Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 3, стр. 512-521

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что активность рибосомы в процессе биосинтеза белка зависит, прежде всего, от ее структуры, которую формируют рРНК и рибосомные белки [1–4]. Основная часть белков в составе эукариотической рибосомы не содержит посттрансляционных модификаций [5, 6], хотя некоторые рибосомные белки могут быть фосфорилированы [7, 8], метилированы [9] или гидроксилированы [10, 11]. Среди белков, которые подвергаются гидроксилированию, три рибосомных белка: uL2, uL15 и uS12 (до принятия новой номенклатуры рибосомных белков [12] их обозначали как L8, L27A и S23 соответственно [13]). Реакцию гидроксилирования катализируют так называемые рибосомальные оксигеназы, которые обозначают как ROX [12] или RIOX [14]. Оксигеназа RIOX1 (NO66) отвечает за гидроксилирование остатка His216 в белке uL2, оксигеназа RIOX2 (MINA53) – остатка His39 в белке uL15 [10], а оксигеназа OGFOD1 – остатка Pro62 в белке uS12 [11]. Все три белка расположены вблизи функциональных центров рибосомы (см. [13, 15]), из чего можно предполагать важность гидроксилирования этих белков для ее трансляционной активности.

Белок uS12 лежит в декодирующем центре малой (40S) субчастицы рибосомы и участвует в поддержании точности трансляции и определении стоп-кодона [16, 17]. В исследованиях, выполненных на клетках эмбрионов мыши с использованием бицистронных конструкций с различными стоп-кодонами, показано, что, когда белок uS12 гидроксилирован, эффективность терминации трансляции на всех стоп-кодонах ниже, чем в опытах с негидроксилированным белком [11]. Вместе с тем гидроксилирование белка uS12 не оказывало влияния на сборку 40S субчастиц и инициацию трансляции. На основании этих данных было высказано предположение, что гидроксилирование Pro62 в белке uS12 модулирует трансляцию [11].

Белок uL2 расположен в большой (60S) субчастице рибосомы в районе каталитического центра; при этом остаток His216, несущий гидроксильную группу, находится непосредственно вблизи места связывания акцепторного стебля тРНК в Р-участке и контактирует со спиралью Н93 28S рРНК [18]. В предыдущей работе с помощью химического футпринтинга мы показали, что гидроксильная группа на остатке His216 при связывании белка uL2 с 28S рРНК способствует таким конформационным перестройкам в участке связывания, которые делают его структуру похожей на структуру соответствующего участка в зрелых 60S субчастицах [19]. В этой же работе было предсказано расположение гидроксильной группы на остатке His216, при котором белок uL2 стабилизирует структуру 28S рРНК в участке связывания.

В представленной работе исследован вклад гидроксилированого остатка His39 рибосомного белка uL15, расположенного, как и белок uL2, вблизи каталитического центра рибосомы [18], в поддержание ее трансляционной активности. Используя клетки HEK293, трансфицированные плазмидными конструкциями, кодирующими FLAG-меченый белок uL15 или его мутантные формы с заменами в позициях His39 и His40, мы определили, влияют ли такие замены на способность белка встраиваться в 60S субчастицы и на трансляционную активность рибосом. Выявлена важность гидроксилированного остатка His39 и соседнего остатка His40 в белке uL15 для трансляционной активности рибосом in vivo. На основании полученных данных и анализа структуры рибосомы человека сделано предположение о роли гидроксилирования остатка His39 белка uL15 в поддержании функционально активной структуры рибосомы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и оборудование. В работе использовали агарозу, акриламид и N,N ′-метиленбисакрил-амид (“AppliChem”, Германия), пептон, дрожжевой экстракт Type D (“Helicon”, Россия), среду DMEM, фетальную сыворотку крупного рогатого скота (FBS), раствор пенициллина-стрептомицина, ингибитор РНКаз RiboLock, трансфектант Turbofect (“ThermoFisher Scientific”, США), смолу Strata-Clean (“Stratagene”, США), ДНК-полимеразу Phusion, эндонуклеазу рестрикции DpnI (“New England Biolabs”, США), (белок G)-содержащие магнитные частицы (“Dynabeads”, США), моноклональные антитела анти-FLAG M5 и анти-FLAG M2 (“Sigma-Aldrich”, США), а также компетентные клетки Escherichia сoli штамма XL1-Blue и клетки линии HEK293 (ATCC CRL-1573). Для выделения плазмид использовали наборы GeneJET Plasmid Miniprep Kit и GeneJET Plasmid Midiprep Kit (“ThermoFisher Scientific”). Taq ДНК-полимераза (5000 ед./мл) получена в лаборатории биоорганической химии ферментов ИХБФМ СО РАН. Олигодезоксирибонуклеотиды синтезированы в лаборатории медицинской химии ИХБФМ СО РАН. Секвенирование ДНК проведено в Центре коллективного пользования “Геномика” СО РАН на базе ИХБФМ СО РАН. Масс-спектры сняты на MALDI-TOF масс-спектрометре REFLEX III, оснащенном импульсным N2-лазером (337 нм) в Центре масс-спектроскопического анализа ИХБФМ СО РАН. Рибосомные субчастицы из плаценты человека выделяли, как описано ранее [20].

Выделение рибосомных белков для MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа. Рибосомные белки экстрагировали из 60S субчастиц уксусной кислотой с последующим осаждением ацетоном [21]. Белки разделяли электрофорезом в 15%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) [22]. Гель окрашивали Кумасси бриллиантовым синим R250 и полосу, соответствующую рибосомному белку uL15, вырезали из геля и обрабатывали трипсином, как описано ранее [23]. Продукты трипсинолиза анализировали MALDI-TOF масс-спектрометрией [23]; результаты масс-спектрометрии обрабатывали с помощью программы mMass 5.4 [24] и сервиса Mascot.

Клонирование кДНК рибосомного белка uL15 в плазмиду pcDNA3. кДНК рибосомного белка uL15, несущую на 3′-конце последовательность, кодирующую 3xFLAG-пептид и содержащую сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI, получали с помощью ПЦР в 2 этапа. В качестве матрицы для проведения ПЦР использовали суммарную кДНК человека, полученную, как описано ранее [25]. На первом этапе, используя праймеры F-uL15 и R-FLAGuL15 (табл. 1), получали ПЦР-продукт, соответствующий кодирующей части мРНК рибосомного белка uL15. На втором этапе этот ПЦР-продукт был амплифицирован с использованием праймеров F-uL15 и R-3xFLAGUni (см. табл. 1) для встраивания последовательности, соответствующей 3xFLAG-пептиду. Полученный ПЦР-продукт обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI и клонировали в вектор pcDNA3 по этим же сайтам рестрикции. Итоговую плазмиду pcDNA3-uL15^3xFLAG нарабатывали в клетках E. coli штамма XL1-Blue.

Получение плазмид pcDNA3-uL15(H39A)^3xFLAG, pcDNA3-uL15(H39T)^3xFLAG и pcDNA3-uL15(H40A)^3xFLAG. Мутации в кДНК рибосомного белка uL15, соответствующие заменам аминокислотных остатков His39 и His40 на Ala, а также замене His39 на Thr, вводили с помощью сайт-направленного мутагенеза [26], используя в качестве матрицы плазмиду pcDNA3-uL15^3xFLAG, пары праймеров: uL15(H39A)F и uL15(H39A)R, uL15(H40A)F и uL15(H40A)R, uL15(H39T)F и uL15(H39T)R (табл. 1) ‒ и ДНК-полимеразу Phusion.

Трансфекция клеток HEK293 плазмидными конструкциями pcDNA3-uL15(H39A)^3xFLAG, pcDNA3-uL15(H39T)^3xFLAG и pcDNA3-uL15(H40A)^3xFLAG. Клетки HEK293 культивировали в 10-см чашках Петри, содержащих DMEM, 10% FBS и 100 ед./мл пенициллина-стрептомицина, в CO₂-инкубаторе (5% CO₂) при 37°С. По достижении клетками плотности 50‒60% проводили их трансфекцию плазмидными конструкциями с помощью трансфектанта Turbofect, согласно инструкции производителя. Через 48 ч инкубации клетки промывали ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим циклогексимид в концентрации 100 мкг/мл, и снимали с чашек Петри.

Анализ встраивания uL15^3xFLAG в рибосомы. Осажденные клетки лизировали в буфере 20 мМ HEPES-KOH (рН 7.5), содержащем 15 мМ MgCl₂, 200 мМ KCl, 1% Тритон-Х100, 2 мМ DTT, 100 мкг/мл циклогексимида и 25 U/мл ингибитора РНКазы RiboLock. Лизат осветляли центрифугированием при 14 000 об./мин в течение 10 мин при 4°С, наслаивали на линейный градиент 7–47%-ной сахарозы в буфере 50 мМ Трис-HCl (рН 7.5), содержащем 50 мМ NH₄Cl, 12 мM МgCl₂ и 1 мМ DTT, и центрифугировали при 100 000 × g на роторе SW-40 (“Beckman”, США) в течение 4.5 ч при 4°С. После центрифугирования содержимое пробирок фракционировали, регистрируя оптическую плотность при длине волны 260 нм. Для расчета соотношения количества рибосом в полисомах и моносомах (Р/М) профили седиментации оцифровывали в программе OriginPro 9.1 (OriginLab) и вычисляли интегральную оптическую плотность, приходящуюся на пики полисом и монорибосом. Суммарный белок из фракций градиента выделяли связыванием со смолой StrataСlean и после разделения электрофорезом в 15%-ном SDS-ПААГ анализировали с помощью иммуноблотинга, используя антитела против FLAG M5. Эксперимент проводили в трех повторах.

Анализ доли uL15^3xFLAG-содержащих рибосом. Трансфицированные плазмидой pcDNA3-uL15^3xFLAG клетки культивировали, снимали и лизировали, как указано выше. Для диссоциации рибосом на субчастицы осветленный лизат обрабатывали пуромицином и 0.5 М KCl, как описано ранее [20]. Субчастицы разделяли центрифугированием в градиенте 10–30% концентрации сахарозы в буфере 50 мМ Трис-HCl (рН 7.5), содержащем 0.5 М KCl, 4 мM МgCl₂ и 1 мМ DTT, при 24000 об./мин на роторе SW-40 (“Beckman”) в течение 17.5 ч при 4°С. 60S рибосомные субчастицы из соответствующей фракции градиента осаждали эквивалентным объемом этанола, растворяли в 100 мкл буфера 50 мМ Трис-HCl (рН 7.5), содержащего 100 мМ NaCl и 10 мM МgCl₂ (буфер А), и инкубировали с 5 мкл (белок G)-содержащих магнитных частиц с иммобилизованными антителами анти-FLAG M2 в течение 16 ч при 4°С при перемешивании. По окончании инкубации частицы отделяли от супернатанта на магнитном сепараторе, промывали 2 раза 100-мкл аликвотами буфера A, которые затем объединяли с супернатантом. Диссоциацию 60S субчастиц, связавшихся с магнитными частицами, проводили в 1%-ном SDS с последующей фенольной депротеинизацией смеси. Количество РНК в водной фазе определяли спектрофотометрически при 260 нм. Из супернатанта 60S субчастицы, не связавшиеся с магнитными частицами, осаждали эквивалентным объемом этанола, предварительно отобрав 1/10 часть для анализа на отсутствие белка uL15^3xFLAG иммуноблотингом, как описано выше. Осадок 60S субчастиц растворяли в воде, выделяли РНК и определяли ее количество, как описано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение гидроксилирования белка uL15 в рибосомах из плаценты человека

Гидроксилирование рибосомного белка uL15 ранее изучали на культурах клеток млекопитающих [10]. С целью убедиться, что белок uL15 гидроксилирован в рибосомах тканей человека, мы получили препарат 60S субчастиц рибосом из послеродовой плаценты и выделили из него суммарный рибосомный белок, который подвергли электрофорезу в 15%-ном SDS-ПААГ. Полосы белков с молекулярной массой около 17 кДа анализировали с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF. В одной из полос достоверно идентифицирован рибосомный белок uL15 (рис. 1), которому соответствовали 6 пептидов в масс-спектре, причем масса одного из пептидов совпадала с массой пептида 33‒42 с гидроксилированным остатком His39, тогда как соответствующего негидроксилированного пептида не обнаружено. Это доказывает, что белок uL15, присутствующий в рибосомах нормальных тканей человека, гидроксилирован по остатку His39.

Рис. 1.

Идентификация гидроксилированного белка uL15 в 60S субчастицах рибосом из плаценты человека. Слева вверху: MALDI-TOF спектр трипсинового гидролизата полосы геля, содержащей белок uL15. Массы пептидов белка uL15 указаны, гидроксилированный пептид отмечен звездочкой. Внизу: панель, генерированная программой Mascot при анализе масс-спектра, с указанием (столбцы слева направо) обнаруженных пептидов белка uL15, их молекулярных масс: наблюдаемых, экспериментальных, рассчитанных, ‒ разницы между теоретической и экспериментально определенной величиной М_r и первичной структуры каждого пептида. Гидроксилированный пептид отмечен звездочкой. Справа вверху: определение статистической достоверности идентификации белка uL15 (RPL27A, согласно прежней номенклатуре) в программе Mascot. Полученный коэффициент 65 (Protein Score) указывает на высокую достоверность идентификации белка (для коэффициентов выше 59 р-значение меньше 0.05). Number of Hits ‒ число белков с соответствующим коэффициентом, обнаруженных программой для масс-спектра.

Синтез экзогенного FLAG-меченого белка uL15 в трансфицированных клетках HEK293 и определение его активности

С целью проследить за поведением экзогенного рибосомного белка uL15 в трансфицированных клетках на С-конец этого белка добавляли иммуногенный эпитоп 3xFLAG, позволяющий определять меченные им белки с использованием коммерческих антител. Для этого ДНК-фрагмент, кодирующий белок uL15 человека и слитый с ним 3xFLAG-эпитоп, клонировали в вектор pcDNA3 и получали плазмиду pcDNA-uL15^3xFLAG. Клетки HEK293, трансфицированные плазмидой pcDNA-uL15^3xFLAG, лизировали, и полученный лизат разделяли центрифугированием в градиенте плотности сахарозы с последующим фракционированием содержимого градиента и определением содержания целевого белка во фракциях 60S субчастиц, рибосом и полисом (рис. 2). Экзогенный рибосомный белок uL15^3xFLAG обнаружен во всех исследованных фракциях градиента, включая фракции, содержащие 60S субчастицы, 80S рибосомы (моносомы), а также “легкие” (до 3 моносом включительно) и “тяжелые” (более 3 моносом) полисомы (рис. 2). На основании этих данных можно сделать вывод, что 3xFLAG-эпитоп не препятствует встраиванию белка в 60S субчастицы, причем содержащие его субчастицы проявляют активность на всех стадиях трансляции, включая формирование 80S рибосом и их функционирование в составе полисом.

Рис. 2.

Определение содержания экзогенного рибосомного белка uL15^3xFLAG в транслирующих рибосомах. Вверху: профиль седиментации лизата клеток HEK293, продуцирующих белок uL15^3xFLAG, в градиенте концентраций сахарозы 10‒45%. Отмечены пики, соответствующие 40S рабосомным субчастицам, 80S рибосомам и полисомам. Пики 60S рибосомных субчастиц и 80S рибосом в этих условиях центрифугирования не разделяются. Внизу: идентификация белка uL15^3xFLAG в соответствующих фракциях сахарозного градиента с помощью иммуноблотинга с использованием антител против FLAG-эпитопа. Наличие белка uL15^3xFLAG во фракции, содержащей 40S субчастицы, связано с частичным наложением пиков 40S и 60S субчастиц в данных условиях центрифугирования и с некоторым загрязнением пика 40S субчастиц содержимым из верхних фракций, содержащих большое количество этого белка.

Для оценки доли рибосом, содержащих экзогенный белок uL15^3xFLAG, в трансфицированных клетках HEK293 в соответствующем препарате 60S рибосомных субчастиц определяли содержание субчастиц, способных и не способных связываться с антителами против FLAG-эпитопа, используя метод иммунопреципитации. Установлено, что доля 3xFLAG-содержащих 60S субчастиц составляет 35 ± 3% от их общего числа в трансфицированных клетках. Таким образом, при выбранных условиях трансфекции клеток HEK293 плазмидой pcDNA-uL15^3xFLAG примерно треть рибосом содержит экзогенный белок.

Влияние замен His39Ala и His39Thr в белке uL15^3xFLAG на активность рибосом

Учитывая, что белок uL15 практически полностью гидроксилирован по остатку His39, как в рибосомах из плаценты человека (см. выше), так и в рибосомах из клеток HeLa [10], мы пришли к заключению, что в клетках НЕК293 этот белок также полностью гидроксилирован по His39. Для выяснения роли гидроксилированного остатка His39 в uL15 в экзогенный белок uL15^3xFLAG вводили аминокислотные замены His39Ala и His39Thr. В первом случае гидроксилирования мутантного белка не происходило вообще, тогда как во втором случае гидроксильная группа присутствовала на атоме Cβ боковой цепи Thr39. Как и в предыдущем эксперименте, клетки трансфицировали соответствующими плазмидными конструкциями и полученные затем лизаты фракционировали центрифугированием в сахарозном градиенте (рис. 3). По сравнению с клетками, продуцирующими белок uL15^3xFLAG без мутаций, в лизате клеток, продуцирующих мутантные белки, соотношение интегральной оптической плотности, приходящейся на полисомы, к таковой для моносом (80S рибосомы) было снижено приблизительно на 1/3 (рис. 3). Это означает, что при продуцировании клетками мутантных форм белка uL15 с заменами His39Ala или His39Thr трансляционная активность рибосом сильно снижена. Кроме того, при анализе содержания мутантного белка uL15(H39A)^3xFLAG во фракциях соответствующего полисомного профиля выявлено, что его практически нет во фракциях “тяжелых” полисом (рис. 3б) в отличие от белка дикого типа (рис. 2). Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод о том, что гидроксилированый остаток His39 в рибосомном белке uL15 важен для трансляционной активности рибосом.

Рис. 3.

Сравнение трансляционной активности рибосом в клетках, продуцирующих экзогенный рибосомный белок uL15^3xFLAG или его мутантные формы с заменами His39Ala и His39Thr. Профили седиментации лизатов клеток HEK293, продуцирующих белки uL15^3xFLAG (а), uL15(H39A)^3xFLAG (б) и uL15(H39Т)^3xFLAG (в), в градиенте концентраций сахарозы (10‒45%). На панелях приведено отношение интегральных оптических плотностей областей полисом и моносом (Р/М), отмеченных пунктирными линиями. Относительная ошибка измерений отношения Р/М составляла не более 10%. Под панелью б приведен Вестерн-блот-анализ содержания белка uL15(H39A)^3xFLAG в соответствующих фракциях сахарозного градиента с использованием антител против FLAG-эпитопа. Причина наличия 3хFLAG-меченого белка во фракции 40S субчастиц та же, что и на рис. 2.

Анализ расположения гидроксилированного остатка His39 в белке uL15 и его окружения в составе рибосомы человека

С целью выяснить, как гидроксильная группа на остатке His39 белка uL15 может быть вовлечена в поддержание функционально активной структуры рибосомы, мы проанализировали атомарную структуру рибосомы человека, ранее полученную с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) [18]. Следует отметить, что атом кислорода гидроксильной группы остатка His39 отсутствует на этой структуре, по-видимому, из-за недостаточного разрешения крио-ЭМ, поэтому ориентация этой гидроксильной группы неизвестна. На расстоянии 14 Å от остатка His39 располагается акцепторный стебель тРНК в E‑сайте рибосомы. Следовательно, можно ожидать, что структура этой области важна для функциональной активности рибосомы. Расстояния между атомом Cβ остатка His39 и атомами соседних аминокислотных и нуклеотидных остатков превышают 5.5 Å. Из этого следует, что гидроксильная группа на остатке His39, даже с учетом длины связи C–O (1.43 Å), не может формировать водородные связи со своим окружением. Исключение составляет расстояние между атомом Cβ остатка His39 и атомом Nδ соседнего остатка His40, которое равно 4.3 Å. На основании длин связей C–O и N–H (1 Å) можно предположить, что гидроксильная группа на остатке His39 образует водородную связь с атомом азота имидазольного кольца остатка His40 (рис. 4). Действительно, расположение остатка His40 на крио-ЭМ-модели рибосомы позволяет предположить его участие в поддержании структуры 60S субчастицы через стабилизацию положения нуклеотидного остатка А39 28S рРНК, вывернутого из стекинга, формируемого остатками А38 и G40 (рис. 4). Таким образом, водородная связь между остатками His39 и His40 может поддерживать как их конформацию, так и близлежащей области 28S рРНК в рибосоме. Следовательно, остаток His40 в белке uL15 также важен для поддержания функционально активной структуры рибосомы, как и гидроксилированный остаток His39.

Рис. 4.

Расположение остатков His39 и His40 в белке uL15 в составе рибосомы человека. Структура белка и отдельных нуклеотидов 28S рРНК вычленена из структуры 80S рибосомы (PDB Acc. No. 4V6X), разрешенной с помощью крио-ЭМ [18]. Номера нуклеотидов в районе остатков His39 и His40 отмечены. Прямой пунктирной линией обозначено расстояние между атомом Cβ остатка His39 и атомом Nδ остатка His40. Пунктирной кривой изображен С-концевой пептид 3хFLAG в экзогенном белке.

Влияние замены His40Ala в белке uL15 ^3xFLAG на активность рибосом

С целью проверить предложенную выше гипотезу мы внесли мутацию в плазмиду pcDNA-uL15^3xFLAG, заменив кодон для His40 на кодон для Ala. При анализе полисомного профиля лизата клеток НЕК293, трансфицированных этой плазмидой (рис. 5), как и в профиле лизата клеток, продуцирующих мутантный белок uL15(H39A)^3xFLAG (рис. 3б), выявлен дефицит полисом (по сравнению с полисомным профилем лизата клеток, продуцирующих белок дикого типа). Распределение мутантного белка uL15(H40A)^3xFLAG во фракциях сахарозного градиента (рис. 5) также оказалось аналогичным таковому для мутантного белка uL15(H39A)^3xFLAG (рис. 3б) ‒ белок uL15(H40A)^3xFLAG практически отсутствовал во фракциях “тяжелых” полисом. На основании всех полученных нами данных логично предположить, что остаток His40, как и гидроксилированный His39, в белке uL15 важен для поддержания функционально активной структуры рибосомы. Предполагаемая водородная связь между атомом азота имидазольного кольца остатка His40 и гидроксильной группой His39, скорее всего, стабилизирует конформацию обоих этих остатков и тем самым поддерживает структуру рибосомы вблизи Е-сайта.

Рис. 5.

Определение трансляционной активности рибосом в клетках, продуцирующих экзогенный мутантный рибосомный белок uL15(Н40А)^3xFLAG, и идентификация этого белка в транслирующих рибосомах. Обозначения см. на рис. 3. Причина нахождения 3хFLAG-меченого белка во фракции 40S субчастиц та же, что и на рис. 2.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Нами показано, что в рибосомах из плаценты человека белок uL15 гидроксилирован по остатку His39. Создана плазмидная конструкция, позволяющая продуцировать в транзиентно трансфицированных клетках HEK293 рибосомный белок uL15^3xFLAG, и продемонстрировано, что белок встраивается в 60S рибосомные субчастицы, которые участвуют в формировании активных в трансляции 80S рибосом. Установлено, что мутации по остатку His39, лишающие белок uL15^3xFLAG способности к гидроксилированию, не препятствуют его встраиванию в 60S субчастицы, но снижают уровень полисом в клетках; при этом мутантная форма His39Ala этого белка практически отсутствует в “тяжелых” полисомах. Используя крио-ЭМ структуру рибосомы человека [18] и моделируя на ней расположение гидроксильной группы His39, мы предположили, что гидроксилирование белка uL15 по His39 необходимо для конформационной стабилизации остатков His39 и His40, так как мутация His40Ala имела такой же эффект, что и мутация His39Ala.

Снижение относительного уровня полисом при продуцировании трансфицированными клетками HEK293 мутантных форм белка uL15^3xFLAG означает, что значительная часть рибосом в этих клетках не может транслировать мРНК так же эффективно, как рибосомы в клетках, продуцирующих немутированный белок. Можно полагать, что частичное снижение эффективности трансляции, а не полное ее блокирование, в клетках с мутантными формами белка uL15^3xFLAG связано с наличием в клетках пула рибосом с эндогенным белком uL15. Действительно, анализ связывания 60S субчастиц с антителами против FLAG-эпитопа показал, что в транзиентно трансфицированных клетках одновременно присутствуют рибосомы как с эндогенным белком uL15 (65%), так и с экзогенным uL15^3xFLAG или его мутантными формами (35% для uL15^3xFLAG). Присутствие uL15^3xFLAG с мутациями His39Ala и His40Ala в составе “легких” полисом и их практически полное отсутствие в “тяжелых” полисомах можно объяснить тем, что скорость элонгации трансляции на рибосомах, содержащих мутантные формы белка uL15^3xFLAG, существенно ниже, чем на рибосомах с немутированным uL15^3xFLAG. Замедление элонгации может быть связано с тем, что мутации, которые предотвращают гидроксилирование аминокислотного остатка в позиции 39 uL15^3xFLAG, расположенной вблизи участка связывания акцепторного конца тРНК в Е-сайте (см. выше), приводят к нарушению транслокации тРНК и, следовательно, работы пептидилтрансферазного центра рибосомы. Однако не исключены и другие объяснения наблюдаемого эффекта.

Замена остатка Нis39 в белке uL15^3xFLAG на Thr приводила к такому же снижению трансляционной активности рибосом, как и замена на Ala, несмотря на то, что гидроксильная группа на His39 и гидроксильная группа остатка Thr находятся в одинаковой стереохимической ориентации. По-видимому, имидазольная группа остатка His39 критически важна для позиционирования гидроксильной группы на атоме Cβ, что необходимо для поддержания рибосомы в функционально активной форме.

Предполагаемая роль гидроксилирования остатка His39 белка uL15 в функционировании рибосомы ‒ через стабилизацию конформации остатков His39 и His40 ‒ напоминает высказанную ранее гипотезу об участии гидроксилированного остатка His216 белка uL2 в поддержании структуры 28S рРНК в 60S субчастице [19]. В рибосомном белке uL2 гидроксильная группа на атоме Cβ остатка His216 может формировать водородную связь с атомом азота имидазольного кольца остатка His218, фиксируя тем самым структуру белка в соответствующем регионе и стабилизируя структуру 28S рРНК в участке связывания белка uL2. Известно, что имидазольные группы остатков гистидина могут выступать как в роли доноров, так и в роли акцепторов водородной связи и поэтому часто бывают вовлечены в формирование третичной структуры белков и во взаимодействие с РНК [27]. В аминокислотном остатке His атом Cβ не обладает хиральностью и имидазольная группа может свободно вращаться вокруг связей Cα−Cβ и Cβ−Cγ. Гидроксилированный Cβ становится хиральным, а гидроксильная группа, при формировании водородной связи с соседней имидазольной, жестко фиксирует ее в структуре рибосомы. Следует отметить, что структура белков uL15 и uL2 в районах локализации остатков His39 и His216 разупорядочена [18]. По-видимому, поддержание надлежащей структуры этих районов рядом с активными центрами рибосомы посредством гидроксилирования аминокислотных остатков может быть критически важно для активности всего аппарата трансляции. Примечательно, что в обоих случаях одна гидроксильная группа может стабилизировать положение сразу двух остатков гистидина, что крайне рационально в условиях ограниченного пространства внутри рибосомы.

На основании полученных данных можно заключить, что гидроксилированный остаток His39 рибосомного белка uL15 важен для поддержания трансляционной активности рибосомы и роль гидроксильной группы может быть связана со стабилизацией структуры рибосомы в районе этого остатка. При гипоксии клеток, сопровождающей многие заболевания, уровень гидроксилирования рибосомных белков, в том числе uL15, понижается из-за ингибирования действия оксигеназ [10]. Это может приводить к снижению общего уровня трансляции в клетках или, при существовании специальных компенсаторных механизмов, к изменению уровня экспрессии отдельных генов. Следовательно, дальнейшие исследования необходимы для выявления связи между нарушением гидроксилирования рибосомных белков и изменением уровня экспрессии генов на стадии трансляции.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (17-04-00528) и частично базовым бюджетным финансированием ИХБФМ СО РАН (проект АААА-А17-117020210022-4) и финансированием по программе 5-100 Минобрнауки.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.