременно на два гена репликативного комплекса ВПГ1 (UL8/UL29) и (UL52/UL29), в среднем на 90% подавляет репродукцию ВПГ1 в зараженных клетках Vero, а также более чем на 80% в среднем блокирует образование новых инфекционно активных вирусных частиц. Отметим, что одна из плазмидных конструкций (UL52-UL29-9b) полностью ингибировала продуктивную ВПГ-инфекцию. Интересно, что именно для этой конструкции получена максимальная интенсивность флуоресценции GFP в трансфицированных клетках. В плазмиде гены, кодирующие Cas9 и GFP соединены через ген T2А-пептида, который регулирует экспрессию целевых белков в соотношении 1 : 1. Следовательно, сигнал свечения GFP прямо пропорционален количеству белка Cas9. Ранее показано, что повышенный сигнал GFP в такой системе ассоциирован с повышенной активностью системы CRISPR/Cas9 [28].

Одним из ключевых факторов, определяющих эффективность и специфичность действия системы CRISPR/Cas9, служит последовательность направляющей РНК. В этой работе спейсеры направляющих РНК подобраны с помощью программы CRISPOR. Выбранные спейсеры имели от 1 до 10 внецелевых мишеней в геноме млекопитающих, отличающихся от целевых участков не менее чем на 4 нуклеотида. Несмотря на то, что Cas9 слабо связывается с мишенью ДНК, имеющей 4 и более неправильно спаренных основания со спейсером направляющей РНК [29], есть сообщения о том, что даже при наличии 6 неправильно спаренных оснований между спейсером направляющей РНК и ДНК-мишенью Cas9 может вносить двухцепочечный разрыв в ДНК [30]. Отсутствие высокой цитотоксичности у полученных плазмид (рис. 1в), возможно, связано с тем, что внецелевая активность Cas9 не влияет на функционирование жизненно важных для клетки генов, а способность плазмиды UL52-UL29-9b полностью подавлять репликацию ВПГ1 в течение двух суток (рис. 2в и 3б) свидетельствует о высокой активности системы. Недавно показано, что противовирусная активность системы CRISPR/Cas9 повышается, если направляющая РНК комплементарна транскрибируемой цепи ДНК [31]. Спейсер направляющей РНК против гена UL8 взаимодействовал с нетранскрибируемой цепью, а спейсеры против генов UL29 и UL52 – с транскрибируемой, что корреллирует с тем, что плазмида UL52-UL29-9b наиболее эффективна в подавлении репликации ВПГ1 (рис. 2в и 3б). Некоторая степень защиты от вирусной инфекции плазмидой системы CRISPR/Cas9, не имеющей спейсеров против вирусных генов (рис. 3б), может быть связана со способностью направляющей РНК активировать внутриклеточный противовирусный ответ [32, 33].

Одна из важных проблем генной терапии – доставка генетических конструкций. В рассмотренных выше опубликованных работах систему CRISPR/Cas9 вводили в клетки в составе лентивирусных векторов. Мы применили иной подход. Впервые система CRISPR/Cas9 введена в клетки в составе другого вектора – рекомбинантных ДНК (плазмид). Плазмидные векторы не встраиваются в геном клетки-мишени, не вызывают индукцию сильного неспецифического иммунного ответа в организме и используются для создания противовирусных ДНК-вакцин [34, 35]. Необходимо отметить, что сконструированная нами плазмида CRISPR/Cas9-системы эффективно доставляется в клетки и обеспечивает высокий уровень экспрессии гена Cas9 (70–90%).

Необходимое требование, предъявляемое к технологиям генной терапии, – безопасность получаемых лекарственных препаратов. Нами показано, что использование CRISPR/Cas9-плазмид не влияет на жизнеспособность трансфицированных клеток, и это позволяет рассматривать разработанные генетические конструкции как перспективные инструменты для дальнейших исследований in vivo и потенциальные таргетные препараты для противовирусной терапии.

Надежность терапевтических методов представляет особый интерес в связи с имеющимися данными о “прорыве” вирусной инфекции при длительной инкубации клеточных культур, защищенных системой CRISPR/Cas9. Так, van Diemen и др. [11] обнаружили, что CRISPR/Cas9-система эффективно подавляла репликацию ВПГ в течение 24 ч, но эффект полностью исчезал на третьи сутки. В проведенных нами экспериментах противовирусный эффект CRISPR/Cas9-конструкций сохранялся, по крайней мере, в течение 6 суток после заражения ВПГ1.

Таким образом, нами получена плазмида с системой CRISPR/Cas9, нацеленной против генов UL52 и UL29 ВПГ1, эффективно подавляющая репродукцию вируса. Впервые показано, что доставка системы CRISRP/Cas9 в виде плазмид не только подавляет вирусную инфекцию в зараженных клетках, но и способна полностью ингибировать продуктивную (литическую) инфекцию ВПГ1 в клеточной культуре в течение длительного времени. Это открывает перспективы для получения новых данных о функциях вирусных белков и создания новых противовирусных препаратов с более высокой специфичностью, безопасностью и эффективностью по сравнению с имеющимися в настоящее время.

Часть работы выполнена на оборудовании ЦКП “Геном” ИМБ РАН (http://www.eimb.ru/rus/ckp/ ccu_genome_c.php).

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований государственных академий наук на 2013–2020 годы (№ 01201363823) и гранта РФФИ № 18-29-07021.