Молекулярная биология, 2019, T. 53, № 3, стр. 497-501

ВВЕДЕНИЕ

Процессам дифференцировки клеток-предшественников в клетки жировой ткани посвящено много исследований, что обусловлено растущей потребностью в разработке новых лекарственных средств для лечения ожирения и диабета [1, 2]. Одна из самых распространенных моделей адипоцитарной дифференцировки in vitro – клеточная линия мышиных преадипоцитов 3T3-L1 [3]. На ней исследовано действие транскрипционных факторов: начиная c тех, которые необходимы на самой ранней стадии дифференцировки, и заканчивая факторами, поддерживающими адипоциты в зрелом состоянии. Недавно установлено, что, наряду с мастер-регулятором адипогенеза Pparγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), не менее важную роль играет фактор C/ebpβ (CCAAT-enhancer-binding protein β), активирующийся на ранних стадиях адипогенеза [4]. Активированный C/ebpβ образует мультимерные комплексы с другими белками, необходимыми для его связывания с хроматином. Среди транскрипционных факторов, находящихся в комплексе с C/ebpβ, есть гомео-доменсодержащие белки – именно они стали предметом наших исследований. Ранее установлено [4, 5], что Pbx1 (Pre-B-cell leukemia transcription factor 1) непосредственно взаимодействует с C/ebpβ, подавляя адипогенез. Нами показано [6], что для высокоафинного связывания с ДНК Pbx1 необходим партнер из группы TALE (Three Amino acid Loop Extension) гомеодоменсодержащих белков (Prep или Meis). На основании полученных нами данных [7] о роли Prep1 в подавлении адипогенеза и результатов полногеномных исследований, где выявлена высокая степень перекрывания сайтов связывания Pbx1 и Prep1 [6], мы предположили, что партнером Pbx1 служит Prep1.

Теперь мы исследовали роль других партнеров Pbx1 в адипогенезе. Белки Meis (Meis1, Meis2, Meis3) – незаменимые факторы дифференцировки кардиомиоцитов и эмбрионального развития сердца. Установлено, что Meis1 отвечает за переход из предшественников кардиомиоцитов в кардиомиоциты [8], в то время как Meis2 – за выбор пути дифференцировки предшественников Isl1⁺, обладающих потенциалом дифференцировки в кардиомиоциты, гладкомышечные клетки и эндотелиальные клетки [9]. Несмотря на то, что оба этих белка (Prep и Meis) могут быть партнерами Pbx1, в норме их функции различны и они конкурируют за свой облигатный партнер Pbx1. В результате проведенных нами исследований различных клеток обнаружена очень низкая степень перекрывания сайтов связывания Prep1 и Meis1 и отсутствие взаимодействия между ними. В связи с этим была выдвинута гипотеза, что Meis, вытесняя Prep1 из комплекса с Pbx1, приводит к активации адипогенеза.

Для проверки этого предположения мы исследовали влияние подавления экспрессии генов Meis1 и Meis2 на адипоцитарную дифференцировку в клеточной линии 3T3-L1 и показали, что Meis1, как и Prep1, играет роль репрессора в этом процессе.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культивирование клеток. В работе использовали клеточную линию мышиных преадипоцитов 3T3-L1. Клетки растили в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки теленка (BCS) при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СО₂.

Для подавления экспрессии Meis1 и Meis2 клетки 3T3-L1 инфицировали лентивирусными частицами на основе вектора pLKO.1 [10], содержащего короткие шпилечные РНК (shРНК): 5'-CAGUGAAGAUGUAACAAGAUC-3' (shMeis1) и 5'-AAGUCGCGACAAAUAUCAUGA-3' (shMeis2), полученных по стандартной методике [6]. Для получения контрольных клеток использовали рандомизированную (scrambled) shРНК – shScr. Селекцию клеток пуромицином проводили в течение 3 суток.

Иммуноблотинг. Уровень экспрессии генов Meis1, Meis2, Pparg и Cebpa оценивали с помощью иммуноблотинга, который проводили по стандартному протоколу [11]. Общий лизат клеток после электрофоретического разделения переносили на нитроцеллюлозную мембрану и для гибридизации использовали следующие первичные антитела: поликлональное C17 против Meis1/2 (“Santa Cruz Biotechnology”, Cat. # sc-10599), моноклональное 81B8 против Pparγ (“Cell Signaling Technology”, Cat. # 2443), моноклональное D56F10 против C/ebpα (“Cell Signaling Technology”, Cat. # 8178). Антитела против тубулина (DM1A, “Sigma-Aldrich”, Cat. # T9026) и против винкулина (hVIN-1, “Sigma-Aldrich”, Cat. # V9131) использовали для нормализации.

Адипоцитарная дифференцировка. Для анализа дифференцировки среду культивирования клеток 3T3-L1, через 2 суток после достижения конфлюентности, заменяли на среду I для дифференцировки, содержащую 1 мкМ дексаметазона, 0.5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина и 1 мкг/мл инсулина в DMEM с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS). Через 2 суток после индукции дифференцировки среду заменяли на среду II для дифференцировки, содержащую только 1 мкг/мл инсулина и 10% FBS. Через 4 суток дифференцировки среду заменяли на среду III для дифференцировки, содержащую только 10% FBS.

Окрашивание по Oil-red O. Дифференцированные клетки 3T3-L1 окрашивали красителем Oil-red O, следуя стандартному протоколу [12]. Коротко, клетки фиксировали в 3.7%-ном растворе формальдегида в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего окрашивали в растворе 0.3%-ного Oil-red O в 60%-ном изопропаноле в течение 30 мин при комнатной температуре.

Анализ генной онтологии. Для анализа генной онтологии использовали программу GREAT, предназначенную для интерпретации функций цис-регуляторных участков генов человека и мыши (http://great.stanford.edu) [13].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для подавления экспрессии генов Meis1 и Meis2 в клетках линии 3T3-L1 использовали специфические shРНК. После селекции клеток пуромицином были получены линии клеток с подавленными уровнями экспрессии Meis1 (shMeis1) и Meis2 (shMeis2). Эффективность подавления подтверждали в анализе вестерн-блот с использованием антитела, специфичного к обоим белкам (рис. 1).

Рис. 1.

Экспрессия генов Meis1 и Meis2 в клетках 3T3-L1. Для подавления экспрессии генов Meis1 и Meis2 применяли РНК-интерференцию соответствующими shРНК (shMeis1 и shMeis2). В качестве контроля использована рандомизированная shРНК (shScr; scrambled). В анализе вестерн-блот использованы первичные антитела: против Meis1/Meis2 и против тубулина (внутренний контроль) – и вторичные антитела, меченные пероксидазой хрена: anti-rabbit IgG-HRP (Cat. #170-6515) и anti-mouse IgG-HRP (Cat. #170-6516, “Bio-Rad Laboratories”).

Как видно из рис. 1, для каждого из двух генов наблюдалась высокая эффективность подавления экспрессии кодируемых ими белков: для Meis1 на 70–80%, а для Meis2 практически на 100%.

Для индукции адипоцитарной дифференцировки использовали стандартный адипогенный коктейль (среда I; см. раздел “Экспериментальная часть”), который вводили через 2 суток после достижения клетками конфлюентности. Для оценки эффективности дифференцировки применяли метод окрашивания клеток красителем Oil-red O, который связывается с нейтральными триглицеридами и липидами в клетке. Как показано на рис. 2, через 4 суток после инициации дифференцировки клеток, содержащих липидные капли, было гораздо больше в случае shMeis1, чем в контроле (shScr) и в клетках shMeis2.

Рис. 2.

Подавление экспрессии гена Meis1 приводит к усилению адипоцитарной дифференцировки in vitro. Окрашивание красителем Oil-red O клеток линии 3T3-L1 через 72 ч после добавления адипогенного коктейля (верхняя панель). shScr – клетки, инфицированные рандомизированной (контрольной) shРНК; shMeis1 и shMeis2 – клетки, инфицированные соответственно shРНК к Meis1 и shРНК к Meis2. На нижней панели в проходящем свете показаны клетки линии 3T3-L1 через 72 ч после добавления адипогенного коктейля.

Для подтверждения полученных результатов исследована экспрессия генов-маркеров зрелых адипоцитов в процессе адипоцитарной дифференцировки клеток с подавленной экспрессией Meis1 и Meis2. Проанализирована экспрессия двух генов: Cebpa и Pparg. Кодируемые этими генами белки относятся к достаточно поздним, но специфичным маркерам адипогенеза. Как показано на рис. 3 (верхняя панель), в клетках shMeis2 и, в особенности, shMeis1 уровень экспрессии Cebpa повышался через 3 суток после введения адипогенного коктейля, в то время как в контрольных клетках экспрессия этого белка не изменялась. Экспрессия другого маркера адипогенной дифференцировки, Pparg, также резко возрастала в клетках с пониженной экспрессией Meis1 и, в меньшей степени, в клетках с пониженной экспрессией Meis2. Является ли это следствием роста числа клеток, содержащих липидные капли, или увеличением уровня экспрессии Pparg и/или Cebpa в отдельных клетках, требует дополнительного исследования.

Рис. 3.

Анализ экспрессии адипоцитспецифичных генов в клетках 3T3-L1. Анализ лизатов клеток 3T3-L1 до (0 сут) и на третьи сутки (3 сут) после введения адипогенного коктейля методом иммуноблотинга с антителами к C/ebpα, Pparγ и винкулину (для нормировки нанесения). shScr – клетки, инфицированные рандомизированной (контрольной) shРНК, shMeis1 и shMeis2 – клетки, инфицированные соответственно shРНК к Meis1 и shРНК к Meis2.

Как уже было отмечено, подобная зависимость эффективности адипоцитарной дифференцировки от уровня экспрессии Meis1 сходна с зависимостью дифференцировки от уровня Prep1 [7]. Для выяснения возможного объяснения наблюдаемого эффекта нами проведено полногеномное исследование связывания факторов Meis в клетках 3T3-L1 через 4 ч после добавления адипогенного коктейля (ChIP-seq с антителом, специфичным к двум белкам: Meis1 и Meis2). Детальное обсуждение полученных результатов будет приведено в другой, готовящейся к публикации, статье. При анализе Meis-связанных локусов хроматина выявлено, что в подавляющем большинстве случаев (>75%) Meis связывается с хроматином далеко (>20 тыс.н.) от старта инициации транскрипции генов, что не позволяет однозначно ассоциировать определенный ген с сайтом связывания Meis. Принимая это во внимание, мы провели анализ онтологии генов, которые связываются с Meis на расстоянии <20 тыс.н. от старта инициации транскрипции. Этим критериям отвечало 2175 генов. Подавляющее большинство (>70%) анализируемых локусов содержит сайт связывания Meis, установленный нами ранее [6]. Несмотря на то, что наиболее статистически значимыми были категории, ассоциированные с дифференцировкой кардиомиоцитов, некоторые гены-мишени фактора Meis образуют статистически значимую категорию “регуляция дифференцировки жировых клеток” (таблица). Среди них идентифицированы такие специфичные для адипогенеза гены, как Adipoq, Cebpa, Foxo1, Id2, Pparg, Wnt10b и Wnt5b.

На основании полученных результатов можно предполагать, что факторы Meis1 и/или Meis2 регулируют экспрессию генов-мишеней на транскрипционном уровне, таким образом регулируя адипогенез. Для проверки этой гипотезы необходимы дополнительные исследования. Интересно проанализировать и возможность взаимосвязанного влияния Meis на адипоцитарную и кардиомиоцитарную дифференцировку.

Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что гомеодоменсодержащий транскрипционный фактор Meis1, в отличие от близкого по гомологии белка Meis2, подавляет адипоцитарную дифференцировку клеток преадипоцитов мыши 3T3-L1, и предложено возможное молекулярное объяснение этого эффекта.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 18-015-00465).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.