Молекулярная биология, 2021, T. 55, № 6, стр. 1030-1044

Анализ структуры комплексов

По результатам моделирования РНК/РНК-дуплексов структура А-формы двойной спирали сохраняется вдоль всей траектории длиной 100 нс для каждого из 75 проанализированных комплексов. Отклонение геометрии спирали от исходной неуравновешенной структуры при моделировании не превышает 2.5 Å ‒ величины среднеквадратичного отклонения (СКО) между атомами. Комплексы после уравновешивания в течение 10 нс незначительно изменяли конформацию в течение последующих 90 нс моделирования. Среднее значение СКО вдоль МД-траектории для всего набора комплексов составило 1.56 Å и не превышало 2.56 Å для каждого снимка траектории. В 11 из 74 исследуемых дуплексов наблюдалось расплетание концевых пар нуклеотидов. В ряде случаев для дуплексов с концевыми A/U- или A/T-парами происходило обратимое разрушение второй пары оснований, при этом концевой аденин и предконцевой нуклеотид этой же цепи сохраняли конформацию, близкую к таковой в двойной спирали.

При моделировании ДНК/РНК-дуплексов отклонение от стартовой структуры не превышало 4.1 Å. В 17 из 64 исследуемых структур наблюдали расплетание концевых пар, аналогично случаю бимолекулярных РНК/РНК-комплексов. Среднее значение СКО вдоль МД-траектории для всего набора комплексов составило 2.26 Å и не превышало 3.86 Å для каждого снимка траектории.

Структуры ДНК/РНК- и РНК/РНК-дуплексов несколько отличались. Анализ РНК/РНК-комплексов с помощью программного обеспечения X3DNA [42, 43] выявил, что такие комплексы имеют А-форму двойной спирали. Структуру ДНК/РНК-дуплексов можно охарактеризовать как промежуточную между А- и В-формами. Такое различие конформаций известно и показано экспериментальными методами: ЯМР-спектроскопией [44], рентгеноструктурным анализом [45] и спектроскопией кругового дихроизма [44, 46, 47]. В связи с особенностями структуры гомонуклеотидных последовательностей в ДНК/РНК- и РНК/РНК-дуплексах [48, 49] мы исключили их из рассмотрения.

При МД-анализе одноцепочечных олигонуклеотидов обнаружены значительные конформационные перестройки как в ДНК-, так и в РНК-цепях. В большинстве случаев наблюдали локальное разрушение одноцепочечного стэкинга между прилегающими основаниями, а в некоторых случаях формирование внутримолекулярных шпилечных структур, которые могут быть достаточно устойчивыми на длине траектории в 100 нс. Это приводит к существенно бóльшим значениям СКО ‒ как усредненным вдоль траектории (5.3 Å для РНК- и 5.7 Å для ДНК-цепи ‒ в среднем для всех исследованных олигонуклеотидов), так и их максимальным отклонениям от начальных структур (8.0 и 9.5 Å для РНК- и ДНК-цепей соответственно). Такое поведение одноцепочечных форм типично для НК, что следует из опубликованных экспериментальных данных [50, 51] и результатов компьютерного моделирования [52–54].

Энергия формирования РНК/РНК-комплексов

Энергию формирования комплексов НК определяли как разницу энергий двухцепочечного и одноцепочечного состояний. С использованием данных МД-моделирования рассчитывали изменение внутренней энергии комплексообразования, используя методы MMPBSA и MMGBSA. Для расчета вклада конфигурационной энтропии применяли методы NMA и Q-Harm. Определение вклада одноцепочечных состояний проводили, используя анализ МД-траекторий двух отдельных олигонуклеотидов (трехтраекторный подход, 3tr). Альтернативно из МД-траектории НК-дуплексов вычленяли отдельные олигонуклеотиды и использовали полученный набор конформаций для расчетов (однотраекторный подход, 1tr). Расчет энергии Гиббса комплексообразования проводили, используя все возможные комбинации полученных значений энтальпии и энтропии формирования комплексов в рамках одно- или трехтраекторного подхода.

Сопоставление экспериментально определенных величин термодинамических параметров и значений, полученных с использованием одно- и трехтраекторных подходов для РНК/РНК-комплексов, приведено на рис. 1 и в табл. 1. Наилучшая корреляция экспериментальных и расчетных значений энтальпии комплексообразования была при использовании метода MMGBSA и трехтраекторного подхода. Коэффициент корреляции R² (где R ‒ коэффициент корреляции Пирсона) между экспериментальными и рассчитанными величинами составлял 0.72; при этом угловой коэффициент линейной зависимости был близок к единице (0.95), а коэффициент сдвига составлял всего 4.6 ккал/моль. При использовании данной зависимости для расчета энтальпии комплексообразования средняя абсолютная величина ошибки ее предсказания составила 8.1 ккал/моль, или 16.3%. При использовании метода MMPBSA корреляция экспериментальных и расчетных величин была гораздо хуже, чем для MMGBSA ‒ средняя абсолютная ошибка была гораздо выше в случае однотраекторного подхода и существенно ниже при трехтраекторном рассмотрении (табл. 1).

Рис. 1.

Корреляционный анализ значений термодинамических параметров, определенных экспериментально и рассчитанных на основании МД-анализа, для РНК/РНК-дуплексов. а ‒ Значения энтальпии (ΔH⁰) рассчитаны методами MMGBSA с использованием анализа одной (1tr) и трех (3tr) траекторий. б ‒ Значения энергии Гиббса при 37°С ($\Delta G_{{37}}^{^\circ }$) определены экспериментально и на основании анализа одной МД-траектории комбинацией методов MMGBSA и NMA или Q-Harm. Порядок расположения уравнений соответствует порядку подписей на рисунках.

Введение линейной эмпирической поправки к рассчитанным величинам энтальпии комплексообразования, полученной из корреляции расчетных и экспериментальных значений (ΔH°(эксп) = = a · ΔH⁰(МД) + b), приводит к тому, что величина абсолютной ошибки снижается до уровня 3.7 ккал/моль, а относительной – до 8.1% при расчетах методом MMGBSA (3tr), что ниже типичной экспериментальной точности определения энтальпии комплексообразования (10%) [37].

Величину энтропии формирования комплекса рассчитывали методами Q-Harm и NMA при анализе одной или трех независимых траекторий. Сопоставление рассчитанных и экспериментальных значений показывает, что наилучшая корреляция (R² = 0.67) наблюдается при использовании квазигармонического приближения при анализе одной траектории (табл. 1). Среднее значение величины относительной ошибки расчета энтропии в этом случае составляет 83.4 кал ∙ моль^‒1 ∙ К^‒1, или 54%. Это в процентном отношении значимо хуже, чем при оптимальном методе расчета энтальпии методом MMPGSA с использованием трехтраекторного анализа. При трехтраекторном анализе ошибки расчета энтропии комплексообразования в 1.2‒2.5 раз ниже, хотя наблюдаемые корреляции существенно хуже. Необходимо отметить, что в линейных зависимостях коэффициент пропорциональности между расчетными и экспериментальными величинами энтропий лежит в диапазоне 1.13–2.40, а свободный член линейной зависимости в диапазоне ‒34.99…+16.48 кал ∙ моль^‒1 ∙ К^‒1. Это показывает, что конфигурационная энтропия в значительной степени коррелирует с энтропией комплексообразования, но не вносит в нее определяющий вклад. Использование линейной поправки для приближения расчетных величин энтропии комплексообразования к экспериментальным данным дает значимое снижение ошибки расчета до 8.7% при использовании квазигармонического приближения в рамках однотраекторного подхода (табл. 1). Менее достоверная предсказательная способность энтропии при трехтраекторном подходе, скорее всего, связана с неполным покрытием конфигурационного пространства одноцепочечных олигомеров при данной длине траектории в рамках метода классической МД. Кроме того, наблюдаемое значимое различие в энтропии также зависит от ионной силы раствора, которая при моделировании отличается от стандартных условий (1 М NaCl, нейтральные значения pH), в которых были проведены экспериментальные исследования. В одном из классических представлений влияние концентрации одновалентных ионов на термостабильность межмолекулярных НК-комплексов может быть представлено в виде энтропийной поправки, пропорциональной логарифму концентрации катионов в растворе и числу отрицательно заряженных фосфатных остатков в НК-цепи [37, 55, 56]. Такая зависимость соответствует наблюдаемому тренду ‒ линейной зависимости экспериментальных и расчетных значений энтропии формирования дуплексов. Однако в полной мере учесть этот вклад в термостабильность НК-дуплексов в рамках применения метода классической МД не представляется возможным.

Величину свободной энергии Гиббса наиболее часто используют на практике при сопоставлении гибридизационных свойств олигонуклеотидов [55, 56]. Этот параметр определяет величину константы равновесия в соответствии с уравнением Вант-Гоффа и, следовательно, соотношение концентраций одно- и двухцепочечного состояния олигонуклеотидов в растворе при различных температурах. При расчете энергии Гиббса формирования дуплексов при одно- и трехтраекторном подходах рассмотрена прогностическая способность комбинаций методов расчета энтропии и энтальпии. Результаты анализа корреляций расчетных и экспериментальных значений приведены на рис. 1 и в табл. 1. Наилучшая корреляция с R² = 0.85 наблюдается при использовании однотраекторного анализа методами MMGВSA и Q‑Harm при оценке соответственно энтальпии и энтропии комплексообразования. Наблюдается значительный наклон (a = 0.29) и ненулевой коэффициент сдвига составлял (b = ‒4.0 ккал/моль) данной линейной зависимости (рис. 1б). Это приводит к большим значениям величины абсолютной ошибки. Как видно из данных для прогноза энтальпии и энтропии комплексообразования (табл. 1), оба этих компонента вносят вклад в отличный от единицы наклон корреляции расчетных и экспериментальных значений изменения свободной энергии Гиббса и в пересечение с осью абсцисс не в нулевой точке. Учет линейной корреляции существенно снижает ошибку ‒ до 0.68 ккал/моль, или 8.63%, ‒ что фактически совпадает со средней экспериментальной ошибкой для НК-дуплексов (~7%) [37].

Проведенный анализ показывает достаточно близкие экспериментальные и расчетные значения (без учета линейных поправок) энергии комплексообразования только для изменения энтальпии, рассчитанного методом MMGBSA в рамках трехтраекторного анализа. Сопоставимые значения ошибок дает модель ближайших соседей [37]. Мы сравнили опубликованные ранее инкременты формирования динуклеотидных шагов спирали и инкременты, рассчитанные на основании собранной нами экспериментальной базы данных и соответствующих величин, полученных с помощью компьютерного анализа (рис. 2).

Рис. 2.

Корреляционный анализ значений термодинамических параметров, определенных экспериментально и рассчитанных на основании МД-анализа, для РНК/РНК-дуплексов. а ‒ Прогностическая эффективность метода ближайших соседей (БС; 5'-NN/NN-3') для расчета энтальпии образования РНК/РНК-дуплексов, определенной экспериментально (Эксп.) и с использованием метода MMGBSA при анализе трех траекторий (MMGBSA, 3tr). б ‒ Сопоставление инкрементов модели ближайших соседей для РНК/РНК-комплексов, опубликованных ранее Xia и соавт. [37], определенных на основании экспериментальных данных (Эксп.) и рассчитанных с использованием метода MMPBSA при анализе трех траекторий (MMGBSA, 3tr). Порядок расположения уравнений соответствует порядку подписей на рисунках. Иниц. ‒ фактор инициации формирования двойной спирали.

Модель ближайших соседей одинаково хорошо описывает экспериментальные данные и величины, рассчитанные методом MMPBSA с использованием трех траекторий (рис. 2а). Все инкременты значимы (р-value < 4 × 10^‒6), за исключением инкремента фактора инициации для экспериментальных данных (р-value = 0.14).

Представленные в литературе и определенные нами на основании экспериментальных и расчетных данных величины формирования динуклеотидных пар близки между собой и одинаковы в рамках погрешностей, за исключением инкрементов для GA/UC и GC/CG, полученных из компьютерных расчетов методом MMPBSA (рис. 2б). В этом случае разница с экспериментально определенными величинами для исследованной базы данных составляет 4.3 и 3.8 ккал/моль соответственно. Наиболее значимое различие наблюдается для фактора инициации (рис. 2б, инкремент “Иниц.”), величина которого составляет ‒9.9 ккал/моль при анализе МД-траекторий и +5.9 ккал/моль при анализе этой же базы данных экспериментальных значений, что, вероятно, связано с низкой значимостью инкремента, определенного на основании экспериментальных данных. Аналогично более отрицательной оказывается поправка, связанная с существованием концевой A/U-пары: +5.4 против +9.4 ккал/моль соответственно. Это может быть связано с не вполне корректным учетом взаимодействия концевых пар оснований, в том числе недостаточно длинной МД-траекторией, чтобы учесть эффект открывания концевых пар с высокой достоверностью. Вместе с тем совокупность полученных данных указывает на адекватность использованного подхода, включающего моделирование методом МД (силовое поле, способ моделирования) и расчет энергии методом MMPBSA для учета взаимодействий внутри дуплексной структуры РНК.

Энергия формирования ДНК/РНК-комплексов

В случае гибридных ДНК/РНК-дуплексов выявлена линейная корреляция расчетных и экспериментальных величин энтальпии комплексообразования (рис. 3, табл. 2). Корреляцию по изменениям энтальпии наблюдали только при анализе одной траектории методом MMGBSA (R² = 0.71). Наклон корреляционной прямой зависимости близок к единице (а = 0.841), а свободный член близок к нулю (b = ‒0.982 ккал/моль). Для этого способа расчета энтальпии относительная ошибка составляла 23%, а абсолютная – 12.0 ккал/моль. Во всех остальных случаях коэффициент корреляции R² не превышал значения 0.64. Вместе с тем при трехтраекторном анализе методом MMPBSA значение ошибки расчета оказалось минимальным (16% и 11.4 ккал/моль) при отсутствии корреляции (R² = 0.13), как и в случае РНК/РНК-комплексов (табл. 1 и 2).

Рис. 3.

Корреляционный анализ значений термодинамических параметров, определенных экспериментально и рассчитанных на основании МД-анализа, для ДНК/РНК-дуплексов. а ‒ Значения энтальпии (ΔH°) рассчитаны методами MMGBSA с использованием анализа одной и трех траекторий. б ‒ Значения энергии Гиббса при 37°С (ΔG°₃₇) определены экспериментально и на основании анализа одной МД-траектории комбинацией методов MMGBSA и NMA или Q-Harm. Порядок расположения уравнений соответствует порядку подписей на рисунках.

Введение линейной поправки приводит к снижению ошибки до уровня 8.2% (5.1 ккал/моль) в случае метода MMGBSA при анализе траектории только ДНК/РНК-дуплексов, близкой к таковой для РНК/РНК-комплексов.

Значения энтропии формирования ДНК/РНК-комплексов, рассчитанные методом NMA при анализе одной траектории, дают наилучшую корреляцию с экспериментальными величинами (R² = = 0.74), при этом среднее значение абсолютной ошибки составляет 47.5 кал ∙ моль^‒1 ∙ К^‒1, или 29% (табл. 2). В случае использования квазигармонического приближения в однотраекторном анализе величина коэффициента корреляции оказалась меньше, R² = 0.55, а среднее значение абсолютной ошибки составляло 78.2 кал ∙ моль^‒1 ∙ К^‒1, или 49%. Коэффициент пропорциональности между расчетными и экспериментальными значениями энтропии ДНК/РНК-комплексов лежит в диапазоне 1.3–1.8, а свободный член линейной зависимости ‒ в диапазоне ‒3.0…+41 кал ∙ моль^‒1 ∙ К^‒1, что указывает на существенные различия значений энтропии формирования комплекса, определенных экспериментально и рассчитанных значений конфигурационной энтропиии. Коэффициент корреляции и наклон близки к таковым в случае РНК/РНК-комплексов (табл. 1 и 2), что указывает на общую природу наблюдаемых закономерностей для разных типов комплексов.

Величины энергии Гиббса формирования гибридных комплексов, рассчитанные на основании метода MMGBSA и конфигурационных энтропий, в высокой степени коррелируют с экспериментальными значениями для ДНК/РНК-дуплексов (рис. 3). Коэффициенты корреляции, R², составляют 0.82 и 0.78 при расчете энтропии методами Q-Harm и NMA соответственно. В остальных случаях значимой корреляции не наблюдается (R² < 0.06).

Проведенный анализ применимости модели ближайших соседей для описания величин энтальпии комплексообразования выявил высокую прогностическую эффективность такой модели в применении к данным, полученным экспериментально и методом MMPBSA при анализе одной траектории (рис. 4а). Инкременты модели ближайших соседей, описывающие фактор инициации формирования комплексов, не были статистически значимыми ‒ для экспериментальных и расчетных наборов данных p-value равнялись 0.11 и 0.69 соответственно. При анализе экспериментальной базы данных низкозначимыми оказываются динуклеотидные пары CU/AG и UU/AA. Для величин энтальпий, рассчитанных при однотраекторном анализе методом MMGBSA, все инкременты, кроме фактора инициации, были статистически значимыми (p-value < 4 × 10^‒5). Опубликованные ранее и определенные нами величины инкрементов для экспериментальных данных существенно различались для фактора инициации и динуклеотидных пар, у которых в РНК-цепи с 5′-конца находится цитозин (rСХ/dX'G, где Х = A, C, U или G) или гуанин (rGХ/dX'C), за исключением динуклеотидной пары rGU/dAC (рис. 4б). Определенные нами инкременты rСХ/dX'G имеют амплитуды ниже, а rGХ/dX'C – выше, чем представленные в литературе. Также более низкий вклад в стабильность двойной спирали имеют инкременты UG и UU. Сопоставление инкрементов при анализе собранной нами базы данных показывает, что величины инкрементов rСХ/dX'G, rGG/dCC и rGU/dAC экспериментальных энтальпий комплексообразования существенно ниже таковых при их определении методом MMGBSA из анализа одной МД-траектории. Это может быть связано с несогласованностью силовых полей для ДНК и РНК при моделировании гибридных комплексов, которые были оптимизированы для ДНК/ДНК- и РНК/РНК-дуплексов. Кроме того, относительно малая выборка и низкое разнообразие длин и нуклеотидных композиций модельных комплексов приводит к достаточно высокому значению ошибок для отдельных инкрементов модели ближайших соседей (рис. 4б). Расширение выборки в перспективе позволит получить более надежные результаты.

Рис. 4.

Корреляционный анализ значений термодинамических параметров, определенных экспериментально и рассчитанных на основании МД-анализа, для ДНК/РНК-дуплексов. а ‒ Прогностическая эффективность метода ближайших соседей (БС) для расчета энтальпии образования ДНК/РНК-дуплексов, определенной экспериментально (Эксп.) и с использованием метода MMGBSA при анализе трех траекторий (MMGBSA, 1tr). б ‒ Сопоставление инкрементов модели ближайших соседей для ДНК/РНК-комплексов, опубликованных ранее Sugimoto и соавт. [7], определенных на основании экспериментальных данных (Эксп.) и с использованием метода MMPBSA при анализе одной траектории (MMGBSA, 1tr). Порядок расположения уравнений соответсвует порядку подписей на рисунках.

Отрицательные значения факторов инициации и концевых пар, полученные при МД-анализе данных с помощью модели ближайших соседей, превышают таковые для данных из экспериментального анализа для комплексов ДНК/ДНК [30], РНК/РНК и ДНК/РНК. Это указывает на систематическую разницу при моделировании методом МД или расчетах методом MMGBSA. Методом ЯМР показано, что концевые пары оснований находятся в постоянном равновесии между открытым и закрытым состояниями [57], к тому же открытие концевых пар наблюдается не для всех комплексов. Такие события не относятся к многократно повторяющимся в рамках рассматриваемой траектории для каждого моделируемого комплекса, что не позволяет провести достоверный учет вкладов от концевых пар оснований при расчете термодинамических параметров. Несмотря на это, метод MMGBSA дает наилучшую корреляцию экспериментальных и расчетных величин для всех трех типов комплексов.

В результате проведенного нами исследования продемонстрирована возможность расчета термодинамических параметров образования НК-комплексов с использованием подходов, основанных на методе классической МД. При анализе наборов дуплексов РНК/РНК, ДНК/РНК и ДНК/ДНК [30] выявлено, что энтальпия формирования комплексов, рассчитанная методом MMGBSA при анализе МД-траектории только комплекса, в среднем обладает наилучшей корреляцией расчетных и экспериментальных величин для каждого типа комплексов (R² > 0.73). Ошибка расчета энтальпии формирования комплексов (15‒30%) значительно выше типичной экспериментальной величины (~10%). Высокая корреляция также наблюдается при расчете энтропии в рамках квазигармонического приближения однотраекторного анализа. Однако в этом случае наклон и свободный член линейной зависимости существенно отличались соответственно от единицы и нуля. Как видно из графиков, представленных на рис. 5, по анализу корреляций для экспериментальных и рассчитанных значений энтальпии комплексообразования дуплексов ДНК/ДНК [30], РНК/РНК и ДНК/РНК углы наклона и свободные члены всех линейных уравнений для этих трех пар близки. Мы объединили все полученные в ходе работы данные для определения общей универсальной зависимости, использование которой позволит пересчитывать значения, рассчитанные методом MMGBSA в однотраекторном приближении. Такая линейная функция имеет следующий вид: ΔH°(эксп.) = 0.727 ∙ ΔH°(MMBBSA, 1tr) ‒ 5.32.

Рис. 5.

Корреляционный анализ значений энтальпии (а) и свободной энергии Гиббса (б), определенных экспериментально и рассчитанных методом MMGBSA с использованием одной траектории, для разных типов комплексов. Данные по ДНК/ДНК-комплексам взяты из работы Lomzov и др. [30]. Порядок расположения уравнений соответствует порядку подписей на рисунках.

Использование данной линейной коррекции позволяет значительно снизить относительную ошибку расчета энтальпии комплексообразования до 9.3 (7.8), 12.8 (9.9) и 7.5% (6.3%) соответственно для РНК/РНК, ДНК/РНК и ДНК/ДНК (в скобках указана дисперсия для приведенных величин). В среднем для всех типов комплексов ошибка расчета составляла 8.6%, что ниже типичного значения экспериментальной ошибки (10%).

Значительно более высокий уровень корреляции наблюдается между величиной энергии комплексообразования, рассчитанной методом MMGBSA в однотраекторном приближении, и экспериментальной величиной свободной энергии Гиббса при одновременном рассмотрении всех типов комплексов (R² = 0.897). Однако при более углубленном анализе выявлено, что для каждого из рассмотренных типов комплексов встречаются существенно различающиеся между собой линейные зависимости, а наибольшее значение R² найдено для выборки из 304 ДНК/ДНК-комплексов. Различия в коэффициентах линейной зависимости связаны, в том числе, с энтропией, вклад которой различен для разных типов комплексов ‒ как по конфигурационной, так и сольватационной составляющей, учитывающей взаимодействие с ионами. Эта гипотеза подтверждается различными линейными зависимостями для экспериментально определенной свободной энергии Гиббса и для рассчитанной на основании энтальпии, полученной методом MMGBSA (1tr), и энтропии в квазигармоническом приближении (табл. 1 и 2). Таким образом, приведенные на рис. 5б линейные зависимости могут быть применены для расчета свободной энергии Гиббса на основании значений энергии комплексообразования, рассчитанных методом MMGBSA в однотраекторном приближении, только в рамках конкретного типа комплексов. Величины ошибки таких расчетов с учетом поправок в виде линейных функций со своими коэффициентами для каждого типа комплексов дают $\Delta G_{{34}}^{^\circ }$ 9.9 (6.7), 10.3 (9.0) и 8.0% (6.9%) соответственно для РНК/РНК, ДНК/РНК и ДНК/ДНК (в скобках указана дисперсия для приведенных величин).

Использование величин изменения внутренней энергии, рассчитанной методом MMGBSA, и конфигурационной энтропии в квазигармоническом приближении для расчета энергии Гиббса формирования дуплекса дает результаты, которые с высоким коэффициентом корреляции линейно связаны с экспериментально определяемыми значениями. Такая зависимость наблюдается для наборов РНК/РНК, ДНК/РНК и ДНК/ДНК различной длины и GC-состава. Вместе с тем высокая дисперсия ошибки расчета указывает на то, что необходимо либо использовать методы более полного покрытия конформационного пространства (sampling-методы), либо проводить анализ для большого числа комплексов различной длины и нуклеотидного состава ‒ с целью достоверного сопоставления рассчитанных данных для разных типов комплексов.

Использование методов компьютерного моделирования с более полным покрытием конформационного пространства при анализе траекторий позволяет определять величину свободной энергии Гиббса. В опубликованных ранее работах показана принципиальная возможность достижения экспериментальной точности (~1 ккал/моль). Применяя метод зонтичной выборки (umbrella sampling) при использовании в качестве координаты расстояния между концами шпилечной структуры РНК, а также метод анализа взвешенных гистограмм (WHAM), L. Smith и др. [58] получили высокую согласованность экспериментальных и расчетных величин свободной энергии. Главный недостаток такого подхода заключается в необходимости получения чрезвычайно длительной МД-траектории ‒ около 200 мкс. Более экономичной может быть комбинация методов алхимических превращений и обмена репликами. В этом случае установлено, что при замене одного основания на другое, того же класса (пуринового или пиримидинового), в РНК-дуплексе размером 6 п.о. точность расчета энергии, связанной с однонуклеотидной заменой, составляет 0.55 ккал/моль [22]; при этом продолжительность МД-траектории небольшая ‒ порядка 1 мкс, что на порядок больше, чем в предлагаемом нами подходе.

Методы МД применяют не только для анализа структуры и гибридизационных свойств нативных олигонуклеотидов, но и для их аналогов и производных ‒ с целью установления их возможной пространственной структуры, влияния модификаций на термостабильность комплексов с НК и причин наблюдаемых физико-химических и молекулярно-биологических эффектов. Для расчета энергии формирования модифицированных комплексов рассматривали замкнутые НК (LNA) [59], пептидил-НК (PNA) [35], 2′-O-Me-производные РНК [34], глицин-морфолиновые аналоги [32] и фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды [33]. Применяли различные подходы, среди которых наиболее распространен использованный и нами метод MMPB(GB)SA. В большинстве случаев показана корреляция рассчитанных энергий с экспериментальными характеристиками термостабильности: энтальпией, свободной энергией Гиббса комплексообразования или температурой плавления. Однако количественного согласования расчетных значений энергий с наблюдаемыми экспериментально при использовании большинства подходов не наблюдается. Это дополнительно усугубляется тем, что обычно анализируют небольшое число комплексов близкой длины и/или GC-состава. В совокупности полученные данные свидетельствует о невозможности количественного сопоставления энергии Гиббса формирования разных типов комплексов, например олигонуклеотидов с измененной химической структурой, при использовании методов классической МД и методов MMPB(GB)SA для расчета энтальпии и Q-Harm или NMA для расчета энтропии комплексообразования. Проведенные нами исследования показывают возможность количественного сопоставления энтальпии формирования РНК/РНК-, ДНК/РНК- и ДНК/ДНК-комплексов. Справедливо ли это утверждение для производных НК, можно будет понять по результатам анализа набора их комплексов, различной длины и GC-состава, с применением предложенного нами подхода.