Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 2, стр. 333-340

ВВЕДЕНИЕ

Многочисленными исследованиями показано, что большинство α-спиралей в белках упаковано при трех дискретных значениях торсионных углов Ω между их осями: это так называемые параллельная или антипараллельная, ортогональная и скошенная упаковки α-спиралей (см., например, [1–4]). Такая дискретность определена прежде всего принципом плотной упаковки, в соответствии с которым взаимодействующие α-спирали должны быть упакованы так, чтобы выступы на поверхности одной α-спирали входили во впадины на поверхности другой и наоборот. Впервые модель плотной упаковки α-спиралей, основанная на комплементарном объединении их поверхностей, предложена Криком в 1953 г. [5]. По этой модели боковая цепь одной α-спирали попадает в углубление между четырьмя боковыми цепями на другой и наоборот. Таким образом, плотной упаковки α-спиралей можно достичь при Ω, равных 20° и –70°. Эта модель, получившая название “knobs-into-holes” (бугорки в ямки), актуальна до сих пор. Согласно другой широко известной модели, получившей название “ridges-into-grooves” (хребты в желобки), ряд боковых цепей на поверхности одной α-спирали попадает в углубление между рядами на другой спирали и наоборот [1, 2]. Плотную упаковку α-спиралей характеризуют три значения углов Ω, равные –105°, –52° и +23°. Детальный анализ этих моделей и экспериментальных данных привел авторов работы [3], Walther и соавт., к выводу, что модель Крика [5] лучше описывает упаковку α-спиралей и их боковых цепей в белках, чем модель “хребты в желобки” [2]. Однако взаимное расположение α-спиралей в белках определяет не только принцип плотной упаковки, но и химическая природа боковых цепей [6–8]. Как правило, α-спирали в белках амфифильны и расположены так, что их гидрофобные поверхности погружены в гидрофобное ядро, а гидрофильные боковые цепи и свободные полярные группы основной цепи доступны молекулам воды или взаимодействуют между собой или с кофакторами [9–11]. Принимая во внимание эти факторы, одним из нас разработана модель, в которой возможные способы упаковки α-спиралей разделены на два типа: это так называемые упаковки “лоб-в-лоб” (face-to-face) и “бок-о-бок” (side-by-side) [6–8]. В первом случае две α-спирали упакованы так, что гидрофобные боковые цепи образуют двойной слой между их остовами. Во втором случае гидрофобные боковые цепи формируют единый слой на поверхности двуспиральной структуры, а гидрофильные боковые цепи на противоположной стороне могут взаимодействовать между собой или с молекулами воды. Согласно этой модели, взаимная ориентацию α-спиралей определяет принцип плотной упаковки и распределение гидрофобных и гидрофильных боковых цепей на их поверхностях (т.е. геометрия гидрофобных кластеров). Кроме того, взаимное расположение α-спиралей зависит также от длины и конформации перетяжек между ними [12, 13].

В представленной работе мы рассматриваем еще один фактор, от которого зависит взаимное расположение α-спиралей в белках – это их длина. С помощью статистического анализа мы подтвердили известный факт − две длинные, связанные перетяжкой α-спирали, как правило, образуют шпильки, в которых они упакованы антипараллельно. Мы также показали, что если в парах связанных α-спиралей одна спираль длинная, а другая короткая, то будет ортогональная или скошенная упаковка. В работе представлены многочисленные данные, подтверждающие эти наблюдения, и рассмотрены возможные причины этой взаимосвязи.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Мы отобрали из банка белковых данных (PDB) 19 186 белков, идентичность последовательностей которых не превышала 30%, как это определено в самой базе [14]. Далее из нее выделили все спиральные пары, образованные соседними по цепи α-спиралями, связанными перетяжками. Чтобы распознать и отобрать спиральные пары, использовали метод, разработанный нами ранее [15–17]. Вторичную структуру белков определяли методом DSSP Кабша и Сандера [18]. Визуальный анализ структур проводили с помощью программы молекулярной графики RasMol [19]. При описании взаимного расположения α‑спиралей использовали два основных параметра – это расстояние d и угол Ω между осями спиралей. Чтобы вычислить эти параметры, использовали так называемую точечную модель, разработанную нами ранее [16, 17]. В основу этой модели положен известный факт − через две непересекающиеся прямые (в нашем случае они совпадают с осями спиралей) можно единственным образом построить две параллельные плоскости, кратчайшее расстояние между которыми обозначим как параметр d. В том случае, когда оси спиралей не пересекаются, а их проекции на одну из плоскостей пересекаются, то расстояние d − также минимальное расстояние между осями спиралей. При вращении осей спиралей вокруг отрезка d, который соединяет их ближайшие точки, изменяется взаимное расположение спиралей, что однозначно описывает торсионный угол Ω между осями спиралей, это угол между проекциями осей спиралей на плоскость, перпендикулярную отрезку d. Отметим, что это один и возможных способов измерения торсионного угла Ω, который по существу совпадает с определением торсионного угла Ω, данным в работах [1–5].

При определении понятий “короткая” и “длинная” спираль мы исходили из геометрических и стереохимических параметров α-спирали: шаг спирали равен 5.4 Å; на один виток спирали приходится 3.6 остатка; проекция одного остатка на ось составляет 1.5 Å; диаметр спирали может изменяться от 7−8 Å до 10−12 Å, но иногда достигает 15 Å в зависимости от размера боковых цепей. Из общих соображений понятно, что короткая α-спираль не может состоять меньше чем из 4−5 остатков (один виток). Чтобы при крестообразной упаковке двух спиралей CO- и NH-группы остова были доступны молекулам воды, длина короткой спирали должна быть сопоставима с диаметром второй спирали (см. рис.1е и описание нашей модели ниже). Так, например, если диаметр второй спирали около 12 Å, то короткая спираль должна состоять из 8−9 остатков. Таким образом, в исходной модели короткими считали α-спирали, состоящие из 5−8 остатков. В соответствии с моделью (см. рис 1б, в, г и их описание в тексте ниже), длинная спираль должна быть на 1.5−2 витка (и более) длиннее короткой, т.е. состоять в среднем из 12−14 остатков и более.

Рис. 1.

Схематическое изображение спиральных структур, в которых α-спирали упакованы в одном слое (а–д, ж) и в двух слоях (е, з). N и C ‒ обозначение концов спиралей.

Всего отобрано 336 640 пар связанных перетяжкой спиралей. На первом этапе в соответствии с критериями, описанными выше, полученное множество спиральных пар разбили на четыре группы пар: 1) образованные двумя длинными спиралями (LL, Long–Long); 2) первая спираль длинная, вторая – короткая (LS, Long–Short); 3) первая спираль короткая, вторая – длинная (SL, Short–Long); 4) две короткие спирали (SS, Short –Short). Проведенный нами анализ распределения частот встречаемости пар в зависимости от длины спиралей показал следующее. Длина спиралей в парах типа LL изменяется от 12–14 до 20–22 остатков, и наиболее часто обе спирали состоят из 14–15 остатков. В парах типа LS первая спираль чаще всего состоит из 12–13, а вторая из 9 остатков. В парах типа SL первая спираль чаще всего состоит из 8, вторая из 14 остатков. В парах типа SS чаще всего обе спирали состоят из 4–5 остатков. Таким образом, в настоящей работе длинными считали α-спирали, состоящие из 12–14 остатков и более, короткими – спирали из 4–8 остатков.

Далее отобрали только те пары, в которых α‑спирали взаимодействовали своими боковыми поверхностями и их оси не пересекались (примеры таких пар представлены на рис. 1а–в, е). L–образные пары, в которых спирали взаимодействуют торцами (рис. 1д) и не взаимодействуют боковыми поверхностями, не рассматривали. В таких L-структурах обе спирали лежат приблизительно в одной плоскости, расстояние d стремится к нулю, и их оси пересекаются под неким углом. Таким образом, определение торсионного угла Ω для таких пар теряет смысл.

На рис. 2 представлено распределение частоты встречаемости спиральных пар четырех типов в зависимости от длины перетяжек между спиралями. Принимая во внимание то, что большинство спиральных пар имеет длину перетяжек из 3–5 остатков, а число найденных пар слабо зависит от дальнейшего увеличения длины перетяжек, в данной работе мы не рассматривали пары, в которых перетяжки состояли более чем из 8 остатков. Таким образом, для анализа расстояний d и торсионных углов Ω между осями α-спиралей отобрали пары типа LL (10 474), LS (3665), SL (3648) и SS (1895).

Рис. 2.

Число спиральных пар типа LL, LS, SL и SS (N), найденных в нашей базе данных, в зависимости от длины перетяжек между спиралями (n).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Как отмечено выше, α-спирали в белках упакованы так, что их гидрофобные поверхности погружены в гидрофобное ядро, а гидрофильные боковые цепи и полярные группы основной цепи взаимодействуют между собой или с молекулами воды. Во внутренних витках α-спирали NH- и CO-группы основной цепи образуют насыщенную систему водородных связей, однако три NH-группы на N-конце и три CO-группы на C-конце α-спирали свободны и должны быть доступны молекулам воды или иметь других партнеров для образования водородных связей. Их полное или частичное погружение в гидрофобное окружение без образования водородных связей энергетически крайне невыгодно.

Если обе α-спирали в паре длинные и имеют приблизительно одинаковую длину (рис. 1а), то чаще всего они упакованы антипараллельно под углом Ω ≈ 20° (рис. 3), и свободные NH- и CO-группы на их концах доступны молекулам воды. Стереохимический анализ показывает, что, если α-спирали в парах типа LS упакованы антипараллельно в одном слое (рис. 1б), то одна или две CO-группы на C-конце короткой спирали (показано стрелкой) могут быть полностью или частично погружены в гидрофобное окружение, образуемое остовом длинной спирали, ее гидрофобными боковыми цепями и гидрофобными ножками гидрофильных боковых цепей, что энергетически невыгодно. Аналогично, в парах типа SL одна или две NH-группы короткой спирали (показано стрелкой на рис. 1в) могут быть также погружены в гидрофобное окружение. Чтобы избежать этого, в белках α-спирали в парах типа LS и SL образуют αα-уголки [12, 20] с ортогональной (Ω ≈ –70°…–90°)) или скошенной (Ω ≈ –50°) упаковкой α-спиралей (рис. 1е) или L-образные структуры (рис. 1д, см. также рис. 1ж). В таких структурах NH- и CO-группы на концах спиралей полностью доступны молекулам воды. На рис. 1г показана гипотетическая структура, в которой короткая α-спираль упакована между двумя длинными α-спиралями в одном слое, и которая в белках практически не встречается. Она может быть преобразована, например, в структуру, показанную на рис. 1з, в которой концы спиралей доступны молекулам воды.

Рис. 3.

Число найденных в базе данных спиральных пар типа LL (N) в зависимости от расстояния d (а) и от углов Ω (б) при длинах перетяжек n = 1‒8.

На рис. 3 представлено число найденных спиральных пар типа LL в зависимости от расстояния d и углов Ω между осями спиралей и длины перетяжек n (всего 10 474 пары). Как видно, большинство пар имеют расстояния d между осями спиралей в пределах 7–12 Å. Это указывает на то, что спирали в отобранных парах упакованы плотно. Большинство α-спиралей в этих парах упакованы антипараллельно под углами Ω, равными 20°–30°, с максимумом распределения при Ω ≈ 20°. Часть спиралей в парах типа LL образуют скошенную упаковку с углами Ω ≈ –40°…–50° (это свойственно многоспиральным структурам, таким как глобины, колицин А, альбумин и др.).

В спиральных парах типа LS α-спирали также упакованы достаточно плотно при расстояниях d между их осями от 7 до 12 Å (рис. 4а). Большинство α-спиралей в этих парах образуют скошенную или ортогональную упаковку с максимумами распределения при Ω ≈ –50° и Ω ≈ –70°…–90° (см. рис. 4б). Особо необходимо отметить, что в парах типа LS практически отсутствуют антипараллельные упаковки спиралей с углами Ω от –20° до +20°. Очень похожая картина наблюдается в парах типа SL. Большинство α-спиралей в них также образует скошенную или ортогональную упаковку с пиками распределения при углах Ω ≈ –40°…–50° и Ω ≈ –70°…–90°, и практически полностью отсутствует антипараллельная упаковка (рис. 5). Заметная часть α-спиралей в парах типа SS упакована при расстояниях d между их осями более 12 Å (рис. 6а).

Рис. 4.

Число спиральных пар типа LS (N) в зависимости от расстояния d между осями спиралей (а) и от углов Ω (б) при длинах перетяжек n от 1 до 8.

Рис. 5.

Число (N) спиральных пар типа SL в зависимости от расстояния d между осями спиралей (а) и от углов Ω (б) при длинах перетяжек n от 1до 8.

Рис. 6.

Число спиральных пар типа SS (N) в зависимости от расстояния d между осями спиралей (а) и от углов Ω (б) при длинах перетяжек n от 1 до 8.

Это может быть связано, например, с увеличенным содержанием массивных ароматических боковых цепей или с наличием кофакторов в меж-спиральных областях. Большая часть α-спиралей в парах типа SS образует ортогональную или скошенную упаковку. Основные пики наблюдаются при углах Ω ≈ –70°…–80° и Ω ≈ –50° (рис. 6б). В отличие от пар типа LS и SL, спирали в парах типа SS образуют антипараллельную упаковку при углах Ω ≈ 20°. Небольшая, но заметная часть спиралей упакована при углах Ω = 40°–50°.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Из описанного выше следует, что взаимное расположение α-спиралей в белках зависит от нескольких факторов. Во всех известных моделях принцип плотной упаковки рассматривают как один из основных факторов, определяющих упаковку α-спиралей в белках. Необходимо отметить, что этот фактор учитывают не в полной мере, поскольку в моделях все боковые цепи, независимо от формы и размеров, представлены в виде шаров с одинаковым радиусом (см. [1–3, 5–8]). Однако, как это видно из распределения межспиральных расстояний d (см. рис. 3–7), в белках это не так, и расстояние d между осями спиралей не постоянная величина, а варьирует от 7–8 Å (например, когда между остовами спиралей находятся маленькие боковые цепи Ala, Gly) до 11–12 Å и более (когда между остовами упакованы массивные гидрофобные и ароматические боковые цепи). По-видимому, в этом состоит одна из основных причин того, что реальное распределение углов Ω в белках отлично от идеальных значений, которые предсказывают модели. Здесь необходимо также отметить, что расстояние d между осями спиралей коррелирует с диаметрами спиралей.

Рис. 7.

Число найденных в базе данных спиральных пар типа LL, LS, SL и SS (N) в зависимости от расстояния d между осями спиралей (а) и от угла Ω (б).

Взаимное расположение α-спиралей зависит от другого важного фактора ‒ химической природы боковых цепей. С одной стороны, в зависимости от способа объединения гидрофобных кластеров α-спиралей можно получить два типа упаковки: “лоб-в-лоб” или “бок-о-бок” [6–8]. С другой стороны, от геометрии гидрофобных кластеров (т.е. от расположения в цепи гидрофобных и гидрофильных остатков) непосредственно зависят углы Ω между осями спиралей. Так, если обе α-спирали имеют гидрофобные кластеры, образованные остатками в позиция 1-4-8-11-15… (это так называемые семичленные, или гептадные, повторы), то их комплементарное объединение происходит при Ω ≈ 20° (параллельно или антипараллельно). Если кластеры обеих спиралей образованы гидрофобными остатками в позициях 1-4-8-12-15-19… (это так называемые одиннадцатичленные повторы), то их комплементарное объединение происходит при и Ω ≈ 0°…–10°, а кластеры типа 1-5-9-13… объединяются при углах Ω ≈ –30°…–40° (подробнее описано в работе [8]). Как можно видеть, лучше всего эта зависимость прослеживается на примере пар из длинных спиралей типа LL (рис. 3б и рис. 7).

Взаимное расположение α-спиралей в парах типа LS и SL также зависит от химической природы полипептидной цепи, причем в большей степени от расположения в спиральных парах полярных групп основной цепи. Чтобы избежать погружения свободных полярных NH- и CO-групп на концах коротких спиралей в гидрофобное окружение, спиральные пары типа LS и SL образуют αα-уголки (рис. 1е) с ортогональной (Ω ≈ –70°…–90°) или скошенной (Ω ≈ –40°…–50°) упаковкой спиралей или L-образные структуры (рис. 1д). Как видно на рис. 4, 5 и 7, большинство пар этих типов образуют именно такие структуры. Большая часть спиральных пар типа SS также образует такие структуры (рис. 6, 7), хотя в распределении этих пар обнаружены небольшие пики при Ω = 20°–30° и Ω = = 40°–50°.