Молекулярная биология, 2020, T. 54, № 4, стр. 562-579

ВВЕДЕНИЕ

Зеленая микроводоросль Chlamydomonas reinhardtii – модельный объект, используемый генетиками, биохимиками и физиологами. Одним из широко распространенных способов выращивания C. reinhardtii является периодическое культивирование, при котором популяция клеток растет в неизменном и необновляемом объеме среды без дополнительного снабжения питательными веществами. Такие периодические культуры могут быть автотрофными, гетеротрофными или миксотрофными [1, 2]. В последнем случае в качестве источника углерода используют ацетат, что заметно ускоряет накопление клеточной массы C. reinhardtii [3].

К настоящему времени накоплены данные о строении и механизмах работы фотосинтетичес-кого аппарата [4, 5], а также об основах минерального питания [6‒8], устойчивости к стрессорам [9‒11] и процессах старения культуры хламидомонады [12]. Однако сведения о динамике метаболизма хламидомонады в процессе роста миксотрофной периодической культуры достаточно фрагментарны. Опубликованные данные либо описывают короткие периоды экспоненциального роста (в течение нескольких часов после пересадки), либо, напротив, направлены на изучение метаболических перестроек в стационарной фазе [13‒15]. Показано, что в ходе стационарной фазы увеличивается содержание насыщенных жирных и органических кислот, тогда как концентрация некоторых аминокислот снижается [15‒18]. Предполагается, что накопление жирных кислот направлено на депонирование метаболитов, характерное для завершения роста. Изменение профиля метаболитов может отражать также деструктивные процессы, обусловленные адаптацией клеток хламидомонады к новому физиологическому состоянию, соответствующему старению [19]. Напротив, начальный этап экспоненциального роста С. reinhardtii (в первые 22 ч после пересадки клеток) характеризовался нелинейными изменениями содержания таких метаболитов, как углеводы, жирные кислоты, а также ряда интермедиатов энергетических циклов [20].

Настоящая статья является логическим продолжением метаболомного анализа клеток С. reinhardtii, выращенных на средах с добавлением ацетата [21]. Сравнение профилей метаболитов на разных стадиях развития культуры позволило выявить основные метаболические перестройки, особенно в ходе экспоненциального роста [21]. Анализ этих метаболомных данных позволил “отобрать” ключевые ферменты и транспортеры хлоропласта хламидомонады, которые могли быть наиболее значимыми в метаболических перестройках, опосредованных ацетатом. Анализ метаболических перестроек, происходящих во время экспоненциальной фазы роста миксотрофной культуры хламидомонады, на протяжении более длительного периода, охватывающего экспоненциальную и стационарную фазы (1–6 суток), показал, что динамичные перестройки метаболома тесно коррелируют с такими физиологическими процессами, как фотосинтез, дыхание, старение и др. [21]. Доказано существование различий в метаболитных профилях как в период экспоненциального роста (1–4-е сутки), так и после перехода к стационарной фазе (4–6-е сутки). Показано значительное и нелинейное изменение содержания жирных кислот и ацилглицеринов, а также сахаров, включая дисахариды, что может отражать разницу в уровне синтеза, катаболизма и депонирования различных соединений [21]. Тем самым установлено, что во время экспоненциального роста изменяются пути ассимиляции углерода и характер энергетического обмена в клетках водоросли. Оба процесса тесно связаны с механизмами включения ацетата в метаболизм хламидомонады при миксотрофном питании. Следовательно, можно ожидать изменения активности целого ряда ферментов, участвующих в гликолизе, циклах Кребса и Кальвина, синтезе жирных кислот и др. (рис. 1, по данным [21]). Учитывая тесное взаимодействие различных клеточных органелл как в катаболических, так и в анаболических процессах фотосинтезирующей, но растущей в миксотрофных условиях микроводоросли, большое значение приобретают транспортеры, локализованные на мембране хлоропласта. В связи с этим рассмотрим основные ферменты (и их гены) первичного метаболизма, в том числе ферменты, вовлеченные в метаболизм ацетата, а также транспортеры хлоропластов и гены, их кодирующие.

Рис. 1.

Схема, иллюстрирующая роль продуктов исследованных генов в метаболизме C. reinhardtii и их взаимосвязь.

Метаболизм ацетата начинается с образования комплекса с КоА. Клетка хламидомонады способна превращать ацетат в ацетил-КоА двумя способами. При первом способе ацетил-КоА-синтаза превращает ацетат в ацетил-КоА. У хламидомонады этот фермент кодируют гены ACS1–4. Второй путь – двухэтапный. Сначала ацетат фосфорилируется ферментом ацетаткиназой, кодируемой генами ACK1 и 2. На втором этапе в результате работы фосфоацетилтрансферазы, кодируемой генами PAT1 и 2, образуется ацетил-КоА. Недавние молекулярно-биологические и протеомные исследования указывают на то, что хламидомонада обладает двумя ферментными системами АСК‒PAT. Установлено, что первая пара PAT1 и ACK2 локализуется в митохондриях, тогда как вторая ‒ PAT2 и ACK1, находится, предположительно, в хлоропластах [22‒24]. Установлено, что гены ACK1 и PAT2 локализованы на хромосоме 9, а ACK2 и PAT1 ‒ на хромосоме 17 [24].

Ацетил-КоА ‒ общее для различных биохимических путей соединение, регуляция усвоения которого определяет активность ряда важных биологических процессов. Ацетил-КоА включается в цикл трикарбоновых кислот цитратсинтазой, кодируемой генами CIS1 и 2. При этом CIS2 вовлечен преимущественно в глиоксилатный цикл, а CIS1 ‒ в цикл Кребса [25]. Ингибирование цитратсинтазы путем подавления экспрессии гена CIS с помощью интерференции приводило к росту уровня триацилглицерина (ТАГ). Напротив, сверхэкспрессия гена CIS приводит к снижению уровня ТАГ в 2 раза. Ввод ацетильных групп в цикл Кребса и их выход из него может осуществлять также цитратлиаза, субъединицы которой кодируются генами ACLA1 и ACLB1 хламидомонады [26].

Еще один механизм, обеспечивающий отток углерода из цикла Кребса и активацию глюконеогенеза, заключается в превращении оксалоацетата в фосфоенолпируват фосфоенолпируваткарбоксикиназой (PCK1) в условиях избытка АТР [27].

Реакция превращения ацетил-КоА в малонил-КоА, катализируемая ацетил-КоА-карбоксилазой (ACC), – ключевая в биосинтезе липидов [28]. У водорослей синтез липидов происходит преимущественно в пластидах. Хлоропластная форма ACC состоит из четырех субъединиц: биотин-карбоксил- переносящего белка (BCC1), биотинкарбоксилазы (CHLREDRAFT_122970) и двух субъединиц карбоксилтрансферазы (CHLREDRAFT_184945 – α-субъединица). Наряду с этим ацетильные группы могут участвовать в синтезе жирнокислотных цепей с помощью ацилтрансфераз, к числу которых относится FabH ‒ синтаза III 3-оксоацл-ацилпереносящий белка (KASIII), кодируемая у хламидомонады геном CHLREDRAFT_123419.

Изменение условий культивирования может существенно влиять на активность фиксации углерода и метаболизм сахаров. Поэтому особое регуляторное значение могут иметь гены, кодирующие ключевые ферменты цикла Кальвина, пентозофосфатного пути (ПФП), гликолиза и метаболизма сахаров: малую субъединицу Рубиско (RBCS1), фруктозобисфосфатальдолазу (FBA3), транскетолазу (TRK1), трансальдолазу (TAL2), PfkB-подобную карбогидраткиназу (CHLREDRAFT_111372), гексокиназу (HXK1), триозофосфатизомеразу (TPIC) и α-галактозидазу (AGA1). Изменения метаболизма сахаров могут влиять на баланс между расходованием и депонированием запасных веществ, в том числе крахмала. Ветвящий фермент SBE3 катализирует образование 1,6-α-гликозидных связей между цепями остатков глюкозы с образованием амилопектина ‒ основного компонента крахмала. Расщепление крахмала осуществляют фосфорилаза крахмала (CHLREDRAFT_137300, PHOB), изоамилазы и амилазы, в том числе β-амилаза (AMYB1). Образующаяся при этом мальтоза гидролизуется, в том числе 4-α-глюкантрансферазой STA11. Расщепление трегалозы катализирует α,α-трегалаза (CHLREDRAFT_195672).

Еще один ключевой регулятор энергетического взаимодействия пластид с цитозолем, участвующий в изменении интенсивности и направленности гликолиза и глюконеогенеза, ‒ пластидные транспортеры соединений С₃ [27]. К ним, например, можно отнести триозофосфат/фосфатный антипортер TPT [29]. К семейству транспортеров TPT относится белок APE2, предположительно локализованный в зоне контакта внешней и внутренней мембран хлоропласта. В клетках C. reinhardtii описаны пластидный 2-оксоглутарат/малатный антипортер (OMT) [30], белок LCI20, ортолог 2-оксоглутарат/малатного обменника оболочки хлоропластов арабидопсиса [31, 32]. В геноме хламидомонады идентифицированы гены пластидных транспортеров гексоз (HXT1), мальтозы (MEX1), а также фосфат/фосфоенолпируватного антипортера PPT1.

Таким образом, изменения энергетического и пластического метаболизма, наблюдаемые в процессе развития миксотрофной периодической культуры хламидомонады, могут опосредоваться изменениями активности нескольких ферментов и транспортеров (рис. 1). Активность этих белков может регулироваться на разных уровнях, в том числе, за счет изменения транскрипции генов, их кодирующих. В данном исследовании проанализирован уровень транскрипции 32 генов (табл. 1), кодирующих ферменты ассимиляции ацетата, цикла Кальвина, гликолиза и др., а также хлоропластных транспортеров, активность которых может меняться в процессе экспоненциального роста культуры C. reinhardtii.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объект и культивирование. Культура C. reinhardtii сс-124 получена из коллекции кафедры генетики и биотехнологии биологического факультета Санкт-Петербургского государственного университета. Культуру поддерживали аксенично на жидкой среде TAP (Tris Acetate Phosphate) [33] в конических стеклянных колбах объемом 500 мл, которые содержали 250 мл среды, при периодическом перемешивании, естественной концентрации CO₂ и постоянном освещении люминесцентными лампами холодного света с интенсивностью 3000 лк. Плотность культуры определяли подсчетом клеток в камере Горяева. Отбор проб проводили 4 раза: в начале (1-е сутки), середине (2-е суток) и в конце (4-е сутки) экспоненциальной, а также в стационарной (6-е сутки) фазе развития культуры (рис. 2) в четырех биологических повторностях.

Рис. 2.

Рост клеточной плотности периодической миксотрофной культуры C. reinhardtii, и точки отбора проб (пунктирные линии), интервалы – SD.

Выделение РНК. Клетки хламидомонады (10⁷ клеток) осаждали центрифугированием (5 мин, 3000 g), осадок ресуспендировали в 1 мл реактива Пурзол (PureZOL™, “Bio-Rad”, США) [34] и перемешивали. Пробы инкубировали при комнатной температуре в течение 5‒10 мин, гомогенат замораживали. После оттаивания пробы центрифугировали (10 мин, 12 000 g и 4°C), к гомогенату добавляли 0.2 мл хлороформа, интенсивно перемешивали в течение 15‒20 с и выдерживали при комнатной температуре (5 мин) с периодическим перемешиванием. Затем пробы центрифугировали (15 мин, 12500 g и 4°С), к верхней бесцветной водной фазе добавляли 0.5 мл изопропанола, инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Пробу центрифугировали (10 мин, 12 500 g, 4°С). Супернатант удаляли, осадок промывали, добавляя 1 мл 75%-ного этанола, перемешивали и центрифугировали (5 мин, 12 500 g и 4°С). Осадок подсушивали в ламинаре и растворяли в стерильной воде. Качество и количество выделенной РНК проверяли спектрофотометрически (спектрофотометр NanoDrop 1000, “Thermo Fisher Scientific”, США). Пробы хранили при –80°С.

Получение кДНК. Препарат РНК очищали от ДНК, используя обработку ДНКазой (DNase I, RNase-free, “Thermo Fisher Scientific”), согласно инструкциям производителя. кДНК cинтезировали с использованием Oligo(dT)-праймера (“Бигль”, Россия) и обратной транскриптазы M-MuLV (“Thermo Fisher Scientific”) согласно инструкциям производителя с применением ингибитора РНКаз (Thermo Scientific RiboLock RNase Inhibitor, США). Пробы хранили при –80°С. Качество кДНК оценивали по длине полученных фрагментов с помощью электрофореза в полиакрил- амидном геле.

Дизайн праймеров и ПЦР в реальном времени. Праймеры подбирали с использованием программы Beacon-Designer 8 (“Sigma Aldrich”, США). Длина праймеров составляла около 20 н. (табл. 1), длина ампликона 80–250 н., предсказанная температура плавления 60°С, доля GC не более 60%. Качество праймеров оценивали с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с последующим анализом кривых накопления продуктов реакции и кривых плавления, а также длины синтезированных фрагментов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. ПЦР-РВ проводили с использованием SYBR Green I (“Синтол”, Россия) на амплификаторе CFX96 (“BioRad”) в следующем режиме: 95°С ‒ 15 с, 60°С – 50 с, 45 циклов.

Математическая обработка. Интенсивность экспрессии определяли в трех биологических и трех аналитических провторностях. Основываясь на опубликованных данных [10, 35, 36], в качестве гена сравнения использовали ген CBLP (RACK1), кодирующий полипептид, сходный с β-субъединицей G-белка (G protein β subunit-like polypeptide) [37]. Был протестирован также ген RPL19, стабильность экспрессии которого показана ранее [38]. Относительный уровень экспрессии рассчитывали по формуле 2^–ΔCt [39]. Изменения относительного уровня экспрессии, рассчитанные с использованием указанных выше генов сравнения, были сходными, поэтому в работе приведены значения, рассчитанные только с использованием CBLP.

Анализ проводили с помощью языка программирования R 3.3 [40]. Однофакторный дисперсионный анализ ‒ с помощью функции aov, переменные проверяли на нормальность распределения с помощью теста Шапиро‒Уилка (функция shapiro.test), а гомогенность дисперсии ‒ с помощью теста Флигера‒Киллена (функция fligner.test). Иерархический кластерный анализ проводили с использованием пакета pvclust [41]. В качестве дистанции использовали величину: 1-r, где r – коэффициент корреляции Пирсона. Для кластеризации использовали метод Варда. Кластеры выделяли на основе их статистической значимости по значению AU p (approximately unbiased p-value) [41]. Число кластеров, характеризующих динамику экспрессии, выбрано на основе анализа “графика локтя” (или “каменистой осыпи”, scree plot), учитывающего зависимость дистанций между кластерами и число кластеров (агломераций).

Анализ МГК выполнен с помощью пакета pcaMethods [42]; (О)ПЛС-ДА – пакета ropls [43]; МЕБА ‒ пакета timecourse [44]. Связь переменной со временем оценивали по значению T² теста Хотеллинга.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ методом главных компонент

Для выявления различий между клетками хламидомонады на разных этапах развития культуры, их закономерностей и интерпретации использовали мультивариантный анализ. На первом этапе для установления сходства профилей транскрипции в разные временные точки использовали метод МГК. На рис. 3 представлены графики матрицы счетов первых трех ГК, которые объясняют 45.7, 26.9 и 9.5% дисперсии соответственно. Видно, что пробы группируются в зависимости от времени развития культуры (DBI = 0.29 для четырех кластеров, соответствующих времени, в пространстве трех ГК). Это свидетельствует о значительной связи развития культуры хламидомонады с динамикой экспрессии генов, кодирующих ферменты центрального метаболизма. Интересно, что различия сглаживались по мере приближения к стационарной фазе. Как видно из графика матрицы счетов, профили экспрессии растущих культур различаются между собой и отличаются от профилей в стационарной фазе в пространстве первых двух ГК (рис. 3а), а профили культур при завершении роста и в стационарной фазе различаются слабо лишь в пространстве ГК3 (рис. 3б).

Рис. 3.

Графики матрицы счетов, полученные в ходе анализа методом главных компонент профилей экспрессии генов, кодирующих ферменты первичного метаболизма и пластидные транспортеры, на разных временных этапах развития периодической миксотрофной культуры C. reinhardtii после посева. а – В пространстве ГК1 и ГК2; б – в пространстве ГК1 и ГК3.

Классификация методом ПЛС-ДА

Поскольку методом ГК показано, что пробы образуют три кластера (рис. 3а), которые соответствуют началу (1-е сутки), середине роста (2-е сутки), а также периоду, включающему завершение роста и стационарную фазу (4–6 суток), то различия между этими группами анализировали методом ПЛС-ДА. Полученная модель включала две ГК, объясняющие 46 и 27% дисперсии (R²Y = 0.94, Q²Y = 0.89). Гены, уровень экспрессии которых наиболее связан с различиями классов, отбирали по величинам параметра VIP, представленными на рис. 4 (ось абсцисс). Значения VIP у большинства проанализированных генов превышали 1. Это гены ACS1,2 и ACK2, кодирующие ферменты ассимиляции ацетата, CIS2 и ACLA1 – входа ацетильных групп в цикл Кребса, а также гены ферментов, вовлеченных в гликолиз и ПФП: TRK1, TAL2, PCK1, TPIC, HXK1, TPIC, CHLREDRAFT_111372, и гены таких ферментов метаболизма крахмала, как фосфорилаза крахмала (PHOB) – CHLREDRAFT_137300, α,α-трегалаза – CHLREDRAFT_195672, а также 4-α-глюкантрансфераза – STA11. Установлена выраженная связь гена CHLREDRAFT_122970 со сменой фаз роста. Этот ген кодирует биотинкарбоксилазу – домен ACC, включающей ацетильные группы в цепи жирных кислот. Кроме того, высокие значения VIP отмечены для генов трех пластидных транспортеров: OMT1, APE2, MEX1.

Рис. 4.

Рассеяние генов в пространстве значений VIP уровней экспрессии по результатам (О)ПЛС-ДА-моделирования динамики профиля экспрессии генов, кодирующих ферменты первичного метаболизма и пластидные транспортеры, в процессе развития миксотрофной культуры C. reinhardtii. По оси абсцисс – VIP ПЛС-ДА-модели с двумя ГК и тремя классами: начало роста (1-е сутки), середина роста (2-е сутки) и период, включающий завершение роста и стационарную фазу (4-е и 6-е сутки). По оси ординат – VIP предиктивной компоненты модели ОПЛС-ДА, включающей два класса: завершение роста (4-е сутки) и стационарная фаза (6-е сутки).

В предыдущей модели транскрипционные профили культур на 4-е и 6-е сутки развития были объединены в один класс, однако по данным, полученным методом МГК, между ними все-таки наблюдались слабые различия (рис. 3б), поэтому их рассматривали отдельно. Различия транскрипционных профилей культур, находящихся в конце фазы экспоненциального роста (4-е сутки) и в стационарной фазе (6-е сутки), анализировали методом ОПЛС-ДА. Предиктивная компонента описывала только 34% дисперсии. Таким образом, дисперсия, связанная со временем, оказалась сравнительно небольшой. На рис. 4 (ось ординат) представлены значения VIP предиктивной компоненты. Только около трети генов имели значения VIP более 1. Среди них три гена – HXT1, PPT1, LCI20, кодируют пластидные транспортеры. Связь со старением культуры характерна также для генов, кодирующих ферменты, вовлеченные в фиксацию углерода и метаболизм сахаров: RBCS1, HXK1, TRK1, TAL2; метаболизм крахмала – SBE3, AMYB1, STA11, и синтез жирных кислот (CHLREDRAFT_184945, кодирующий α-субъединицу карбоксилтрансферазы).

Cходство и различия в динамике транскрипционного профиля на протяжении роста культуры, перехода в стационарную фазу и в стационарной фазе анализировали, сравнивая значения VIP генов первой и второй моделей ПЛС-ДА. Как видно из рис. 4, на котором представлено рассеяние генов в пространстве их VIP, в описанных двух моделях не наблюдается никакой зависимости, что означает практически полное отсутствие связи между динамикой уровня транскрипции генов в стационарной фазе и в ходе роста культуры.

Мультивариантный эмпирический Байесовский анализ (МЕБА) динамики уровня экспрессии генов в процессе развития культуры

Особенностью МЕБА, одного из эффективных методов анализа динамики большого количества признаков во времени, является учет ковариации переменных у нескольких исследуемых объектов (в нашем случае это три независимые культуры хламидомонады). Это позволяет нивелировать различия между культурами и точнее определить влияние времени на анализируемые переменные. Связь признака со временем оценивали по величине T² статистики Хотеллинга [45, 46]. На рис. 5 представлена диаграмма значений T². Можно видеть, что наибольшие значения Т² показывают гены TPIC, CHLREDRAFT_111372, HXK1, OMT1, ACK2, CHLREDRAFT_123419, STA11, ACLA1 и ACS1.

Рис. 5.

Значения T² Хотеллинга по результатам МЕБА динамики уровня экспрессии генов, кодирующих ферменты первичного метаболизма и пластидные транспортеры, в ходе развития периодической миксотрофной культуры C. reinhardtii.

Динамика экспрессии генов

Для определения закономерностей динамики интенсивности экспрессии генов и выявления корегулируемых групп генов проведен корреляционный анализ с последующей иерархической кластеризацией с использованием в качестве дистанции коэффициента Пирсона. Для определения статистической значимости выделения кластеров в качестве критерия применена величина AU p, вычисляемая на основе многомасштабной перевыборки бутстрапом (multiscale bootstrap resampling) [41]. На основе анализа графика локтя (рис. 6а) и оценки статистической значимости кластеров (рис. 6б) выделены шесть кластеров с характерными паттернами динамики экспрессии генов интереса (рис. 6б, в).

Рис. 6.

Иерархическая кластеризация методом Варда генов ферментов первичного метаболизма и пластидных транспортеров C. reinhardtii. В качестве дистанций использовали коэффициент корреляции средних значений их экспрессии, измеренных в процессе развития миксотрофной культуры. a – График локтя, иллюстрирующий зависимость дистанций между объединяемыми кластерами и числом агломераций (и числом кластеров), пунктирные линии соответствуют выбранному числу кластеров и обрезке высоты дерева. б – Дендрограмма с выделеными статистически значимыми кластерами (AU p < 0.05). в – Графики стандартизированных значений (SD = 1, M = 0) уровней экспрессии генов (абсцисса), объединенных по паттернам динамики, ординаты – сутки после посева.

Гены группы I и III отличало снижение уровня экспрессии в процессе старения культуры. Первый паттерн отличался тем, что в период экспоненциального роста накопление продукта транскрипции оставалось на относительно высоком уровне, хотя могло умеренно снижаться. При завершении роста экспрессия генов данной группы резко падала и стабилизировалась. Такая динамика накопления транскриптов в процессе роста культуры присуща генам: PCK1, TPIC, ACS1,2, CIS2, FBA3, CHLREDRAFT_137300.

Для генов третьего кластера характерно резкое снижение экспрессии уже в середине экспоненциального роста, после чего уровень экспрессии оставался относительно стабильным (TAL2, CHLREDRAFT_122970), продолжал снижаться (TRK1) или наблюдался умеренный рост (ACK1).

Таким образом, тенденция к снижению экспрессии со временем наблюдалась у генов, кодирующих ферменты ассимиляции ацетата: ацетил-КоА-синтазу и пластидную ацетаткиназу ACK1. Экспрессия генов, кодирующих ферменты ПФП и цикла Кальвина – трансальдолазы, транскетолазы, также снижается с возрастом культуры. Эта же тенденция показана для генов фосфоенолпируваткарбоксикиназы, триозофосфатизомеразы и фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы, вовлеченных в гликолиз и глюконеогенез. Сходную картину можно наблюдать и для генов некоторых ферментов, участвующих в поступлении ацетильных групп в цикл Кребса, таких как цитратсинтаза. Таким образом, в процессе роста культуры происходит снижение активности генов, кодирующих ферменты основных энергетических и пластических путей клетки. При этом быстро снижается активность гена фосфорилазы крахмала.

Вторая группа близка к группе III и образует с ней большой кластер (рис. 6б). Группа II включает гены RBCS1 и CHLREDRAFT_195672. Динамика экспрессии этих генов не коррелирует с увеличением возраста культуры (рис. 6в). Кроме того, по данным дисперсионного анализа эти изменения не имеют статистической значимости, и согласно МЕБА имеют относительно низкие значения T².

Устойчивый рост экспрессии с увеличением возраста культуры зарегистрирован лишь у небольшого числа генов (кластер IV) – это HXT1, AMYB1 и SBE3. Все три гена связаны с метаболизмом гексоз, тем не менее, если α-амилаза является одним из ключевых ферментов деградации крахмала, то SBE3, напротив, отвечает за его синтез. Лишь в случае HXT1 значимость изменения экспрессии подтверждается дисперсионным анализом (p = 0.0009). В случае гена AMYB1 можно обсуждать лишь наличие тенденции (p = 0.09).

Группы V и VI были близки и образовывали вместе большой кластер. Группа V включает лишь один ген – ACLB1, экспрессия которого возрастает на вторые сутки роста, поддерживается на этом уровне продолжительное время и снижается в значительно более поздней стационарной фазе. В этом случае статистическая значимость изменений относительно невысока (p = 0.07). Большую часть исследованных генов (OMT1, MEX1, CHLREDRAFT_184945, STA11, CHLREDRAFT_123419, APE2, HXK1, ACK2, CHLREDRAFT_111372, ACLA1, BCC1, TPT2) можно отнести к шестому паттерну – росту экспрессии в первой половине экспоненциального роста с последующим снижением при переходе в стационарную фазу. По данным дисперсионного анализа изменение экспрессии двух последних генов (BCC1 и TPT2) статистически слабо значимо (0.05 < p ≤ 0.1).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Хламидомонада обладает способностью усваивать экзогенный ацетат как дополнительный источник углерода при миксотрофном типе питания. За последние 2 года опубликованы результаты двух масштабных транскриптомных исследований, нацеленных на изучение изменений, происходящих в клетках хламидомонады при миксотрофном выращивании [47, 48]. В базе данных KEGG представлено 113 биологических процессов, в которые вовлечено 3145 генов. В этих статьях рассмотрены топ-10 путей и топ-100 генов, изменение которых соответствовало изменению характера роста культуры хламидомонады (на твердой или жидкой среде, на свету или в темноте, в присутствии ацетата в различной концентрации). Представлены данные о различиях в экспрессии генов в ходе экспоненциальной и стационарной фазы роста культуры. При выращивании хламидомонады при минимальном содержании ацетата и в жидкой среде (что максимально соответствует условиям нашего эксперимента) происходит накопление транскриптов генов белков фотосинтеза и деления на этапе экспоненциального роста, а в последующей стационарной фазе – белков катаболизма и деградации аминокислот, связанных со стрессом, шаперонов и др. Представленные данные, тем не менее, не ответили на один из важнейших вопросов – за счет каких метаболических путей, при участии каких ферментов происходит включение ацетата в метаболизм? Каким образом меняется экспрессия генов, кодирующих эти ферменты, особенно в фазу экспоненциального роста, когда метаболизация представляется наиболее интенсивной?

Наше исследование ставило своей целью выявить различия в экспрессии генов, кодирующих ряд ключевых ферментов метаболизма и транспорта метаболитов в ходе развития периодической культуры хламидомонады в миксотрофных условиях (табл. 1‒3, рис. 1). По данным базы KEGG лишь около 250 генов хламидомонады кодируют ферменты девяти основных биохимических путей центрального углеродного метаболизма. На основании проведенного нами метаболомного анализа [21] и ранее опубликованных данных [21] можно ожидать, что присутствие ацетата затрагивает, в первую очередь, пути его ассимиляции, цикл Кребса, синтез жирных кислот и фиксацию углерода. Поэтому были выбраны ключевые ферменты этих путей и найдены гены, их кодирующие. Нами проанализирована экспрессия 32 генов, список которых приведен в табл. 1, с указанием их продуктов, а также праймеров к ним. Снижение размерности с помощью МГК (рис. 3) выявила различия в профилях экспрессии генов в клетках хламидомонады на разных стадиях развития культуры, характеризующихся неодинаковым уровнем пролиферации и интенсивности основных физиологических процессов. В пространстве первых двух ГК, описывающих около 70% дисперсии, профили экспрессии формировали три группы, соответствующие началу экспоненциальной фазы, ее середине, а также группу, объединяющую завершение экспоненциального роста и стационарную фазу (рис. 3а). Различия этих трех периодов связаны прежде всего с ГК1 (46%), что может указывать на существенное сходство процессов, протекающих в течение всего развития культуры. Следует отметить своеобразие профиля экспрессии в начале экспоненциальной фазы, отражающее, по-видимому, изменение состояния клеток при выходе из лаг-фазы и переход к пролиферации.

Подчеркнем, что степень вариабельности профилей экспрессии снижается со временем. Об этом свидетельствуют результаты, полученные с помощью как МГК (рис. 3), так и теста Тьюки, показавшие, что уровни экспрессии большого числа генов статистически значимо меняются именно в фазе роста. Сходные тенденции наблюдали и ранее при анализе динамики профиля метаболитов в процессе развития миксотрофной культуры хламидомонады [21]. Таким образом, молекулярно-генетический статус клеток наиболее динамично меняется именно в ходе экспоненциального роста и стабилизируется после его завершения. Это может быть связано как с изменением экзогенных условий, параметры которых (например, состав среды) стабилизируются со временем, так и с физиологическим состоянием самих клеток, например, в результате остановки пролиферации. Анализ методами МЕБА и ПЛС-ДА показал, что с развитием культуры связаны, прежде всего, гены ферментов энергетического метаболизма: ассимиляции ацетата, цикла Кребса, гликолиза и ПФП (рис. 4, 5). Со старением культуры ассоциированы гены, кодирующие пластидные транспортеры и ферменты метаболизма крахмала и углеводов (рис. 4).

Нами выявлены шесть групп генов, динамика накопления транскриптов которых различается в ходе развития культуры (рис. 6, 7). Дифференциальная активность генов должна быть связана с их ролью в обеспечении клетки энергией и метаболитами на разных этапах роста культуры (рис. 1, 2). Показательно, что характер экспрессии генов кластера I сходен с паттерном изменения дыхания и фотосинтеза [21]. При этом снижение уровня дыхания и фотосинтеза во второй половине фазы роста соответствует снижению экспрессии генов кластеров III и VI. Таким образом, регуляция изменения активности физиологических процессов связана с регуляцией экспрессии генов этих кластеров.

Рис. 7.

Схема потоков углерода в миксотрофных клетках C. reinhardtii. Красные столбики – относительный уровень экспрессии генов в начале и середине экспоненциальной фазы, при переходе в стационарную фазу и в стационарной фазе. Цвет соответствует паттерну динамики уровня экспрессии: I – розовый, II – серый, III – синий, IV ‒ желтый, V и VI ‒ зеленый. ПФП – пентозофосфатный путь, ФЕП – фосфоенолпируват, Г-3Ф – глицеральдегид-3-фосфат, ФГК – 3-фосфоглицериновая кислота.

Важнейшим процессом, определяющим состояние клеток в миксотрофной культуре хламидомонады, является усвоение ацетата. Хламидомонада обладает пластидными и непластидными формами ферментов метаболизма ацетата (рис. 7). Возможно, цель такого разделения состоит в перераспределении ацетильных групп между процессами в различных компартментах клетки. К пластидному сегменту метаболизма, принимающему ацетильные группы, относится, прежде всего, синтез липидов, тогда как к цитозольному и митохондриальному ‒ цикл Кребса и его модификации. При этом гены, кодирующие как хлоропластную, так и непластидную ацетил-КоА-синтазу (рис. 6, 7), имеют одинаковый характер экспрессии (паттерн I), что свидетельствует о сходной временной регуляции поступления углерода в оба сегмента метаболизма. Показан высокий уровень экспрессии генов, кодирующих ACK, на первые и вторые сутки, когда скорость роста культуры, активность дыхания и фотосинтеза максимальны [21]. Известно, что хламидомонада быстрее поглощает ацетат на этапе интенсивного роста, чем при остановке пролиферации [25, 49]. С другой стороны, присутствие ацетата в среде культивирования приводило к повышению экспрессии гена ACS2 [50]. При переходе к стационарной фазе снижается уровень экспрессии генов, кодирующих ферменты ассимиляции ацетата, что, видимо, связано с исчерпанием ацетата в среде, поскольку известно, что хламидомонада потребляет почти весь ацетат уже в экспоненциальной фазе роста [18, 51, 52].

Изменения экспрессии генов CIS2 и PCK1 сходны с изменениями гена ACS1. Ассимиляция углерода ацетата связана с оттоком углерода из цикла Кребса (глиоксилатного пути), который может катализироваться фосфоенолпируваткарбоксикиназой. Известно, что активность изоцитратлиазы, ключевого фермента глиоксилатного цикла, максимальная в молодых миксотрофных культурах C. mundana, снижается на порядок при старении. Это происходит на фоне исчерпания ацетата и падения уровня дыхания [53]. О важной роли фосфоенолпируваткарбоксикиназы и цитратсинтазы в усвоении ацетата свидетельствует также повышение экспрессии генов этих ферментов в ответ на добавление ацетата в стареющие культуры C. reinhardtii [25]. Углерод в форме фосфоенолпирувата (ФЕП) перенаправляется в пластиду и включается в глюконеогенез, что согласуется с высоким уровнем экспрессии гена PPT1, кодирующего пластидный переносчик ФЕП, а также генов FBA3 и TPIC, белковые продукты которых вовлечены в глюконеогенез в начале и середине роста культуры. С другой стороны, соотношение активности фосфоенолпируваткарбоксикиназы и АСС, конкурирующих за углерод, может определять перераспределение углерода между синтезом липидов и глиоксилатным циклом [54, 55]. Поэтому высокий уровень экспрессии PCK1 на фоне относительно низкого уровня экспрессии генов двух субъединиц ACC в первые сутки позволяет предположить, что в начальный период роста культуры значение цитозольной части метаболизма, где ацетат через глиоксилатный цикл и с участием фосфоенолпируваткарбоксикиназы превращается в ФЕП, сравнительно велико, поскольку велика потребность в “строительном материале”.

В пластиде, напротив, на вторые сутки роста максимальна активность генов, связанных с синтезом липидов, в том числе генов субъединицы ацетил-КоА-карбоксилазы (BCC1, CHLREDRAFT_184945), а также KASIII (CHLREDRAFT_123419). Ацетил-КоА можно считать “точкой распределения” углерода. Ацетил-КоА-карбоксилаза направляет углерод на биосинтез жирных кислот и липидов [28]. В то же время, регуляция синтеза липидов не определяется исключительно активностью ферментов, синтезирующих углеродные цепи жирных кислот [15, 56–58]. Количество ацетильных групп, которые могут быть использованы в синтезе липидов, определяется, в том числе, уровнем их включения в цикл Кребса и выходом из него. Интересно, что в середине экспоненциальной фазы повышается уровень экспрессии генов, кодирующих субъединицы изоцитратлиазы, особенно ACLA1 (рис. 6). Этот фермент способен катализировать регенерацию ацетил-КоА, который может использоваться в синтезе жирных кислот [59]. Известно, что уровень ACL1 возрастает после перехода к синтезу липидов при азотном голодании [60]. Рост активности генов ферментов, направляющих ацетильные группы на синтез жирных кислот, согласуется со снижением экспрессии CIS2, “направляющего” их в цикл Кребса. Известно, что подавление экспрессии гена цитратсинтазы приводит к росту уровня ТАГ и его снижению при сверхэкспрессии этого гена [26]. Все это может отражать частичное перераспределение ацетильных групп из цикла Кребса/глиоксилатного цикла в пластидный путь синтеза жирнокислотных цепей.

В этот же период возрастает активность гена гексокиназы (HXK1), что может указывать на усиление гликолиза. О высокой активности гликолиза в этот период свидетельствует также сохранение высокого уровня экспрессии генов FBA3 и TPIC на вторые сутки роста на фоне снижения активности генов ПФП ‒ TRK и TAL2. Высокий уровень активности гликолиза можно связать с увеличением потребности в трехуглеродных молекулах для синтеза ТАГ.

Усиление гликолиза может привести к повышению синтеза АТР и восстановленных кофакторов в пластиде. А увеличенное использование ацетильных групп в синтезе липидов в середине экспоненциального роста – к снижению интенсивности окисления ацетильных групп в митохондриях. В результате будет наблюдаться переизбыток восстановителей и энергии в пластиде. Поддержание энергетического баланса в клетках хламидомонады осуществляется с помощью триозофосфатного шунта [27]. Поэтому не удивительно, что в этот же период достигает максимума активность генов, кодирующих белки-переносчики, что свидетельствует о восстановлении энергетического баланса между пластидой и цитозолем (рис. 6, 7). Увеличивается также накопление транскриптов гена OMT1, кодирующего оксоглутаратный/малатный антипортер, обеспечивающий выход восстановителей из пластиды.

Динамика экспрессии генов кластеров VI и V характеризуется первичным накоплением, а затем снижением содержания транскриптов, что согласуется с обнаруженным нами ранее изменением уровня многих метаболитов, увеличение содержания которых регистрировали в начале роста культуры, максимум – в середине, а затем, во второй половине фазы роста, наблюдали снижение [21]. К числу этих метаболитов можно отнести жирные кислоты, преимущественно с относительно короткими цепями. Такая же динамика была характерна и для интемедиатов энергетических и синтетических путей, в том числе гликолиза, циклов Кребса и Кальвина [21].

Уровень экспрессии почти всех исследованных генов снижается при завершении роста культуры. Сильное снижение уровня транскриптов большей части генов, кодирующих ферменты первичного метаболизма, в том числе связанные с дыханием и ассимиляцией углерода (рис. 6в, 7), к третьим суткам культивирования совпадает с резким падением уровня дыхания и фотосинтеза [21]. Можно предположить, что изменения экспрессии генов, связанных с циклами Кальвина и гликолизом, обусловлены постепенным исчерпанием ацетата и сменой трофических условий. Протеомные исследования указывают на то, что в условиях миксотрофии значительно возрастает содержание ряда ферментов цикла Кальвина, в том числе TPI, FBA3, TRK [61].

Несмотря на снижение экспрессии генов субъединиц ACC и KAS, в стационарной фазе возрастает содержание ряда свободных жирных кислот и ацилглицеринов [21]. Это подтверждает гипотезу, согласно которой в условиях стресса и в стареющих культурах пулы липофильных соединений пополняются в результате деструктивных процессов, связанных с аутофагией и деструкцией мембран [62]. Это согласуется с тем, что регуляция синтеза липидов не всегда определяется исключительно активностью ферментов, синтезирующих углеродные цепи жирных кислот, а активность ACC [56] или изменения экспрессии гена, его кодирующего, не соответствуют изменению накопления липидов [15, 57]. В ряде случаев повышенная экспрессия гена, кодирующего KASIII, также не приводит к росту синтеза жирных кислот в тканях растений [58]. Можно предположить, что участие перечисленных ферментов в регуляции синтеза жирных кислот более выражено при доступности большого числа ацетильных групп, при снижении доли таких групп снижается и роль этих ферментов в метаболизме углерода в клетках хламидомонады.

С возрастом культуры наблюдается заметный рост экспрессии гена HXT1, кодирующего белок экспорта гексоз из пластид в цитоплазму, что может отражать усиление роли потока углерода из пластид в условиях исчерпания ацетата. Источником этого углерода может быть не только непосредственно фотосинтез, но и деградация крахмала, на что указывает незначительный рост экспрессии гена AMYB1, кодирующего β-амилазу, поскольку баланс синтеза и деградации крахмала в клетках хламидомонады может зависеть от активности амилазы [58].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интенсивность экспрессии большинства проанализированных нами генов изменяется в процессе развития культуры хламидомонады. Завершение экспоненциальной фазы роста сопровождается снижением накопления транскриптов и интенсивности метаболизма. Наибольшие изменения профиля транскрипции выявлены в период, близкий к середине экспоненциального роста, когда происходит радикальная перестройка метаболизма, связанная с запуском синтеза липидов, что сопровождается изменением потоков углерода по биохимическим путям и смещением баланса энергии между пластидой и цитозолем.

Работа выполнена при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 15-04-03090 и 16-34-01122) и Санкт-Петербургского государственного университета (НИР 1.40.495.2017) с использованием оборудования Ресурсного центра СПбГУ “Развитие молекулярных и клеточных технологий”.

Настоящая статья не содержит исследований с использованием людей или животных.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.