Молекулярная биология, 2021, T. 55, № 3, стр. 500-509

ВВЕДЕНИЕ

Доступность ДНК-матрицы для транскрипционных факторов контролируется уровнем компактизации хроматина, который в свою очередь регулируется АТP-зависимым ремоделированием нуклеосом и внесением или снятием ковалентных модификаций гистонов. Эти изменения хроматина приводят к формированию структуры молекулы ДНК, с которой связываются транскрипционные факторы. За эти процессы отвечают коактиваторные комплексы – эволюционно консервативные мультибелковые комплексы, участвующие в активации транскрипции.

Коактиваторные комплексы чаще всего имеют несколько ферментативных активностей, которые также регулируются другими белками. Фактически, большие коактиваторные комплексы состоят из нескольких модулей, которые играют определенную функциональную роль. SAGA – эволюционно консервативный эукариотический комплекс, способный ацетилировать N-концевые последовательности гистонов, участвует в активации транскрипции широкого спектра генов. В состав комплекса SAGA входят 18–20 субъединиц [1]. Генетические и биохимические исследования показали, что SAGA состоит из нескольких функциональных модулей: структурного основания, гистон-ацетилтрансферазного модуля (HAT), деубиквитинирующего модуля (DUB) и модуля связывания с активатором [2, 3]. SAGA многоклеточных организмов содержит также модуль сплайсинга.

В состав ацетил трансферазного модуля входит фермент ацетил-трансфераза Gcn5. Этот модуль активирует транскрипцию за счет ацетилирования остатков лизина в молекулах гистонов. Ацетилирование активирует экспрессию генов, создавая открытую структуру хроматина, что позволяет связаться с хроматином и ДНК другим транскрипционным факторам [4–6].

DUB-модуль SAGA деубиквитинирует гистон H2B [7–11]. В состав DUB-модуля у Drosophila melanogaster и Saccharomyces cerevisiae входят белки: Nonstop (yUbp8), Sgf11, ENY2 (ySus1) и ATXN7 (ySgf73) (табл. 1) [12, 13].

Изучение структуры DUB-модуля дрожжей показало, что он соединяется с остальным комплексом SAGA с помощью C-концевого участка белка Sgf73 (dATXN7) [14, 15]. Белок yUbp8 (dNonstop) является каталитической субъединицей, а Sgf11 необходим для взаимодействия yUbp8 с субстратом и поддержания его активной конформации [12, 13, 16].

Ранее мы показали, что белок Sgf11 участвует в формировании и экспорте мРНП-частицы независимо от DUB-модуля [17].

Недавно обнаружили, что SAGA участвует в транскрипции генов малых ядерных РНК (мяРНК) как Pol II-, так и Pol III-зависимых [18]. Pol III транскрибирует набор некодирующих РНК, включая тРНК, 5S РНК и U6 мяРНК [19]. Важную роль в Pol III-зависимой транскрипции играет транскрипционный фактор IIIB (TFIIIB). Этот фактор состоит из трех субъединиц и отвечает за рекрутирование Pol III на промоторы ее генов-мишеней. Каждая из субъединиц комплекса TFIIIB, (TBP (TATA-связывающий белок), BDP1 – большой SANT-доменсодержащий белок и родственные TFIIB факторы: BRF1 или BRF2), необходима для его правильного функционирования [20, 21].

Большинство транскрибируемых Pol III генов, таких как гены тРНК, имеют внутренние промоторы, содержащие два блока промоторных последовательностей (А и В), расположенных внутри области транскрипции. С этими блоками связывается транскрипционный фактор IIIC (TFIIIC) [22], который рекрутирует TFIIIB. Меньшая часть Pol III-транскрибируемых генов (гены мяРНК), имеют промотор, расположенный “выше” сайта старта транскрипции. Эти промоторы содержат TATA-box, который взаимодействует с TBP, PSE-элемент, связывающий фактор PBP, необходимый для привлечения TFIIIB, и DSE – элемент ДНК, обладающий свойствами энхансера [19, 23].

В транскрипции генов человека с промоторным элементом, расположенным внутри области транскрипции, участвует TFIIIB, содержащий белок BRF1, а в транскрипции с внешних промоторов – BRF2. У дрозофилы известен только Brf1, поэтому этот белок участвует в транскрипции и с внешних, и с внутренних промоторов.

С DSE взаимодействуют такие транскрипционные факторы, как Oct1, Sp1, NF1, Staf [23, 24]. Показано, что в генах U1, U2, 7SK и U6 мяРНК между элементами DSE и PSE находится нуклеосома, которая сближает эти две области в пространстве и облегчает взаимодействие между Oct1 и PBP [25–28]. Описано вовлечение в регуляцию Pol III-зависимой транскрипции фактора c-Myc, который рекрутирует кофакторы TRRAP и GCN5 к генам тРНК и 5S рРНК и стимулирует ацетилирование гистона Н3 в этих локусах [29].

Хотя влияние SAGA на транскрипцию генов изучено достаточно хорошо, нерешенным остается ряд вопросов, касающихся DUB-модуля SAGA. В частности, не ясно, существует ли DUB-модуль в клетке независимо от остального комплекса и как он взаимодействует с другими транскрипционными факторами. Мы показываем, что DUB-модуль может существовать в клетке независимо от SAGA, исследуем взаимодействие DUB-модуля с транскрипционным аппаратом Pol III, а также показываем, что механизмы взаимодействия DUB-модуля c транскрипционным аппаратом Pol II- и Pol III-зависимых генов различаются между собой.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Линии D. melanogaster. В работе использованы следующие линии D. melanogaster (табл. 2).

Антитела. В работе использованы поликлональные антитела к белкам: Sgf11, ENY2, Gcn5, Brf1, Pbp45, полученные ранее в нашей лаборатории [17, 18, 30, 31].

Фракционирование Sgf11-содержащего комплекса из экстракта ядер эмбрионов дрозофилы. Экстракт из ядер эмбрионов получен согласно процедуре, описанной ранее [30], из 0–12-часовых эмбрионов. Детальная схема фракционирования показана на рис. 1а. Колонки были уравновешены в HEMG-буфере (25 мМ HEPES-KOH, pH 7.6, 12.5 мМ MgCl₂, 0.1 мМ EDТА, 10% глицерина, 1 мМ дитиотреитол), содержащем 150 мМ NaCl. Иммуноаффинную очистку выполняли на колонке с иммобилизованными антителами к Sgf11, сшитыми с протеин-А-сефарозой. Не связавшиеся белки отмывали буфером HEMG 500, содержащим 0.1% NP-40. Детали процедуры очистки и MALDI-TOF MS описаны ранее [32, 33].

Рис. 1.

Очистка DUB-модуля комплекса SAGA из экстракта ядер эмбрионов. а – Схема очистки комплекса. ИП – иммунопреципитация антителами к Sgf11, сшитыми с носителем. б – Белки DUB-модуля комплекса SAGA, выявленные в ходе MALDI-TOF MS. Указаны ID белков, их названия, молекулярная масса, score –достоверность определения, количество выявленных пептидов.

Культура клеток S2 дрозофилы и эксперименты по нокдауну белков в S2-клетках. Клетки S2 культивировали при 25°C в среде Schneider’s insect medium (“Sigma”, США), содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (“HyClone”, США). Нокдаун белков проводили с помощью РНК-интерференции согласно протоколу [34]. В эксперименте использовали 5–7 мкг дцРНК на 1 × 10⁶ клеток. дцРНК синтезировали с помощью TranscriptAid T7 HighYield TranscriptionKit (“ThermoScientific”, США). Уровень экспрессии генов-мишеней измеряли с использованием количественной ПЦР и Вестерн-блот-анализа. дцРНК, соответствующую фрагменту GFP, использовали в качестве отрицательного контроля. дцРНК синтезировали с использованием следующих праймеров: ATXN7 – 5′-CGACTCACTATAGGGAGATCCATGCTGGAGCAGAAGGT-3′

и 5′-CGACTCACTATAGGGAGAGCAGTTCATTCAAACGCTTGGC-3′;

GPF – 5′-CGACTCACTATAGGGAGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGC-3′

и 5′-CGACTCACTATAGGGAGAGATGCCGTT-CTTCTGCTTGTCG-3′.

Иммунопреципитация хроматина (ChIP). В одной реакции иммунопреципитации использовали хроматин, выделенный из 3 × 10⁶ клеток S2 или из 50 имаго дрозофилы. “Сшивку” проводили, добавляя в реакционную среду формальдегид до концентрации 0.5% и инкубируя в течение 10 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 2.5 М глицина до концентрации 0.125 М (1/20 от общего объема). После отмывки тремя объемами холодного раствора 1× PBS, хроматин ресуспендировали в SDS-содержащем буфере (50 мМ HEPES KOH, pH 7.9, 140 мМ NaCl, 1 мМ EDТА, 1% тритона X-100, 0.1% дезоксихолата Na, 0.1% SDS, 1× PIC (protease inhibitors cocktail (“Roche”, Швейцария)) и дробили до фрагментов размером ~500 нуклеотидов с помощью ультразвука. Обработанный ультразвуком хроматин центрифугировали дважды при 16000 g в течение 20 мин, а затем использовали в экспериментах по иммунопреципитации. В один эксперимент брали около 10 мкг антител и 15 мкл протеин-А-сефарозы (“Sigma”). В реакцию добавляли также ДНК спермы лосося и бычий сывороточный альбумин до конечной концентрации 1 мг/мл. Осажденный хроматин последовательно отмывали SDS-содержащим буфером, SDS-содержащим буфером с 0.5 М NaCl, LiCl-содержащим буфером (20 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 1 мМ EDТА, 250 мМ LiCl, 0.5% NP-40, 0.5% дезоксихолат Na) и TE (20 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 1 мМ EDТА). Комплексы хроматина инкубировали в буфере для элюции (50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 1 мМ EDТА, 1% SDS) в течение 30 мин при комнатной температуре. В раствор добавляли 5 М NaCl (16 мкл на 500 мкл раствора) и инкубировали при 65°С в течение 16 ч в термошейкере для “расшивки” хроматина. Затем хроматин обрабатывали протеазой (3 мкл протеиназы К, 5 мкл 0.5 М EDТА на 500 мкл раствора) в течение 4 ч при 55°С в термошейкере. ДНК экстрагировали смесью фенол–хлороформ и осаждали изопропанолом. Преципитат растворяли в буфере TE. Выделенную ДНК анализировали с помощью количественной ПЦР. Результаты иммунопреципитации оценивали по соотношению (%) осажденной/исходной фракции. Каждое измерение выполняли как минимум в трех повторах и вычисляли среднее значение.

Статистический анализ. Сравнение экспериментальных групп проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Все данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (шкала ошибок), по крайней мере, по трем независимым экспериментам. Звездочки указывают на статистическую значимость: данных *P < 0.05 или **P < 0.01.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ влияния белков комплекса SAGA на привлечение DUB-модуля в промоторную область SAGA-зависимых генов

Поскольку полученные данные показывают, что DUB-модуль может существовать в клетке независимо от SAGA, мы исследовали необходимость комплекса SAGA для привлечения DUB-модуля на промоторы генов. Присутствие DUB-модуля на промоторе изучено методом иммунопреципитации хроматина. Анализировали влияние нокдауна субъединицы ATXN7 комплекса SAGA, через которую, как показано ранее, DUB-модуль взаимодействует с SAGA. Нокдаун ATXN7 должен был показать, влияет ли SAGA на привлечение DUB-модуля на промотор.

Хроматин выделяли из клеток S2, в которых при помощи РНК-интерференции был проведен нокдаун ATXN7. В качестве контроля использовали клетки S2, инкубированные с дцРНК, соответствующей фрагменту GFP. В реакциях иммунопреципитации хроматина использовали антитела к Sgf11, ENY2 и Gcn5, имеющиеся в нашей лаборатории. Поскольку ранее было показано, что SAGA и DUB-модуль присутствуют на промоторах как Pol II-, так и Pol III-зависимых генов, мы оценили присутствие факторов на промоторе гена hsp70 (Pol II-зависимый ген) при тепловом шоке и на мишенях Pol III, присутствие SAGA на которых показано ранее [18, 35].

Нокдаун ATXN7 привел к уменьшению связывания субъединиц DUB-модуля Sgf11 и ENY2 с промотором hsp70, но не повлиял на их привлечение на гены, транскрибируемые Pol III (рис. 2). В качестве контроля изучено влияние нокдауна ATXN7 на уровень основной ацетилтрансферазной каталитической субъединицы SAGA, Gcn5. Как и ожидалось, нокдаун ATXN7 не повлиял существенно на связывание с промоторами Gcn5, так как ATXN7 не участвует во взаимодействии SAGA с промотором. Эти данные показывают, что механизм привлечения DUB-модуля на некоторые промоторы может быть SAGA-независимым и отличается на промоторах Pol II- и Pol III-зависимых генов.

Рис. 2.

Анализ влияния нокдауна ATXN7 на привлечение DUB-модуля на промоторы SAGA-зависимых генов. а, б, в – Анализ влияния нокдауна ATXN7 на привлечение ENY2, Sgf11 и Gcn5 в промоторную область генов. Влияние нокдауна ATXN7 на привлечение обозначенных белков на промоторы: hsp70 при тепловом шоке, U6 96 Ac, tRNA Val 2-4, 5S rRNA изучено в реакциях иммунопреципитации хроматина (ChIP). Результаты представлены в процентах от исходной фракции.

Взаимодействие DUB-модуля с аппаратом транскрипции Pol III in vivo

Далее изучали роль DUB-модуля в регуляции транскрипции Pol III-зависимых генов. На первом этапе взаимодействие DUB-модуля и компонентов аппарата транскрипции Pol III изучали генетическими методами на уровне целого организма. Из компонентов DUB-модуля для генетического анализа наиболее удобен ENY2, поскольку он кодируется геном e(y)2, который расположен на Х-хромосоме, что позволяет исследовать его в гемизиготном состоянии у самцов. В нашем распоряжении была линия D. melanogaster с мутацией e(y)2[u1] – слабой гипоморфной мутацией, очень удобной для анализа, так как она обладает плейотропным эффектом, а ее фенотип подробно охарактеризован ранее [30, 36]. Одно из проявлений мутации e(y)2[u1] – фенотип “широко расставленные крылья”, наблюдается у ~5% гемизиготных самцов.

Линии дрозофилы с мутациями, затрагивающими компоненты аппарата транскрипции Pol III, получены из банка мутаций в Блумингтоне. Все эти мутации локализованы на аутосомах, летальны в гомозиготном состоянии, а их фенотипические проявления в гетерозиготном состоянии не описаны. Поэтому мы анализировали влияние этих мутаций на фенотипические проявления мутации e(y)2[u1]. С этой целью в результате скрещивания получили самцов, гемизиготных по мутации e(y)2[u1] и гетерозиготных по мутациям в генах компонентов аппарата транскрипции Pol III. Частота проявления (пенетрантность) мутантного фенотипа e(y)2[u1] у таких самцов значительно возрастала по сравнению с исходной линией e(y)2[u1] и с контрольным скрещиванием (рис. 3). Таким образом мы показали, что DUB-модуль и аппарат транскрипции Pol III взаимодействуют in vivo.

Рис. 3.

Взаимодействие DUB-модуля и аппарата транскрипции Pol III in vivo. Частота проявления фенотипа “широко расставленные крылья” у самцов с мутацией в гене, кодирующем ENY2 (обозначена как e(y)2;+), значительно возрастает на фоне мутаций в генах Brf1, Rpc2, Rpc31, Rpc37, Rpc53, Rpc82. Проанализировано не менее 200 самцов каждого генотипа.

Участие DUB-модуля в привлечении аппарата транскрипции Pol III на промоторы Pol III-зависимых генов мяРНК

Влияние DUB-модуля на экспрессию генов, транскрибируемых Pol III, изучали на линиях дрозофилы с мутациями по субъединицам DUB-модуля Sgf11 и Nonstop, полученным из банка мутаций. Поскольку эти мутации летальны в гомозиготном состоянии, мы использовали гетерозиготных особей Sgf11[e01308]/TM6B и not[02069]/TM6B, у которых уровень экспрессии генов Sgf11 и Nonstop был значительно ниже, чем у мух дикого типа [18]. В качестве контроля использовали особей TM6B/+.

Влияние DUB-модуля на Pol III-зависимые гены изучали с помощью реакции иммунопреципитации хроматина, полученного из дрозофил с мутацией Sgf11[e01308], антителами к Brf1.

Присутствие компонентов транскрипционного аппарата Pol III определено на трех типах Pol III-зависимых промоторов, описанных выше и представленных на рис. 4а. Оказалось, что наибольшее влияние мутации субъединиц модуля DUB оказывают на привлечение Brf1 в промоторную область TATA-box-содержащих Pol III-зависимых генов (рис. 4а, б). Мы предположили, что это происходит за счет влияния DUB-модуля на привлечение комплекса PBP, который, в свою очередь, необходим для привлечения TFIIIB. И на фоне нокдауна субъединиц DUB-модуля PBP-комплекс хуже взаимодействует с последовательностью PSE.

Рис. 4.

Анализ участия DUB-модуля в привлечении аппарата транскрипции Pol III на промоторы Pol III-зависимых генов мяРНК. а – Три типа промоторов Pol III-зависимых генов. На схеме указаны ДНК-элементы и белковые факторы. Стрелка показывает начало транскрипции и направление. ТТТТ – последовательность терминации транскрипции Pol III. Белки Brf1, Bdp1, TBP образуют комплекс TFIIIB. Позиции Brf1 и Bdp1 показаны согласно результатам ChIP-seq в клетках человека. Белок-белковые взаимодействия между TFIIIC, TFIIIA и TFIIIB также показаны на схеме [37]. б – Влияние снижения количества Sgf11 в мутантной линии Sgf11[e01308]/TM6B на привлечение Brf1 в промоторную область Pol III-зависимых генов. в – Влияние снижения количества Nonstop в мутантной линии not[02069]/TM6B на привлечение Pbp45 в промоторную область Pol III-зависимых генов мяРНК. Результаты получены методом иммунопреципитации хроматина (ChIP) и представлены в процентах относительно исходной фракции. В качестве контроля использовали мух с генотипом TM6B/+.

Для подтверждения этой гипотезы изучено влияние мутации Nonstop (деубиквитиназы DUB-модуля) на привлечение в промоторную область мяРНК белка Pbp45, субъединицы комплекса PBP. Из дрозофил с мутацией not[0206] был экстрагирован хроматин и проведены реакции иммунопреципитации хроматина с использованием антител к белку Pbp45 (рис. 4в). Оказалось, что мутация Nonstop вызывает более чем двукратное уменьшение присутствия Pbp45 на промоторе.

Таким образом, нокдаун субъединиц DUB-модуля приводит к уменьшению связывания PBP-комплекса с последовательностью PSE и менее эффективному привлечению фактора TFIIIB на промоторы TATA-box-содержащих Pol III-зависимых генов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей работе мы очистили деубиквитинирующий (DUB) модуль SAGA из экстракта ядер эмбрионов дрозофилы и проанализировали его возможное участие в транскрипции независимо от остальных компонентов комплекса SAGA. Модульная структура комплекса SAGA установлена давно, однако способность отдельных модулей SAGA действовать независимо от других не исследована.

Ранее было показано, что белок ATXN7 в составе DUB-модуля необходим для его взаимодействия с остальным комплексом SAGA [14, 15]. Нокдаун ATXN7 должен был привести к отделению остального SAGA от DUB-модуля и нарушить таким образом привлечение DUB-модуля на SAGA-зависимые гены. Однако при нокдауне ATXN7 привлечение Sgf11 и ENY2, компонентов DUB-модуля, уменьшалось только на промоторе Pol II-зависимого гена hsp70 при тепловом шоке. Количество Sgf11 и ENY2 на Pol III-зависимых промоторах не менялось. Таким образом, мы показали, что структура комплекса SAGA на промоторах Pol II- и Pol III-зависимых генов может отличаться или привлечение модулей происходит по-разному.

Для привлечения Pol III на гены-мишени необходим фактор TFIIIB. Как показано ранее, мутации и компонентов DUB-модуля, и HAT-модуля приводят к уменьшению привлечения Brf1, одного из основных белков TFIIIB, на промоторы генов мяРНК [18]. Поскольку в нашей работе показано, что DUB-модуль может существовать независимо, и его привлечение на Pol III-зависимые промоторы происходит независимо от других модулей SAGA, далее мы изучили участие DUB-модуля в транскрипции Pol III-зависимых генов. Это исследование выполнено in vivo на уровне целого организма. Анализ взаимного влияния мутаций показал, что ENY2, субъединица DUB-модуля, взаимодействует не только с Brf1, но также с субъединицами Pol III.

Фактор TFIIIB, необходимый для транскрипции Pol III, состоит из трех белков (BDP1, TBP и BRF1 или BRF2). Состав этого фактора у человека и дрозофилы несколько отличается. У человека в состав TFIIIB, участвующего в транскрипции генов с внутренними промоторами (типы I и II), входит BRF2, а BRF1 присутствует на промоторах типа III [20, 21]. У дрозофилы один и тот же белок Brf1 входит в TFIIIB на промоторах всех трех типов. Мы оценили влияние нокдауна Sgf11 на привлечение Brf1 на все типы промоторов Pol III-зависимых генов дрозофилы. Влияние Sgf11 на привлечение Brf1 оказалось значительным только на промоторах типа III, включающих TATA-box и последовательность PSE. Мы предположили, что DUB-модуль необходим для привлечения на последовательность PSE PBP-комплекса, который отвечает за привлечение TFIIIB на промоторы генов мяРНК. Для проверки этой гипотезы мы исследовали как привлекается Pbp45, компонент PBP-комплекса, на PSE при нокдауне деубиквитиназы DUB-модуля Nonstop. При нокдауне Nonstop количество Pbp45 на промоторах типа III уменьшалось более чем в 2 раза. Мы предполагаем, что столь значительное влияние на привлечение PBP связано с убиквитинированием нуклеосомы, находящейся между PSE и DSE, выполняющим энхансерную функцию. Эта нуклеосома физически сближает PSE и DSE и дает возможность стабилизировать привлечение PBP-комплекса, необходимого для привлечения TFIIIB [25–28]. Ранее мы показали, что DUB-модуль участвует в активации транскрипции Pol III-зависимых генов типа III [18]. В совокупности полученные данные указывают на то, что основным комплексом, осуществляющим деубиквитинирование в этом процессе, может быть DUB-модуль комплекса SAGA.

Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП ИБГ РАН. Авторы благодарны Зиганшину Р.Х. за проведение MALDI-TOF MS-анализа, выполненного на оборудовании Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (№ 18-04-00514 А, Д.К., Е.Н., А.Г) и Российского научного фонда (№ 20-14-00269, Ю.Н., Ю.В.).

Все применимые международные, национальные и институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.