Молекулярная биология, 2019, T. 53, № 2, стр. 311-323

ВВЕДЕНИЕ

Хронический гепатит В (ХГВ) – тяжелое заболевание печени, связанное с хронической персистенцией вируса гепатита В (ВГВ) в гепатоцитах. Это одно из самых распространенных вирусных заболеваний человека – более 250 млн по всему миру; из которых более 1 млн ежегодно умирает от ассоциированных с ХГВ заболеваний печени: гепатоцеллюлярной карциномы и цирроза. По обновленной статистике, опубликованной в журнале Lancet в 2017 году [1], в смертности от инфекционных заболеваний лидируют вирусные гепатиты.

Основная причина персистенции ВГВ – наличие суперспирализованной кольцевой ковалентно замкнутой ДНК (ккзДНК) в ядре. Эта ДНК служит матрицей для транскрипции всех мРНК ВГВ, включая основную форму, прегеномную РНК (пгРНК) ВГВ (3.5 тыс. нуклеотидов), с которой происходит синтез минус-цепи ДНК ВГВ.

До последнего времени изучение цикла ВГВ и разработка противовирусных препаратов была во многом ограничена отсутствием пригодных моделей in vitro [2]. Одними из первых были суррогатные модели гепатита В (гепатит В уток и сурка) [3, 4] и модели первичных гепатоцитов человека [5]. На суррогатных моделях изучены фундаментальные аспекты цикла ВГВ, но, так как это все-таки модели гепатита В животных, их использование для разработки препаратов прямого противовирусного действия нерационально. Первичные гепатоциты человека труднодоступны и быстро теряют собственный фенотип в культуре клеток (в частности, экспрессию NTCP-рецептора) [6], поэтому их использование в исследованиях также затруднено, хотя последние разработки в области трехмерных культур клеток [7], совместного культивирования гепатоцитов человека в микропаттернах (организованных двухмерных островках) с фибробластами животных [8] и получение гепатоцитов из стволовых клеток человека [9] отчасти решают эти проблемы. Клетки человека HepaRG исторически считаются первой перевиваемой линией клеток, чувствительной к заражению ВГВ и наиболее близкой по своим свойствам и транскриптому к гепатоцитам. Тем не менее, использование HepaRG связано с длительной дифференцировкой клеток и плохой воспроизводимостью результатов экспериментов [10]. Главное достоинство HepaRG состоит в возможности изучения ранних этапов инфекции, то есть на стадии проникновения вируса в клетку. Изначально нечувствительные к инфекции линии клеток HepG2 [11] со вставками генома ВГВ, HepAD38 и HepG2.2.15, и модель трансфекции HepG2 плазмидой, кодирующей геном ВГВ, линейной или кольцевой ДНК ВГВ – наиболее простые и надежные модели ВГВ-инфекции. Их использование позволяет получать воспроизводимые данные по репликации вируса, при этом уровни ккзДНК ВГВ остаются довольно низкими (менее 1 копии на клетку) [12]. В проведенной нами работе использованы как классические модели ВГВ (трансфекция клеток HepG2 плазмидой, кодирующей ВГВ), так и новые модели со стабильной репликацией ВГВ (вставка генома ВГВ 1.5-mer под промотором дикого типа, то есть с низкой репликативной активностью) и с индуцируемой тетрациклином транскрипцией ВГВ (вставка генома ВГВ 1.1-mer под цитомегаловирусным промотором).

Ни одно из современных лекарственных средств не действует напрямую на ккзДНК ВГВ. Однако известно, что напрямую деградировать эту ДНК могут APOBEC-дезаминазы [13] и сайтспецифичные нуклеазы систем CRISPR/Cas9, ZFNs (нуклеазы с цинковыми пальцами), TALENs (эффекторные нуклеазы, подобные активаторам) [14–16].

Работа системы CRISPR/Cas9 основана на привлечении нуклеазы Cas9 к целевому сайту ДНК, определяемому специальным РНК-проводником [17]. Специфичность и эффективность системы CRISPR/Cas9 сравнимы с TALENs и ZFNs, однако простота работы этой системы и возможность “усовершенствования” белков Cas9 – это те факторы, которые обусловливают ее широкое использование при разработке новых лекарственных препаратов [18]. Недавно подтверждена [19] концепция, согласно которой CRISPR/Cas9 с РНК-проводниками к геному ВГВ может оказывать мощное противовирусное действие, снижая все показатели ВГВ-инфекции на различных моделях клеток. Однако, несмотря на практически полную остановку цикла ВГВ вскоре после введения CRISPR/Cas9, число копий ккзДНК значительно снижалось только к 4 неделе после трансдукции лентивирусов [14]. Считается, что следствием нуклеолитического расщепления ккзДНК системами CRISPR/Cas9 могут быть различные мутации, в том числе со сдвигом рамок считывания [20]. Хотя значительное снижение репликации ВГВ – важное достижение, о полном излечении ХГВ можно будет говорить только при полной элиминации ккзДНК. В частности, персистентность ккзДНК, даже в условиях постоянного ингибирования вирусного цикла аналогами нуклеот(з)идов, сопровождается продукцией белка НВх – основного мутагенного фактора ВГВ [21]. Таким образом, встает задача изменения судьбы двухцепочечных разрывов (double-strand breaks, DSBs) в ккзДНК с репарации на путь деградации. Известно, что репарация DSBs после нуклеолитического расщепления системами CRISPR/Cas9 реализуется по механизму соединения негомологичных концов ДНК (NHEJ) и, в редких случаях, гомологичным соединением концов ДНК (HR) [19]. Модуляция путей репарации с помощью низкомолекулярных соединений, антител и отдельных белков, многие из которых уже используются в клинической практике [22] или находятся на стадиях клинических испытаний [23], усиливает эффекты, связанные с действием CRISPR/Cas9. В частности, подавление NHEJ усиливает эффективность редактирования генома с помощью CRISPR/Cas9 [24].

Считается, что NHEJ и HR связаны реципрокным взаимодействием. В упрощенном варианте можно сказать, что подавление активности NHEJ усиливает HR и наоборот. Однако механизмы репарации DSBs гораздо более сложны, и возможность модуляции активности путей репарации DSBs с целью усиления анти-ВГВ-активности CRISPR/Cas9 требует отдельного изучения.

Нами разработана система CRISPR/Cas9, эффективно блокирующая транскрипцию и репликацию ВГВ. Показано, что низкомолекулярное соединение RI-1, которое препятствует сборке филаментной структуры RAD51 и подавляет путь HR [24], и низкомолекулярное соединение NU7026, необратимо связывающееся с каталитической субъединицей ДНК-протеинкиназы (DNA-PKcs) [23], а также их смесь не токсичны для клеток. Обработка этими соединениями клеток, зараженных ВГВ, приводит к усилению противовирусного действия систем CRISPR/Cas9.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Линии клеток. Клетки гепатомы человека HepG2, а также линии HepG2-1.1merHBV и HepG2-1.5merHBV (предоставлены проф. Dieter Glebe, Университет Гиссена, Германия) с геномом ВГВ 1.1-mer и 1.5-mer генотипа D, под tet-on-регулируемым промотором цитомегаловируса (CMV) и промотором дикого типа соответственно, культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (4.5 г/л) (“Thermo Fisher Scientific”, США), 1% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (FBS; “Gibco”), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина при 37°С в среде с 5% СО₂. Клетки рассевали в 6-луночные планшеты с 50%-ной плотностью, на следующие сутки цикл ВГВ на модели HepG2-1.1merHBV активировали доксициклином (100 нг/мл) в течение 24 ч, после чего клетки дважды промывали фосфатным буфером и трансдуцировали лентивирусами (MOI = 3.5) с Cas9-P2A-EGFP (плазмида Addgene #63592 предоставлена PhD Phil Sharp и PhD Feng Zhang) и РНК-проводником под U6-промотором (плазмида Addgene #50662 предоставлена PhD Eric Lander и PhD David Sabatini) (MOI = 3.0) либо нецелевым РНК-проводником (контроль) в смеси с полибреном (8 мкг/мкл). Через 48 ч после трансдукции клетки обрабатывали растворами ингибиторов репарации в DMSO, в качестве контроля использовали обработку DMSO в полной среде DMEM. Инкубацию с низкомолекулярными соединениями вели в течение 72 ч, меняя среду с ингибиторами каждые 24 ч.

Получение ПЦР-продукта, кодирующего РНК-проводник. Мишень в геноме ВГВ подбирали с использованием сервиса Broad Institute Genetic Perturbation Platform (portals.broadinstitute.org) и программы Geneious 7.1.9. ПЦР-продукт с U6-промотором, кодирующий РНК-проводник, получали в двухэтапной ПЦР с высокоточной полимеразой Q5 (“New England Biolabs”, США) с проведением амплификации с плазмиды pLX-sgRNA (плазмида Addgene #50662). РНК-проводник нацелен на мишень в геноме ВГВ и содержит шпильку, необходимую для распознавания белком Cas9 Streptococcus pyogenes.

Низкомолекулярные соединения. В работе использованы: специфический ингибитор каталитической субъединицы ДНК-протеинкиназы, принимающей участие в NHEJ-пути репарции ДНК, NU7026 (“Abcam Biochemicals”, Великобритания) в концентрации 20 мкМ; специфический ингибитор белка RAD51 HR-пути репарации ДНК RI-1 (“Abcam Biochemicals”) в концентрации 10 мкМ и комбинация RI-1+Nu7026 (10 мкМ и 20 мкМ соответственно). Концентрированные растворы низкомолекулярных соединений хранили в DMSO, растворяя в полной среде DMEM непосредственно перед использованием.

Анализ пролиферации и цитотоксичности методом колориметрии. Измерение пролиферации клеток HepG2-1.1merHBV под действием растворов низкомолекулярных соединений проводили с помощью набора BrdU Cell Proliferation kit (“Abcam Biochemicals”) по инкорпорации BrdU в делящиеся клетки, используя колориметрическую детекцию при 450 нм. Исследование динамики пролиферации клеток HepG2-1.1merHBV и их жизнеспособности проводили с помощью набора Cell Cytotoxicity Assay kit (“Abcam Biochemicals”), который предназначен для оценки пролиферации и жизнеспособности клеток по запатентованной технологии восстановления флуоресцентного субстрата делящимися клетками, по протоколу производителя. Эксперименты проводили в 96-луночных планшетах, рассевая клетки с 30%-ной плотностью в 8 технических повторах; для детекции флуоресцентного сигнала использовали планшетный спектрофотометр iMark (“Bio-Rad Laboratories, Inc.”, США).

Клонирование, накопление и очистка лентивирусных векторов. Клетки HEK-293T выращивали в среде DMEM, содержащей 4.5 г/л глюкозы, 1% FBS, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина. За сутки до трансфекции клетки с 70%-ной плотностью рассаживали в Т175-флаконы. Трансфекцию плазмиды dHelp (“Clontech”, США) для упаковки лентивирусов, VSV-G (“Clontech”) и плазмид, кодирующих Cas9-P2A-EGFP, РНК-проводник или нецелевой РНК-проводник, проводили с помощью полиэтиленимина (7.5 мМ) с NaCl (150 мМ). Через 24 ч среду меняли на OptiMem (“Thermo Fisher Scientific”), еще через 48 ч среду OptiMem отбирали из флаконов, пропускали через 0.45-мкм фильтр (“Corning”, США), наслаивали на стерильный 2%-ный раствор сахарозы (“Sigma”, США) в пробирки для ультрацентрифугирования и центрифугировали в роторе SW28 в течение 2 ч при 100 000 × g (ультрацентрифуга LE-80K; “Beckman Coulter”, США). По окончании центрифугирования надосадочную жидкость сливали, осадок подсушивали при комнатной температуре, добавляли 300 мкл полной среды DMEM и инкубировали при 4^°С в течение 2 ч, после чего осадок лентивирусных частиц тщательно ресуспендировали и, отобрав 20-мкл аликвоты, замораживали при –70°С.

Определение титра лентивирусов. Клетки суспензионной культуры SupT1 инкубировали в среде RPMI-1640 (“Thermo Fisher Scientific”) c 2% FBS и 2 мМ L-глутамина, без антибиотиков. В день трансдукции клетки высеивали на 48-луночный планшет по 1 × 10⁵ клеток на лунку и добавляли лентивирус в различных разведениях (в трех повторах каждое). Через 24 ч клетки промывали фосфатным буфером и культивировали в полной среде RPMI-1640 в течение 64 ч, после чего клетки осаждали в течение 5 мин при 500 × g и ресуспендировали в 300 мкл фосфатного буфера. Процентное cодержание GFP-позитивных клеток определяли на флуоресцентном проточном цитометре NovoCyte (“ACEA Biosciences”, США). Число трансдуцирующих единиц в 1 мл определяли, как описано ранее (Lentiviral Transduction Protocol, “Sigma Aldrich”).

Микроскопия. Клетки в 6-луночных планшетах анализировали на 3 сутки после трансдукции, используя технологии флуоресцентной микроскопии (при длине волны 488 нм) и микроскопии в светлом поле (Olympus IX71; “Olympus”, Япония),

Выделение нуклеиновых кислот. Выделение нуклеиновых кислот проводили с помощью набора РИБО-преп (“ИнтерЛабСервис”, Россия) по протоколу производителя, добавляя лизирующий буфер непосредственно к клеткам после удаления среды и двукратного промывания фосфатным буфером. Для выделения пгРНК и мРНК S-белка (S-РНК) ВГВ нуклеиновые кислоты обрабатывали ДНКазой I без РНКазной активности (“Thermo Fisher Scientific”) в течение 30 мин при 37°С, после чего повторяли выделение РНК с помощью набора РИБО-преп и проводили реакцию обратной транскрипции, используя набор РЕВЕРТА-L (“ИнтерЛабСервис”). Для выделения ккзДНК ВГВ полученную ДНК обрабатывали ферментом Plasmid-safe ATP-dependent DNase (“Epicentre”, США) в течение 12 ч при 37°С (для разрушения всех форм ДНК, кроме ккзДНК) и инактивировали фермент в течение 30 мин при 70°С.

Полуколичественный ПЦР-анализ. Полуколичественный ПЦР-анализ проводили со специфическими праймерами и зондами TaqMan для пгРНК ВГВ, S-РНК ВГВ, GAPDH, ДНК ВГВ, ккзДНК ВГВ (таблица) на приборе Rotor Gene 6000. Праймеры на ген β-глобина использовали из коммерчески доступного набора АмплиСенс^® HBV-FL (“ИнтерЛабСервис”).

Определение уровней HBsAg. Определение секретируемого антигена ВГВ, HBsAg, в культуральной среде проводили с помощью иммуноферментного анализа, используя набор Architect HBsAg (“Abbott Laboratories”) на приборе Abbott Architect HBsAg (“Abbott Laboratories”) после пропускания среды через 0.2-мкм фильтры (“Corning”) для удаления погибших клеток. Данные по количествам HBsAg представлены в международных единицах/мл (МЕ/мл) с учетом количества клеток в образце на момент забора культуральной среды.

Статистика. Статистическую обработку проводили с помощью t-критерия Стьюдента или однофакторного дисперсионного анализа (где применимо) с использованием программного обеспечения IBM SPSS Statistics 19.0.0.0; попарные апостериорные сравнения производили с помощью критерия Тьюки. Различия считали статистически достоверными при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Система CRISPR/Cas9 значительно подавляет транскрипцию и репликацию ВГВ на модели котрансфекции

С целью определения эффективности противовирусного действия системы CRISPR/Cas9 с одиночным РНК-проводником клетки HepG2 котрансфицировали с помощью реагента Lipofec-tamine 2000 (“Thermo Fisher Scientific”) плазмидой 1.1merHBV (предоставлено Dieter Glebe, Гиссен, Германия), плазмидой Cas9-P2A-EGFP (Addgene #63592) и ПЦР-продуктом, кодирующим РНК-проводник к геному ВГВ или незначащий РНК-проводник (рис. 1а). Через 24 ч клетки отмывали дважды фосфатным буфером, добавляли полную среду и снимали через 48 ч. Противовирусный эффект оценивали по экспрессии пгРНК, основного транскрипта ккзДНК ВГВ и S-РНК ВГВ на 3, 4 и 7 сутки после трансфекции, а также по количеству секретируемых в культуральную среду HBsAg и ДНК ВГВ в сравнении с контролем на 4 сутки после трансфекции. Кодируемый РНК-проводник ложится на область core/pre-core генома ВГВ – ключевой регион для транскрипции пгРНК (рис. 1б).

Рис. 1.

Влияние системы CRISPR/Cas9 на транскрипцию и репликацию ВГВ в клетках HepG2. а – Схема эксперимента (см. пояснения в тексте). б – Карта генома ВГВ и целевой регион РНК-проводника. Pol – ген полимеразы, preC/C – гены кор- и прекор-регионов, EnhI/EnhII – регионы энхансеров I и II, штрихом отмечен регион Х-гена. в – Уровни пгРНК и S-РНК ВГВ на 3, 4 и 7 сутки после трансфекции системы CRISPR/Cas9 с целевым РНК-проводником (РНКп) или с незначащим (К). Данные воспроизведены в 5 независимых экспериментах. Уровни пгРНК и S-РНК нормализованы относительно экспрессии мРНК Cas9 в трансфицированных клетках. Уровни экспрессии секретируемой ДНК ВГВ (n = 3) (г) и белка HBsAg (n = 3) (д) при действии системы CRISPR/Cas9 относительно контрольного образца через 4 суток после трансфекции. Относительные уровни рассчитывали с помощью метода ΔΔCt. Планки погрешностей соответствуют стандартным отклонениям. **** p < 0.0001.

Таким образом, трансфекция системы CRISPR/ Cas9 в клетки HepG2 вызывала снижение транскрипции ВГВ более чем на 90% (рис. 1в). Важно заметить, что транскрипция ВГВ фактически прерывалась за счет CRISPR/Cas9 и не восстанавливалась к 7 суткам после трансфекции. На 4 сутки после трансфекции измеряли уровни секретируемой ДНК ВГВ и HBsAg. Оба параметра были более чем в 2 раза ниже в клетках с CRISPR/ Cas9, чем в контрольном образце (рис. 1г, д). Ввиду особенностей выделения ккзДНК ВГВ (см. раздел “Экспериментальная часть”) оценить ее уровни на модели котрансфекции невозможно, поэтому влияние CRISPR/Cas9 системы и растворов низкомолекулярных соединений на экспрессию ккзДНК ВГВ исследовали на моделях стабильных клеточных культур.

Сравнительный анализ транскрипции и репликации ВГВ на моделях клеток гепатомы

Клетки HepG2-1.1merHBV и HepG2-1.5merHBV, содержащие интегрированные трансгены генома ВГВ 1.1mer и 1.5mer под цитомегаловирусным промотором и промотором дикого типа соответственно, воспроизводят полноценный инфекционный цикл ВГВ, включая образование ккзДНК, экспрессию РНК ВГВ и секрецию частиц ВГВ (рис. 2а). Tet-on-регулируемая экспрессия пгРНК в клетках HepG2-1.1merHBV позволяет запускать цикл вируса при добавлении доксициклина и прекращать экспрессию пгРНК с геномной вставки при изъятии доксициклина из культуральной среды. Таким образом, после удаления доксициклина ВГВ транскрибируется только с образованных de novo матриц ккзДНК. В клетках HepG2-1.5merHBV происходит конститутивная экспрессия пгРНК со вставки генома ВГВ и с эписомальной ккзДНК. S-РНК и X-РНК (мРНК X‑белка) транскрибируются с внутренних промоторов и не регулируются механизмами tet-on.

Рис. 2.

Сравнительный анализ транскрипции и репликации ВГВ в линиях клеток гепатомы. а – Цикл ВГВ (HBcAg – кор-антиген ВГВ, ЭР – эндоплазматический ретикулум, kb – тыс. нуклеодидов). б – Динамика транскрипции ВГВ (пгРНК и S-РНК, нормализация на мРНК GAPDH) в клетках HepG2-1.1merHBV (1.1) и HepG2-1.5merHBV (1.5) на 3, 4 и 7 сутки. в – Динамика изменения уровней ДНК ВГВ и ккзДНК (нормализация на ген β-глобина) в клетках HepG2-1.1merHBV (1.1) и HepG2-1.5merHBV (1.5). г – Уровни экспрессии HBsAg в линиях клеток гепатомы. Измерения проведены в трех биологических повторах. Планки погрешностей соответствуют стандартным отклонениям. **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

В результате анализа транскрипции и репликации ВГВ в динамике выявлено, что уровни пгРНК (рис. 2б), а также ккзДНК и ДНК ВГВ (рис. 2в) стабильно и статистически значимо выше в клетках HepG2-1.5merHBV по сравнению с HepG2-1.1merHBV. На 3 сутки экспрессия пгРНК между клетками мало отличалась, так как к этому моменту в клетках HepG2-1.1merHBV с мощного CMV-промотора успевает наработаться сравнимое с HepG2-1.5merHBV количество транскрипта. Позже уровни транскрипции пгРНК и репликации вируса в клетках 1.5HBV становятся существенно выше, так как транскрипция пгРНК в этих клетках продолжается и с генома, и с ккзДНК, в то время как в клетках 1.1merHBV пгРНК может нарабатываться только с ккзДНК, образованной в первые сутки после активации трансгена ВГВ. В клетках HepG2-1.1merHBV наблюдается более активная транскрипция S-РНК (приблизительно в 10 раз; см. рис. 2б) и секреция HBsAg (приблизительно в 50 раз; см. рис. 2г), что связано с масштабной продукцией S-РНК со вставки генома.

Лентивирусная трансдукция CRISPR/Cas9 снижает репликацию ВГВ на моделях хронической инфекции

Клетки HepG2-1.1merHBV обрабатывали доксициклином (100 нг/мл) для активации tet-on-промотора, через 24 ч отмывали дважды фосфатным буфером и трансдуцировали лентивирусными векторами с помощью полибрена. На следующие сутки после трансдукции среду с лентивирусами удаляли и добавляли полную среду. По результатам проточной цитофлуориметрии (рис. 3а) и флуоресцентной микроскопии (рис. 3б), эффективность лентивирусной трансдукции при MOI 3.5 составила 83.8 ± 3.11%. Наименьшие количества лентивирусов с РНК-проводником и нецелевым РНК-проводником, способные подавлять вирусный цикл, выбирали, основываясь на изменении в секреции HBsAg и ДНК ВГВ на 3 сутки после трансдукции (рис. 3в). В связи с тем, что существенных отличий в этих показателях не обнаружили для лентивирусных частиц с РНК-проводником при значениях MOI, равных 3 (1), 6 (2) и 9 (3), мы использовали наименьшую дозу.

Рис. 3.

Выбор условий трансдукции клеток гепатомы лентивирусными векторами с CRISPR/Cas9. а –Трансдуцированные лентивирусом (ЛентиCas9-EGFP) клетки, продуцирующие EGFP, детектировали на канале 495/519 нм как зеленые флуоресцентные клетки. Контроль (нетрансдуцированные клетки) отмечен красным, трансдуцированные клетки отмечены зеленым. Зеленые флуоресцентные клетки выделены ограничительной линией. б – Микрофотографии трансдуцированных клеток в светлом поле (сверху) и на зеленом канале (снизу); увеличение 10×. в – Подбор оптимального количества лентивируса с РНК-проводником на основании данных по влиянию на уровни секретируемой ДНК ВГВ (черные столбцы), нормированные на экспрессию гена β-глобина, и секретируемого HBsAg (серые столбцы) относительно показателей в контрольных клетках. Контрольная группа клеток (К) трансдуцирована лентивирусом с Cas9-P2A-EGFP (MOI = 3.5); экспериментальные группы клеток трансдуцированы лентивирусом с Cas9-P2A-EGFP (MOI = 3.5) и лентивирусом с РНК-проводником при MOI 3 (1); 6 (2) или 9 (3).

Ингибиторы NHEJ/HR не оказывают цитотоксического действия и вызывают незначительные изменения в транскрипции ВГВ

Низкомолекулярное соединение NU7026 необратимо связывается с фактором DNA-PKcs, тем самым подавляя активность пути NHEJ. Соединение RI-1 ингибирует путь HR, препятствуя сборке филаментной структуры RAD51. Выбранные концентрации RI-1 и NU7026, а также их комбинация не оказывали цитотоксического действия на клетки HepG2-1.1merHBV. Это продемонстрировано по результатам трех различных тестов, включая анализ пролиферации клеток (рис. 4а,б,д) и анализ жизнеспособности клеток (рис. 4в,г) при инкубации с этими соединениями в течение 24 и 72 ч. Во всех временных точках изученные параметры не отличались значимо от контрольных величин.

Рис. 4.

Анализ цитотоксичности RI-1 и NU7026 и их влияния на репликацию ВГВ. Анализ пролиферации клеток HepG2-1.1merHBV при обработке RI-1 (10 мкМ), NU7026 (20 мкМ) или их комбинацией (RI-1/NU7026 в концентрациях 10 мкМ/20 мкМ) в течение 48 ч (а) и 72 ч (б) с использованием набора Cytotoxicity kit. Число клеток прямо пропорционально оптическому поглощению при 490 нм (А₄₉₀). Контрольные клетки обрабатывали DMSO (0.115% в культуральной среде, что соответствует максимальному содержанию DMSO в группе RI-NU). Анализ жизнеспособности клеток HepG2-1.1merHBV относительно контрольного образца при обработке препаратами RI-1, NU7026 или RI-1/NU7026 в течение 24 (в) и 72 ч (г) с использованием набора Cytotoxicity kit. д – Анализ пролиферация клеток HepG2-1.1merHBV при обработке RI-1, NU7026 илиRI-1/NU7026 в течение 24 и 72 ч. Скорость пролиферации клеток оценивали по включению в них бромуридина (BrdU) в конечной временной точке, измеряя оптическое поглощение при 450 нм (A₄₅₀). Контрольные клетки обрабатывали DMSO. Планки погрешностей соответствуют стандартным отклонениям. Отличия считались значимыми при p < 0.05. е – Клетки HepG2-1.1merHBV и HepG2-1.5merHBV обрабатывали RI-1, NU7026 или RI-1/NU7026 в течение 24 и 72 ч и оценивали репликацию ВГВ по экспрессии пгРНК и уровню ккзДНК. Измерения проведены в трех биологических повторах. Планки погрешностей соответствуют стандартным отклонениям. *p < 0.05, ****p < 0.0001.

Ранее показано, что ВГВ использует сигнальные пути, активируемые DSBs и одноцепочечными разрывами, для собственной репликации [25]. Нами исследовано влияние ингибиторов DNA-PKcs (NU7026) и RAD51 (RI-1) на уровни ккзДНК и экспрессию пгРНК в обеих клеточных линиях. В выбранных условиях RI-1 практически не оказывал влияния на инфекционный цикл ВГВ, в то время как NU7026 снижал экспрессию пгРНК в клетках HepG2-1.1merHBV на 80% (p < < 0.001) через 24 ч и на 65% (p < 0.001) через 72 ч. Обработка клеток NU7026 приводила к незначительному снижению уровня ккзДНК в клетках HepG2-1.1merHBV через 72 ч (рис. 4е).

Ингибиторы репарации усиливают противовирусное действие CRISPR/Cas9 на ВГВ

С целью проанализировать действие исследуемых ингибиторов на противовирусную активность CRISPR/Cas9, клетки HepG2-1.1merHBV и HepG2-1.5merHBV через 48 ч после трансдукции обрабатывали RI-1 и NU7026 в выбранных концентрациях и каждые 24 ч заменяли культуральную среду на свежую с теми же концентрациями ингибиторов. Инкубацию проводили в течение 3 суток, после чего культуральную среду использовали для анализа HBsAg. Клетки промывали дважды фосфатным буфером и лизировали с последующим анализом компонентов жизненного цикла ВГВ (рис. 5а).

Рис. 5.

Влияние RI-1 и NU7026 на противовирусную активность CRISPR/Cas9. а – Схема эксперимента (см. пояснения в тексте). б – Схематическое изображение действия RI-1 и NU7026 как ингибиторов HR (I) и NHEJ (II). При репарации двухцепочечных разрывов ДНК RI-1 ингибирует фактор RAD51 и блокирует путь HR; NU7026 необратимо связывается с DNA-PKcs и блокирует путь NHEJ. Ферменты системы CRISPR/Cas9 могут вносить двухцепочечные разрывы в ккзДНК ВГВ (III) по целевым мишеням. MRN, CtIP, RPA, RAD51, BRCA/BRCA2 – белки и белковые комплексы пути HR. Ku70/80, DNA-PKcs, Artemis, DNA pol – белки и белковые комплексы пути NHEJ. в – Экспрессия пгРНК ВГВ относительно мРНК GAPDH после трансдукции клеток HepG2-1.1merHBV (1.1) и HepG2-1.5merHBV (1.5) лентивирусами с Cas9 с нецелевым РНК-проводником (контроль) и Cas9 c целевым РНК-проводником (РНКп) и обработки NU7026, RI-1 или NU7026/RI-1. г – Уровни ккзДНК относительно гена β-глобина. д – Уровни секретируемого HBsAg относительно контрольного образца с нецелевым проводником. е – Уровни секретируемой ДНК ВГВ относительно контрольного образца. Эксперименты проведены в трех биологических повторах. Планки погрешностей соответствуют стандартным отклонениям.*p < 0.05.

Нуклеазы системы CRISPR/Cas9 могут вносить DSBs в две основные формы ДНК ВГВ: в линейную двухцепочечную ДНК и ккзДНК, – которые локализуются в ядре инфицированных клеток (рис. 5б). При репарации DSBs в геноме ВГВ преимущественно используется NHEJ-путь (рис. 5б (II)) [19].

В условиях эксперимента лентивирусная трансдукция модельных клеток снижает уровни всех исследованных маркеров ВГВ в клетках 1.1 и 1.5: пгРНК на 39% (p < 0.05) и 10%; ккзДНК на 28% (p < 0.05) и 70% (p < 0.05); HBsAg на 51% (p < 0.05) и 48% (p < 0.05) соответственно (рис. 5в–д). Обработка клеток 1.1 и 1.5 соединением NU7026 давала выраженный эффект по ккзДНК: снижение на 89% (p < 0.05) и 70% (p < 0.05) соответственно (рис. 5г). Кроме того, использование NU7026 на клетках 1.5 приводило к статистически значимому снижению пгРНК (рис. 5в). Уровни HBsAg не снижались, а, наоборот, несколько возрастали при совместном действии системы CRISPR/Cas9 и NU7026 на клетки 1.1 и 1.5: в 1.22 (p < 0.05) и 2.83 раза (p < 0.05) соответственно (рис. 5д). При обработке клеток 1.5 RI-1 действие CRISPR/Cas9 усиливалось по отношению к ккзДНК (снижение уровня на 94%, p < 0.01; рис. 5г) и пгРНК (на 69%, p < 0.05; рис. 5в). Следует заметить, что в клетках 1.1 уровни пгРНК и HBsAg практически не отличались от контроля с РНК-проводником в DMSO. Обработка клеток комбинацией ингибиторов, RI-1/NU7026, давала неоднозначный эффект. Так, экспрессии пгРНК снижалась на 42% и 89% (p < 0.01) в клетках 1.1 и 1.5 соответственно, уровни ккзДНК снижались соответственно на 47 и 74% (p < 0.05), а содержание HBsAg снижалось на 70% (p < 0.05) в клетках 1.1 и увеличивалось в 1.43 раза в клетках 1.5 (p < 0.05) в сравнении с контрольными клетками (рис. 5в–д). Изменения в уровнях секретируемой ДНК ВГВ в целом отображали влияние CRISPR/Cas9 на уровни ккзДНК в тех же клетках (рис. 5е). В группе контроля уровни секретируемой ДНК ВГВ снижаются на клетках 1.5 более чем в 2 раза (p < 0.05). В целом, уровни ДНК ВГВ практически не отличались от контроля во всех экспериментальных группах на клетках 1.1 за исключением клеток, обработанных NU7026. При обработке клеток 1.1 и 1.5 NU7026 уровни ДНК ВГВ были на уровне 50% от контрольных значений (p < 0.05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ранее показано, что системы CRISPR/Cas9 могут вносить двухцепочечные разрывы в геном ВГВ и прерывать цикл вируса; хотя при этом уровни ккзДНК ВГВ, высокоперсистентной формы генома и ключевого компонента цикла вируса, мало изменяются [14, 19]. В подобранных нами условиях при первичной оценке противовирусного действия системы CRISPR/Cas9 транскрипция и репликация ВГВ в клетках HepG2 значительно снижались (от 50 до 90% для разных параметров). Согласно опубликованным данным, CRISPR/Cas9-система с отдельными РНК-проводниками эффективно блокировала транскрипцию и репликацию ВГВ [14, 26, 27]. Мишенью выбранного нами РНК-проводника системы CRISPR/Cas9 служит pre-core/core регион генома ВГВ, необходимый для считывания пгРНК – основного транскрипта ВГВ, который служит матрицей для синтеза кольцевой частично двухцепочечной ДНК (кчдДНК), секретирумой в составе вирионов формой генома. Внесение разрывов в ккзДНК ВГВ с помощью системы CRISPR/Cas9 может приводить к частичной деградации ккзДНК, а также внесению мутаций со сдвигами рамок считывания и блокированию образования транскриптов. Важно отметить, что помимо снижения уровней пгРНК, использование CRISPR/Cas9 снижало уровень S-РНК, считываемой с отдельной рамки. Кроме того, выявлено снижение продукции HBsAg и секретируемой ДНК ВГВ. Из этого следует, что действие сайтспецифичных нуклеаз в регионе pre-core/core фактически нарушает образование РНК ВГВ с нескольких кодирующих регионов ккзДНК, существенно подавляет репликацию ВГВ и продукцию вирусных частиц.

Уровни ккзДНК после лентивирусной трансдукции CRISPR/Cas9 снижались на 30%–70% в зависимости от использованной модели. Мы наблюдали значительно более сильное снижение уровней ккзДНК ВГВ, чем описано ранее – Ramanan с соавт. [14] регистрировали снижение пула ккзДНК на 70 ± 7% через 21 сутки после трансдукции.

Известно, что, наряду с деградацией ккзДНК, нуклеазы системы CRISPR/Cas9 могут вносить разрывы, которые репарируются по пути HR и NHEJ с формированием мутаций, сдвигающих или не сдвигающих рамки считывания [28]. Считается, что ингибирование пути NHEJ приводит к активации системы HR и наоборот. Таким образом, теоретически, действие NU7026 будет способствовать репарации ккзДНК по бесшовному механизму HR либо приводить к деградации ккзДНК, в то время как RI-1 будет усиливать частоту мутаций по типу вставок/делеций. Известны случаи использования низкомолекулярных соединений для повышения эффективности генетического редактирования с помощью нуклеаз CRISPR/Cas9 [23, 29]. Но никто не исследовал, как изменяются уровни ккзДНК ВГВ при одновременном действии CRISPR/Cas9 и ингибиторов NHEJ/HR. По результатам нашего исследования подавление активности путей NHEJ/HR репарации DSBs способствует снижению уровней ккзДНК на 70–89% при обработке NU7026 и на 58–94% при обработке RI-1. Обработка клеток смесью этих соединений не давала синергетического эффекта (снижение на 47–74%).

Из работы Seeger с соавт. [28] известно, что значительная доля мутаций, индуцируемых CRISPR/ Cas9 в ккзДНК ВГВ, не влияет на транскрипцию и репликацию вируса. Наиболее вероятно, что при подавлении активности NHEJ/HR CRISPR/Cas9 более эффективно блокирует транскрипцию вирусного генома за счет образования сложных мутаций, вносимых в ккзДНК. Снижение уровней ккзДНК при использовании NU7026 и RI-1 может происходить за счет подавления образования ккзДНК de novo (снижения репликации вируса) или за счет усиленной деградации ккзДНК под действием CRISPR/Cas9.

Несмотря на многообещающие данные по влиянию двух исследованных нами соединений, NU7026 и RI-1, на уровни ккзДНК, при обработке NU7026 происходило устойчивое увеличение секреции HBsAg ВГВ; при этом уровни ДНК ВГВ в культуральной среде при использовании CRISPR/ Cas9 снижались. Вирионы ВГВ заключены в оболочку, на поверхности которой экспонирован белок S, а внутренний капсид содержит кчдДНК. Таким образом, увеличение продукции HBsAg при действии CRISPR/Cas9 совместно с NU7026 не связано с усилением продукции вирионов (содержащих ДНК ВГВ). Увеличение продукции HBsAg может быть обусловлено особенностями моделей трансгенных клеток, а именно с усилением транскрипции мРНК белка S, экспрессия которой происходит с отдельного промотора, или с усилением экспорта вирусных частиц из клетки. В целом, это можно рассматривать как нежелательный эффект молекулы NU7026. Связано ли усиление продукции HBsAg с особенностями именно NU7026 или это эффект, общий для всех ингибиторов пути NHEJ, при действии CRISPR/ Cas9, еще предстоит выяснить.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 16-15-10426.