Молекулярная биология, 2022, T. 56, № 1, стр. 157-167

Изучение множественного ферментативного встраивания модифицированных нуклеотидов пуриновой и пиримидиновой природы в растущую цепь ДНК

С. А. Лапа a*, О. С. Волкова a, В. Е. Кузнецова a, А. С. Заседателев a, А. В. Чудинов a

a Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
119991 Москва, Россия

* E-mail: lapa@biochip.ru

Поступила в редакцию 27.04.2021
После доработки 27.04.2021
Принята к публикации 21.05.2021

Аннотация

Изучены субстратные свойства модифицированных по азотистому основанию производных пуриновых и пиримидиновых дезоксинуклеозидтрифосфатов при их одновременном попарном встраивании в растущую цепь ДНК. Модифицированные нуклеотиды вводили с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и реакции удлинения праймера; в одной реакции использовали производные как с различными, так и с аналогичными функциональными заместителями. В качестве матриц применяли геномную бактериальную ДНК, специальным образом сконструированные синтетические фрагменты ДНК, а также библиотеки для SELEX. Реакции проводили с помощью ДНК-полимераз, не имеющих 3'-5'-корректирующей экзонуклеазной активности: Taq, Vent (exo-), DeepVent (exo-) и KOD XL. Показано, что на субстратную эффективность дезоксинуклеозидтрифосфата влияет как размер группы-заместителя, так и его химическая природа. Субстратная эффективность значительно зависит также от используемой полимеразы. Наиболее эффективными субстратами оказались пиримидиновые дезоксинуклеозидтрифосфаты в сочетании с ДНК-полимеразой Vent (exo-). Получены ДНК, модифицированные парами разноименных нуклеотидов (dU + dC, dU + dA, dC + dA) с аналогичными и различными функциональными заместителями.

Ключевые слова: модифицированные дезоксинуклеозидтрифосфаты, модифицированные нуклеотиды, множественное ферментативное встраивание, модифицированные аптамеры

Список литературы

  1. Gold L., Ayers D., Bertino J., Bock C., Bock A., Brody E.N., Carter J., Dalby A.B., Eaton B.E., Fitzwater T., Flather D., Forbes A., Foreman T., Fowler C., Gawande B., Goss M., Gunn M., Gupta S., Halladay D., Heil J., Heilig J., Hicke B., Husar G., Janjic N., Jarvis T., Jennings S., Katilius E., Keeney T.R., Kim N., Koch T.H., Kraemer S., Kroiss L., Le N., Levine D., Lindsey W., Lollo B., Mayfield W., Mehan M., Mehler R., Nelson S.K., Nelson M., Nieuwlandt D., Nikrad M., Ochsner U., Ostroff R.M., Otis M., Parker T., Pietrasiewicz S., Resnicow D.I., Rohloff J., Sanders G., Sattin S., Schneider D., Singer B., Stanton M., Sterkel A., Stewart A., Stratford S., Vaught J.D., Vrkljan M., Walker J.J., Watrobka M., Waugh S., Weiss A., Wilcox S.K., Wolfson A., Wolk S.K., Zhang C., Zichi D. (2010) Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5, e15004.

  2. Hollenstein M. (2012) Nucleoside triphosphates-building blocks for the modification of nucleic acids. Molecules. 17, 13569–13591.

  3. Lapa S.A., Chudinov A.V., Timofeev E.N. (2016) The toolbox for modified aptamers. Mol. Biotechnol. 58, 79–92.

  4. Sandin P., Stengel G., Ljungdahl T., Borjesson K., Macao B., Wilhelmsson L.M. (2009) Highly efficient incorporation of the fluorescent nucleotide analogs tC and tCO by Klenow fragment. Nucl. Acids Res. 37, 3924–3933.

  5. Kielkowski P., Cahova H., Pohl R., Hocek M. (2016) Flexible double-headed cytosine-linked 2'-deoxycytidine nucleotides. Synthesis, polymerase incorporation to DNA and interaction with DNA methyltransferases. Bioorg. Med. Chem. 24, 1268–1276.

  6. Gawande B.N., Rohloff J.C., Carter J.D., von Carlowitz I., Zhang C., Schneider D.J., Janjic N. (2017) Selection of DNA aptamers with two modified bases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 114, 2898–2903.

  7. Лапа С.А., Ромашова К.С., Спицын М.А., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Гусейнов Т.О., Заседателева О.А., Радько С.П., Тимофеев Э.Н., Лисица А.В., Чудинов А.В. (2018) Получение модифицированных комбинаторных ДНК-библиотек методом ПЦР в обратной эмульсии с последующим разделением цепей. Молекуляр. биология. 52, 984–996.

  8. Чудинов А.В., Шершов В.Е., Павлов А.С., Волкова О.С., Кузнецова В.Е., Заседателев А.С., Лапа С.А. (2020) Одновременное встраивание модифицированных производных dU и dC в растущую цепь ДНК в реакции удлинения праймера и ПЦР. Биоорган. химия. 46, 546–549.

  9. Ramakers C., Ruijter J.M., Deprez R.H., Moorman A.F. (2003) Assumption-free analysis of quantitative realtime polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci. Lett. 339, 62–66.

  10. Peirson S.N., Butler J.N., Foster R.G. (2003) Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis. Nucl. Acids Res. 31, e73.

  11. Лапа С.А., Гусейнов Т.О., Павлов А.С., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Заседателев А.С., Чудинов А.В. (2020) Одновременное применение Cy5-модифицированных производных дезоксиуридина и дезоксицитидина в ПЦР. Биоорган. химия. 46, 418–424.

  12. Лапа С.А., Павлов А.С., Кузнецова В.Е., Шершов В.Е., Спицын М.А., Гусейнов Т.О., Радько С.П., Заседателев А.С., Лисица А.В., Чудинов А.В. (2019) Ферментативное получение модифицированных ДНК: изучение кинетики ПЦР в режиме реального времени. Молекуляр. биология. 53, 513–523.

  13. Радько С.П., Лапа С.А., Чудинов А.В., Хмелёва С.А., Маннанова М.М., Курбатов Л.К., Киселёва Я.Ю., Заседателев А.С., Лисица А.В. (2019) Оценка разнообразия комбинаторных ДНК-библиотек на основе анализа формы амплификационных кривых для мониторинга эффективности селекции аптамеров. Биомед. химия. 65, 477–484.

  14. Василисков В.А., Шершов В.Е., Мифтахов Р.А., Кузнецова В.Е., Радько С.П., Лисица А.В., Лапа С.А., Суржиков С.А., Тимофеев Э.Н., Заседателев А.С., Чудинов А.В. (2020) Эффект проскальзывания в реакции элонгации праймера при использовании модифицированных 2'‑дезоксиуридинтрифосфатов. Биоорган. химия. 46, 270–272.

  15. Porter K.W., Tomasz J., Huang F., Sood A., Shaw B.R. (1995) N7-cyanoborane-2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate is a good substrate for DNA polymerase. Biochemistry. 34, 11963–11969.

  16. Rohloff J.C., Gelinas A.D., Jarvis T.C., Ochsner U.A., Schneider D.J., Gold L., Janjic N. (2014) Nucleic acid ligands with protein-like side chains: modified aptamers and their use as diagnostic and therapeutic agents. Mol. Ther. Nucl. Acids. 3, e201.

  17. Giller G., Tasara T., Angerer B., Mühlegger K., Amacker M., Winter H. (2003) Incorporation of reporter molecule-labeled nucleotides by DNA polymerases. I. Chemical synthesis of various reporter group-labeled 2'-deoxyribonucleoside-5'-triphosphates. Nucl. Acids Res. 31, 2630–2635.

Дополнительные материалы отсутствуют.