Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 1, стр. 24-46

ВВЕДЕНИЕ

Смещение акцентов в ассоциативных исследованиях от анализа генов-кандидатов к полногеномным ассоциативным исследованиям (GWAS) привело к открытию большого числа новых маркеров, ассоциированных с заболеваниями и количественными (в том числе и патогенетически значимыми) признаками. Оказалось, что среди ассоциированных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) бóльшая часть локализована в некодирующих участках генов и межгенных регионах [1]. В то же время ассоциированные с заболеваниями генетические варианты, выявленные при проведении GWAS, необязательно “указывают” на наличие функциональной значимости для развития патологии именно этих вариантов, не всегда понятно, как эти варианты изменяют функциональное состояние клетки и в итоге работу организма в целом, определяя риск развития патологии. В этой связи в последние годы особенно активно стали развиваться биоинформатические подходы, позволяющие оценить функциональную значимость полиморфных вариантов не напрямую, а через существующие блоки сцепления, эпистатические взаимодействия с различными генами, “взаимоотношения” различных уровней регуляции.

К числу относительно новых генов, структурная вариабельность которых может вносить вклад в формирование предрасположенности к различным многофакторным заболеваниям, относятся гены, кодирующие белки систем репарации ДНК. Помимо вовлеченности в канцерогенез (чему посвящены многочисленные исследования), накапливаются данные о значимости этих генов при развитии заболеваний сердечно-сосудистой, пищеварительной, мочеполовой, скелетно-мышечной, гемопоэтической и других систем (см. обзор [2]). Ранее нами изучена вовлеченность 9 SNP в генах, кодирующих белки различных репарационных систем: TP53BP1 (rs560191), NBN (rs1805800, rs709816), MRE11 (rs473297), ATM (rs189037, rs1801516), MLH1 (rs1799977), PMS2 (rs1805321), LIG1 (rs20579), ‒ в развитие многофакторной патологии различной этиологии. Мы проанализировали около 1.5 тыс. образцов ДНК из банка ДНК НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ РАН, полученных от пациентов с различными заболеваниями: изолированная аллергическая бронхиальная астма (БА) и смешанная БА в сочетании с артериальной гипертензией (БА_АГ), хронический вирусный гепатит С (ХВГС), туберкулез (ТБ), сердечно-сосудистые заболевания (ишемическая болезнь сердца (ИБС) и аутопсийный материал умерших в результате сердечно-сосудистого события (АУТ_ИБС)); а также от жителей г. Томска (популяционная выборка – К) и долгожителей (Гер) [3‒8]. При незначительной подразделенности изученной популяции на субгруппы в соответствии с основными диагнозами пациентов (попарные F_ST < 1%) выявлен неплохой дифференцирующий потенциал маркеров. При визуализации матрицы генетических расстояний видно (рис. 1), что первая координата отделяет контроль (К) и группы пациентов с ИБС и умерших в раннем возрасте от сердечно-сосудистых катастроф (АУТ_ИБС) от групп пациентов с другими заболеваниями. Это может свидетельствовать о малом вкладе изученных маркеров генов, кодирующих белки систем репарации ДНК, в развитие сердечно-сосудистой патологии, что согласуется с результатами ассоциативного анализа: прямых ассоциаций с патологией не выявлено, ассоциации зарегистрированы только с патогенетически значимыми признаками [3]. Вторая координата от кластера сердечно-сосудистой патологии и контроля отделяет группу умерших от сердечно-сосудистого заболевания, из чего можно предполагать вклад изученных маркеров в раннее развитие или в быструю прогрессию таких заболеваний и, как следствие, в ранние неблагоприятные исходы. От большого кластера прочих патологий вторая координата отделяет БА – изолированную форму и сочетанную с артериальной гипертензией, ‒ что предполагает наличие вклада изученных маркеров в аллергическую компоненту этих заболеваний. И это вполне возможно, так как белки репарационных систем вовлечены в V(D)J-рекомбинацию и переключение синтеза классов иммуноглобулинов. Результаты ассоциативного анализа, в свою очередь, также подтверждают этот вывод [4, 5, 8].

Рис. 1.

Расположение изученных групп патологий в поле главных координат на основании генетических дистанций, рассчитанных по маркерам, локализованным в генах, кодирующих белки систем репарации ДНК. Расчет генетических дистанций по методу Nei и их визуализация выполнены с помощью приложения GenAlEx 6.503 [9]. ИБС – ишемическая болезнь сердца; АУТ_ИБС – аутопсийный материал умерших в результате сердечно-сосудистого события; ТБ – туберкулез; ХВГС – хронический вирусный гепатит С; БА – бронхиальная астма; БА_АГ – бронхиальная астма в сочетании с артериальной гипертензией; Гер – выборка долгожителей; К – средневозрастная популяционная выборка.

Таким образом, вклад изученных маркеров в развитие многофакторной патологии очевиден, хотя не все полученные ассоциации можно логично объяснить с точки зрения патогенеза анализируемых заболеваний. Для выяснения возможных механизмов фенотипической реализации установленных ассоциаций нами проведена подробная аннотация регуляторного потенциала изучаемых маркеров. Аннотация выполнена с использованием таких открытых ресурсов, как GTXPortal, VannoPortal, Ensemble, RegulomeDB, Polympact, UCSC, GnomAD, ENCODE, GeneHancer, EpiМap Epigenomics 2021, HaploReg, GWAS4D, JASPAR, ORegAnno, DisGeNet и OMIM.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАННЫХ МАРКЕРОВ

Маркеры для анализа изначально выбирали с учетом их вероятной функциональной значимости, соответственно они располагались либо в кодирующей (rs560191, rs709816, rs1801516, rs1799977, rs1805321), либо в промоторной (rs473297, rs1805800, rs189037, rs20579) части генов (табл. 1), что предполагает влияние замены на изменения либо структуры белка, либо уровня экспрессии. Согласно рангу по RegulomeDB, наибольшим регуляторным потенциалом обладают rs560191 и rs473297, которые представляют собой eQTL-варианты, а также расположены в регионах связывания транскрипционных факторов (TF) или в регионах чувствительности к ДНКазе. Наименьший регуляторный потенциал предполагается для rs709816 (изменение мотивов связывания TF) и rs1801516 (ранг – “Другое”).

Вариант rs560191 в гене TP53BP1 представляет собой миссенс-замену G/C в экзоне 9, приводящую к замене Asp358Glu в кодируемом белке (табл. 1). Средняя частота аллеля С составляет 0.526, варьируя от 0.213 у финнов до 0.973 у афроамериканцев. У африканцев и афроамериканцев в том же геномном положении зарегистрирована также замена G/T, частота аллеля Т ‒ около 6 × 10^‒5 (http://www.ensembl.org/index.html, https://gnomad. broadinstitute.org/). Данный SNP локализован между двумя дистальными энхансерподобными регуляторными элементами: E1757875/enhD и E1757876/enhD (https://genome.ucsc.edu/, https:// www.encodeproject.org/).

В гене NBN изучено две нуклеотидные замены: rs1805800 и rs709816 (табл. 1). rs1805800 представляет собой замену C/T в 5`UTR гена NBN. Среднепопуляционная частота аллеля T rs1805800 составляет 0.353, варьируя в пределах от 0.167 (африканские популяции Карибов и Барбадоса) до 0.500 у индийцев-гуджарати (http://www.ensembl. org/index.html, https://gnomad.broadinstitute.org/). Данный маркер находится на расстоянии 395 п.н. от промотора гена NBN; входит в состав промотора GH08J089980 и проксимального энхансерподобного элемента E2646296/enhP (https:// g-enome.ucsc.edu/, https://www.encodeproject.org/, https://www.genecards.org/). Замена A/G (rs709816) в экзоне 10 гена NBN синонимичная (Asp399). В референсной последовательности описан аллель A, хотя фактически это производный аллель. Среднепопуляционная частота аллеля G составляет 0.609, наименьшая частота зарегистрирована у жителей Англии и Шотландии (0.319), наибольшая – у населения Гамбии (0.925) (http://www. mulinlab.org/vportal/index.html, http://www.ensembl. org/index.html, https://gnomad.broadinstitute.org/). Эта сайленс-замена локализована менее чем в 5000 п.н. от дистального энхансерподобного элемента E2646270/enhD и энхансера GH06J089948 (https://genome.ucsc.edu/, https://www.encodeproject. org/, https://www.genecards.org/).

Два SNP изучено также в гене ATM (табл. 1). rs189037 представляет собой замену G/A в 5'UTR гена, локализованную в CpG-островке, в 29 п.н. от промотора гена ATM, внутри промотора GH11J108219, между промоторподобными элементами E1567620/prom (в 73 п.н.) и E1567621/prom (в 128 п.н.) (https://genome.ucsc.edu/, https://www. encodeproject.org/, https://www.genecards.org/). Среднепопуляционная частота составляет 0.467, варьируя от 0.138 у гамбийцев до 0.703 у населения Пакистана (http://www.ensembl.org/index.html, https://gnomad.broadinstitute.org/). rs1801516 – миссенс-вариант G/A в 37 экзоне, приводящий к замене Asp1853Asn. Этот вариант локализован в мультирегионе взаимодействия KDELC2/GH11J108219, расположен на расстоянии 893 п.н. от дистального энхансерподобного элемента E1567660/enhD (https://genome.ucsc.edu/, https://www.encodeproject.org/, https://www.genecards.org/). Среднепопуляционная частота аллеля А составляет 0.0669, варьируя от 0.0004 у японцев до 0.2367 у финнов (http://www.ensembl.org/index.html, https://gnomad. broadinstitute.org/).

rs473297 в гене MRE11 (табл. 1) представляет собой замену T/G в 5'UTR, локализованную в 79 п.н. от промотора GH11J094492, в 550 п.н. от проксимального энхансерподобного элемента E1561900/enhP, в регионе взаимодействия MRE11/GH11J094492 (https://genome.ucsc.edu/, https://www.genecards.org/). Среднепопуляционная частота аллеля G составляет 0.539, варьируя от 0.346 у британцев и шотландцев до 0.652 у ишан из Нигерии. В этой же точке генома у жителей Восточной Азии описана замена T/А, частота аллеля A составляет менее 3 × 10^‒4 (http://www.ensembl.org/index.html, https://gnomad.broadinstitute.org/).

В экзоне 8 гена MLH1 изучена несинонимичная замена A/G ‒ rs1799977 (табл. 1), ‒ ведущая к замене Ile219Val в кодируемом белке. Этот вариант локализован в мультирегионе взаимодействия LRRFIP2/GH03J036988 (https://genome.ucsc.edu/, https://www.genecards.org/). Среднепопуляционная частота аллеля G составляет 0.170, варьируя от 0.006 (менде, Сьерра-Леоне) до 0.360 (тосканцы, Италия). В редких случаях в этой точке генома регистрируют замену A/T (описана в базе TOPMed) с частотой аллеля T 1.5 × 10^‒5 (http://www.ensembl. org/index.html, https://gnomad.broadinstitute.org/).

rs1805321 (табл. 1) в гене PMS2 представляет собой нуклеотидную замену G/A в экзоне 11, приводящую к замене Pro470Ser в кодируемом белке. Этот SNP локализован в 1512 п.н. от дистального энхансерподобного элемента E2531915/enhD (https:// genome.ucsc.edu/, https://www.encodeproject.org/). Среднепопуляционная частота замены – 0.358, варьирует в пределах от 0.206 (у менде, Сьерра-Леоне) до 0.505 (у британцев Англии и Шотландии) (http://www.ensembl.org/index.html, https://gnomad.broadinstitute.org/).

Замена G/A (rs20579) расположена в 5'UTR гена LIG1 (табл. 1), в некодирующей части экзона 2, она локализована в мультирегионах взаимодействия LIG1/GH19J048121 и PLA2G4C/GH19J048253; в 158 п.н. от замены заканчивается проксимальный энхансерподобный элемент E1959701/enhP (https:// genome.ucsc.edu/, https://www.encodeproject.org/). Среднепопуляционная частота аллеля A составляет 0.173, варьирует от 0.0594 (у японцев) до 0.343 (у йоруба и ишан в Нигерии) (http://www.ensembl. org/index.html, https://gnomad.broadinstitute.org/).

Таким образом, все анализируемые нуклеотидные замены локализованы в регионах (или рядом с ними), непосредственно регулирующих транскрипцию генов (промоторов, энхансеров и подобных им элементов), и, следовательно, могут обладать регуляторным потенциалом.

МОДИФИКАЦИИ ГИСТОНОВ, КОЛОКАЛИЗОВАННЫЕ С АНАЛИЗИРУЕМЫМИ МАРКЕРАМИ

Известно, что в определении функционального состояния отдельно взятых фрагментов генома важнейшую роль играют посттрансляционные модификации гистонов (“гистоновый код”) [10]. Для анализа гистоновых модификаций в регионах локализации исследуемых SNP были использованы данные репозитория EpiМap Epigenomics 2021, представляющего собой интегральный р-есурс, обобщающий эпигеномные карты по 869 биообразцам, отнесенным к 33 категориям тканей (http://compbio.mit.edu/epimap/#chromatin-states) [11]. Под биообразцами при этом понимаются как клетки различных тканей (в норме на разных стадиях развития и при патологии), так и различные клеточные линии и их дериваты.

Для кодирующих регионов генов, в которых локализовано пять привлеченных к рассмотрению полиморфных вариантов, отмечается небольшое количество гистоновых модификаций, характерных для активно транскрибируемого хроматина. Так, для всех пяти локусов выявлено триметилирование лизина в позиции 36 гистона H3 (H3K36me3), типичное для открытого хроматина и способствующее элонгации транскрипции (табл. 2) (http://www.mulinlab.org/vportal/index.html, http://compbio.mit.edu/epimap/#chromatin-states). Другие эпигенетические метки (также характеризующие активную транскрипцию) встречаются редко, в отдельных типах клеток. Так, с регионом гиперчувствительности к ДНКазе колокализованы четыре из исследованных замен в кодирующих участках генов: rs560191 (в быстрорастущем клоне линии LNCaP, звездчатых клетках печени, гепатоцитах, лимфобластоидной клеточной линии GM19239, линии фибробластов легких AG08396), rs709816 (в эмбриональных клетках желудка), rs1801516 (в гематопоэтических стволовых и B-клетках при миелоидном лейкозе), rs560191 (в быстрорастущем клоне линии LNCaP, звездчатых клетках печени, гепатоцитах, лимфобластоидной клеточной линии GM19239, линии фибробластов легких AG08396), rs1799977 (в клетках аденокрциномы простаты) (http://www. mulinlab.org/vportal/index.html, http://compbio.mit.edu/ epimap/#chromatin-states). Кроме того, rs560191 в гене TP53BP колокализован с регионом связывания РНК-полимеразы II (в клетках влагалища), с ацетилированным лизином в позиции 23 гистона H3 – H3K23ac (в клетках трофобласта, дериватах H1-hESC), с H3K79me1 (в мезенхимальных и мезодермальных стволовых клетках, дериватах H1-hESC; в эмбриональных стволовых клетках линии H9; в эмбриональных фибробластах легкого линии IMR-90), с H3K27ac и H3K9ac (в гепатоцитах), H4K20me1 (в эмбриональных клетках, подобных стволовым, ‒ линия H1-hESC) (http://www. mulinlab.org/vportal/index.html, http://compbio.mit. edu/epimap/#chromatin-states). Нуклеотидная последовательность, содержащая rs709816 в гене NBN, колокализована с H3K27ac (большеберцовые нервы), с H3K79me2 (нейробластома) (http:// www.mulinlab.org/vportal/index.html, http://compbio. mit.edu/epimap/#chromatin-states). rs1801516 в гене АТМ колокализован с H4K20me1 (колоректальная аденокарцинома) (табл. 2) (http://www. mulinlab. org/vportal/index.html, http://compbio.mit.edu/epimap/#chromatin-states).

Таблица 2.  

Колокализованные с анализируемыми маркерами модификации хроматина

[i] ^a im (imputed) – предполагаемая (вмененная), ob (observed) – наблюдаемая колокализация с модифицированным гистоном/белком хроматина.

[ii] ^b Биообразцы представляют собой отдельные ткани/клеточные линии/клетки/индуцированные плюрипотентные стволовые клетки/дериваты и т.д. (данные EpiМap Epigenomics, http://compbio.mit.edu/epimap/#chromatin-states). Светло-серая заливка – способствующие транскрипции модификации, колокализованные с заменами в кодирующих регионах, темно-серая – с заменами в 5'UTR; черная заливка – модификации-репрессоры.

Иной паттерн модификаций гистонов колокализуется с маркерами в 5'UTR генов (табл. 2). Каждый из этих SNP колокализован с пятью модификациями хроматина: регионом гиперчувствительности к ДНКазе, H3K27ac и H3K4me2 (характеризующими энхансерные последовательности), H3K4me3 и H3K9ac (способствующими активации транскрипции). Три маркера колокализованы с модификацией H3K4me1 (также характерной для энхансерных последовательностей): rs473297 в 141, rs1805800 в 255 биообразцах и rs20579 в эпителиальных клетках меланомы и нейроэпителиоме. С модификацией, поддерживающей активацию транскрипции и элонгацию, H3K79me2, колокализованы следующие маркеры: rs473297 в 732, rs20579 в 235 и rs189037 в 6 биообразцах (в различных субпопуляциях T-лимфоцитов, а также в T-лимфоцитах при остром лимфобластном лейкозе и в лимфобластоидной клеточной линии). Модификация H3K36me3, поддерживающая элонгацию транскрипции, колокализуется с rs20579 (в 48 образцах) и rs189037 (в T-лимфоцитах, гладкомышечных клетках двенадцатиперстной кишки, фибробластах крайней плоти).

Два локуса (rs1805800 и rs189037) находятся в открытом хроматине с сайтами связывания таких белков, как CTCF, SMC3, EP300, H2AFZ. rs189037, кроме этого, колокализован с сайтом связывания РНК-полимеразы II и RAD21. Известно, что транскрипционный репрессор CTCF связывается с инсуляторами генов [12]. Кроме того, у млекопитающих CTCF совместно с когезиновым комплексом (в который входят в том числе SMC3 и RAD21) и гистоном H2AFZ принимает участие в организации хромосом в топологически ассоциированные домены [13, 14]. Следовательно, нуклеотидные последовательности, в которых находятся rs1805800 и rs189037, имеют важное топологическое значение и любые изменения в их структуре могут способствовать развитию патологических состояний.

Два маркера колокализованы с H3K79me1 (активация элонгации): rs20579 (в эмбриональных фибробластах легкого, дериватах линии H1-hESC – мезенхимальных и мезодермальных стволовых клетках), rs189037 (в клетках трофобласта ‒ дериваты из H1-hESC). С монометилированным лизином в положении 20 гистона H4 (H4K20me1), также поддерживающим активацию транскрипции [15], колокализованы rs473297 (в двух клеточных линиях Т-лимфоцитов при остром лимфобластном лейкозе) и rs20579 (в Т-лимфоцитах при остром лимфобластном лейкозе и в эндотелиальных клетках пупочной вены новорожденного).

rs189037 в гене АТМ в различных эмбриональных тканях/дериватах колокализован с целым рядом гистоновых модификаций, также поддерживающих активацию транскрипции: H2AK9ac, H2BK120ac, H2BK12ac, H2BK15ac, H3K23ac, H3K4ac, H2BK5ac, H3K18ac, H3K56ac, H4K12ac, H4K8ac и H4K91ac. Такое множество модификаций в единичных эмбриональных клеточных линиях может свидетельствовать о важной роли данного локуса на ранних этапах развития.

Все перечисленные выше модификации гистонов запускают/усиливают/поддерживают транскрипцию. И лишь две из колокализованных с анализируемыми маркерами модификации приводят к транскрипционному сайленсингу – это H3K27me3 [16] и H3K23me2 [17]. Среди изученных маркеров с H3K27me3 колокализован rs189037 в клетках зародышевого матрикса; а с H3K23me2 – rs20579 в эмбриональных стволовых клетках линии H1-hESC. Вероятно, более тонкая регуляция функций этих локусов в эмбриональном развитии может играть важную роль.

Таким образом, с учетом характера модификаций гистонов, колокализованных с привлеченными к анализу SNP генов систем репарации ДНК, можно заключить, что, во-первых, все эти регионы в большинстве изученных тканей активно транскрибируются; во-вторых, два региона (колокализованные с rs1805800 и rs189037) участвуют в организации топологических доменов, причем один из них (колокализованный с rs180937), вероятно, играет важную роль в эмбриональном развитии.

ЗАВИСИМОСТЬ ЭКСПРЕССИОННОГО СТАТУСА ГЕНОВ ОТ АНАЛИЗИРУЕМЫХ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ

Репарация ДНК ‒ один из базовых процессов живой клетки, а экспрессия генов, белковые продукты которых задействованы в его реализации и контроле, идет во всех типах тканей на всех стадиях онтогенеза. Однако, в отличие от генов “домашнего хозяйства”, уровень экспрессии генов, кодирующих белки систем репарации ДНК варьирует в зависимости от потребности клетки; и чем шире сфера компетенции этих генов, тем выше наблюдаемый уровень экспрессии. Для всех рассматриваемых здесь генов минимальный уровень экспрессии составлял от 1‒2 TPM (Transcripts Per Million – транскриптов на миллион): АТМ в скелетных мышцах, MRE11 в тканях головного мозга, TP53BP1 в цельной крови, PMS2 в миокарде, LIG1 в левом желудочке ‒ до 5‒6 TPM (NBN в коре почек, MLH1 в цельной крови) (https://gtexportal.org/home/). Интересно, что максимальный уровень этих транскриптов в большинстве случаев детектировали в лимфоцитах, стимулированных вирусом Эпштейна‒Барр (АТМ – 21, MRE11 –22, NBN – 67, MLH1 – 48, PMS2 – 22, LIG1 – 51 TPM), и только для гена TP53BP1 максимальный уровень экспрессии регистрировали в гипофизе – 50 TPM (https://gtexportal.org/home/). Все вышеперечисленные маркеры (табл. 1) относятся к cys-eQTL-вариантам (то есть могут влиять на экспрессию “своего” и расположенных рядом генов) и бóльшая часть – к sQTL-вариантами (влияют на сплайсинг).

В подавляющем большинстве случаев изменение экспрессии подчиняется линейной зависимости: либо RR > RP > PP, либо RR < RP < PP (где R – референсный аллель, P – производный аллель), – поэтому далее мы преимущественно обсудим различия между экспрессией гомозиготных генотипов, подразумевая, что гетерозиготы занимают промежуточное положение. Те случаи, когда наблюдаются отклонения от указанной тенденции, будут рассмотрены особо.

Влияние rs560191 в гене TP53BP1 на экспрессию и сплайсинг

rs560191 (TP53BP1) находится в пределах большого блока корегулируемых генов (рис. 2). Уровень сцепления, близкий к единице, выявлен для SNP, расположенных вокруг rs560191 и охватывающих регион больше 87 млн.п.н. Этот блок сцепления включает маркеры, которые представляют собой eQTL для 20 генов и sQTL для 11 генов (http://www.mulinlab.org/vportal/index.html).

Рис. 2.

Взаимодействия между регуляторными элементами и генами (согласно GeneHancer) в регионе локализации гена TP53BP1. Разными цветами выделены отдельные гены и их регуляторные взаимодействия (воспроизведено из онлайн-браузера UCSC: https://genome.ucsc.edu/).

Для большинства генов, регулируемых rs560191 (табл. S1 , см. Дополнительные материалы на сайте http://www.molecbio.ru/downloads/2023/1/supp_ Бабушкина_rus.zip), характерно однонаправленное изменение экспрессии в различных тканях в зависимости от генотипа. Так, для AC011330.13 (4 ткани), AC011330.5 (40 тканей), ADAL (37 тканей), CATSPER2 (1 ткань), CCNDBP1 (4 ткани), CKMT1A (4 ткани), CKMT1B (1 ткань), PDIA3 (3 ткани), TP53BP1 (15 тканей), TTBK2 (2 ткани) у гомозиготных носителей анцестрального аллеля (GG) уровень экспрессии выше, чем у гомозигот по производному аллелю (CC), а для гетерозигот характерны промежуточные значения. В то же время обратная ситуация (GG < CC) наблюдается для генов CATSPER2P1 (14 тканей), MAP1A (2 ткани), RNU6-554P (1 ткань), STRC (27 тканей), STRCP1 (25 тканей), TGM7 (3 ткани), TUBGCP4 (2 ткани). Для трех генов (LCMT2, TGM5, ZSCAN29) отмечается межтканевая вариабельность характера экспрессии. Так, максимальный уровень экспрессии гена LCMT2 в слизистой оболочке пищевода наблюдается у гомозигот СС, в то время как в четырех других тканях (большеберцовые нервы, культуры фибробластов, семенники, гладкомышечные клетки пищевода) – у гомозигот GG. В трех тканях (в слизистой оболочке и гладкомышечных клетках пищевода, ободочной кишке) характер экспрессии гена TGM5 изменяется в направлении GG > GC > CC, а в трансформированных вирусом Эпштейна‒Барр лимфоцитах – в обратном направлении (GG < GC < CC). Экспрессия гена ZSCAN29 выше у гомозигот по предковому аллелю в 25 исследованных тканях, кроме тканей мозга (хвостатое и прилежащее ядро базальных ганглиев, фронтальная кора, передняя поясная кора), в которых экспрессия этого гена наиболее выражена у носителей производного аллеля в гомозиготном состоянии (https://gtexportal.org/home/).

Показано влияние генотипов rs560191 на сплайсинг 11 генов, из них 10 совпадают с генами, для которых этот полиморфный вариант является eQTL, еще один ген – PPIP5K1 – не входит в этот список. Данный регион характеризуется сложной регуляцией транскрипции. В частности, происходит образование общего транскрипта при считывании генов CATSPER2P1, AC011330.5, CATSPER2. Для них показаны общие эффекты сплайсинга: производный аллель в дозозависимой манере увеличивает эффективность вырезания интрона 11 гена CATSPER2, что оказывает влияние на сплайсинг мРНК генов AC011330.5 (в 20 тканях) и CATSPER2 (в 37 тканях). Эффективность вырезания интрона 10 гена CATSPER2 из общего транскрипта снижается в скелетных мышцах, шейном отделе спинного мозга, мозжечке и черной субстанции головного мозга (оказывая влияние на сплайсинг мРНК гена CATSPER2) и повышается в семенниках (влияя на сплайсинг CATSPER2P1 и CATSPER2). Повышение эффективности вырезания области, включающей экзон 1–интрон 4 гена CATSPER2, влияет на сплайсинг мРНК гена AC011330.5 (в мозжечке). Кроме этого, носительство производного аллея rs560191 приводит к снижению эффективности вырезания отдельных интронов в генах AC011330.5, CATSPER2, PPIP5K1, STRCP1, TGM5, TGM7, TP53BP1 и ADAL (показано в одной‒трех тканях для каждого транскрипта).

Повышение эффективности вырезания показано для экзона 2 (с прилегающими интронами) гена ADAL (в 9 тканях), экзона 19 (с прилегающими интронами) гена STRC (в мозжечке), интрона 2 гена ZSCAN29 (в сигмовидной кишке) (https://gtexportal.org/home/).

Соотношение изоформ белка, синтезирующихся в результате альтернативного сплайсинга, зависит в том числе от того, насколько эффективно будет происходить вырезание тех или иных последовательностей из пре-мРНК. В случае, когда зарегистрирована зависимость и уровня экспрессии, и сплайсинга от одного и того же варианта одного и того же гена в одной и той же ткани, можно проанализировать, каким образом меняется синтез зрелой мРНК в зависимости от анализируемой нуклеотидной замены. Можно предположить, что при однонаправленном изменении, например при усилении экспрессии в направлении RR < RP < PP и повышении эффективности вырезания какого-либо фрагмента мРНК, общее увеличение продукции гена происходит, главным образом, за счет того/тех вариантов, в которых вырезаемый фрагмент отсутствует. И напротив, если эффективность снижается (в соответствии с примером выше, это RR > RP > PP), то усиление экспрессии происходит за счет относительного увеличения частоты тех вариантов, в которых этот фрагмент остается.

Анализ данных по влиянию rs560191 на экспрессию и сплайсинг показывает, что повышение эффективности вырезания интрона 11 гена CATSPER2 сопряжено со снижением уровня транскрипции генов CATSPER2 (в слизистой оболочке желудка) и AC011330.5 (в 21 ткани). Снижение экспрессии AC011330.5 в мозжечке идет на фоне увеличения эффективности вырезания экзона 1–интрона 4 гена CATSPER2, а в семенниках ‒ интрона 25 гена AC011330.5. Снижение экспрессии гена ADAL происходит на фоне повышения эффективности вырезания экзона 2 с прилегающими интронами (в 7 тканях) и понижения эффективности вырезания интрона 2 (в гипофизе). Общее снижение экспрессии генов TGM5 и TP53BP1 сопряжено со снижением эффективности вырезания их интронов (9 и 23 соответственно). Снижение эффективности вырезания интрона 11 в гене TGM7 и интрона 24 гена STRCP1, а также повышение эффективности вырезания экзона 19 с прилегающими интронами в гене STRC сопряжены с увеличением уровня экспрессии соответствующих генов в отдельных тканях (https://gtexportal.org/home/).

Влияние rs473297 в гене MRE11 на экспрессию и сплайсинг

rs473297 находится в большом блоке сцепления (не менее 123 т.п.н.), в пределах которого D' между анализируемым маркером и другими eQTL-SNP составляет 0.95‒1.00. rs473297 служит eQTL-вариантом для генов MRE11 (49 тканей), GPR83 (4 ткани), IZUMO1R (1 ткань) и RP11-685N10.1 (37 тканей) (табл. S1 , см. Дополнительные материалы на сайте http://www.molecbio.ru/ downloads/2023/1/supp_Бабушкина_rus.zip). Во всех изученных тканях наличие альтернативного варианта приводит к возрастанию уровня экспрессии генов IZUMO1R, MRE11, RP11-685N10.1 и к снижению экспрессии гена GPR83 (https:// g-texportal.org/home/). Влияние на уровень сплайсинга показано для генов MRE11 (семенники и большеберцовые нервы) и RP11-685N10.1 (8 тканей). Наличие замены приводит к снижению эффективности вырезания интрона 7, внутри которого локализован ген RP11-685N10.1. В большеберцовых нервах происходит также снижение эффективности вырезания интрона 1 мРНК гена MRE11 (рис. 3) (https://gtexportal.org/home/).

Рис. 3.

Изменение уровня экспрессии (вверху) и эффективности сплайсинга (внизу) генов MRE11 (в большеберцовых нервах и семенниках) и RP11-685N10.1 (в семенниках и подкожной жировой ткани) в зависимости от rs473297 в гене MRE11. Ось Х – генотипы по rs473297, ось Y – нормализованные уровни экспрессии (вверху), нормализованный уровень вырезания интрона (по данным GTXPortal: https://gtexportal.org/home/).

ИЗМЕНЕНИЯ МОТИВОВ СВЯЗЫВАНИЯ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ, ПРОИСХОДЯЩИЕ В РЕЗУЛЬТАТЕ АНАЛИЗИРУЕМЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН

В результате изменения нуклеотидной последовательности могут меняться сайты связывания TF, что позволяет определять статус нуклеотидных замен в качестве cys-eQTL-SNP. В настоящее время накоплена обширная информация о взаимодействии хроматина и различных TF. Имеющиеся данные получены как экспериментальным путем (методами иммунопреципитации хроматина, например ChIP-Seq), так и биоинформатическими методами. Существует множество инструментов для биоинформатического анализа, позволяющих выявить в нуклеотидной последовательности вероятные мотивы связывания TF и предсказать, каким образом будет меняться их аффинность в результате всевозможных структурных изменений. Однако следует учитывать, что различные инструменты анализа не всегда дают согласующуюся информацию.

Мы проанализировали изменения мотивов связывания TF с помощью ресурсов HaploReg (https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/ haploreg.php), Poplympact (https://regulomedb.org/ regulome-search/), GWAS4D (http://mulinlab.tmu. edu.cn/gwas4d/gwas4d/gwas4d/gwas4d_server) (рис. 4, круговые диаграммы Венна). Наименьшее число изменяющихся мотивов предсказывает HaploReg (https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/ haploreg.php). Согласно полученным данным, в результате проанализированных вариантов меняются сайты связывания TF в генах ATM (rs189037, rs1801516), TP53BP1 (rs560191), NBN (rs1805800). Ресурс Polympact не определяет изменений мотивов в результате замены в гене TP53BP1, но показывает их наличие в генах ATM, NBN, MRE11, PMS2 (рис. 4). Согласно GWAS4D, все изученные нуклеотидные замены влияют на аффинность связывания TF с их сайтами. Так, rs560191 в гене TP53BP1 изменяет только 8 сайтов, а rs189037 в гене ATM ‒ 33; всего для 9 изученных SNP меняется 168 мотивов для 99 TF (https://bcglab.cibio. unitn.it/polympact/, https://pubs.broadinstitute.org/ mammals/haploreg/haploreg.php, http://mulinlab. tmu.edu.cn/gwas4d/gwas4d/gwas4d /gwas4d_server).

Рис. 4.

Влияние изученных SNP-маркеров на сайты связывания транскрипционных факторов. Круговые диаграммы – теоретически рассчитанные мотивы связывания TF с изменяющейся в результате нуклеотидной замены аффинностью (по данным HaploReg, Poplympact, GWAS4D). Овальные диаграммы ‒ экспериментально подтвержденные ДНК-белковые взаимодействия в регионах локализации нуклеотидной замены (по данным, приведенным в JASPAR, ORegAnno, ENCODE, VannoPortal). Цифрами указано число мотивов в разных базах данных; названия совпадающих по данным различных ресурсов TF приведены рядом.

Для перекрывающихся мотивов все алгоритмы дают согласующуюся информацию по изменению аффинности связывания TF при изменении нуклеотидной последовательности, хотя перекрывание полученных списков в целом довольно слабое. Так, и HaploReg, и GWAS4D предсказывают изменения аффинности сайтов связывания MYC (rs1805800 в гене NBN), а также CHD2 и RAD21 (rs189037 в гене ATM). HaploReg и Polympact дают согласующиеся результаты по отношению к POU5F1 (rs1805800, ген NBN), MYC (rs189037, ген ATM) и ARID5B (rs1801516, ген ATM). Наибольшее число совпадающих результатов получено между данными GWAS4D и Polympact: rs1805800 (NBN) приводит к изменению сайта связывания BHLHE40; rs709816 (NBN) – EGR1 и KLF1; rs473297 (MRE11) – RUNX2; rs189037 (ATM) – USF2, EGR1, TFAP2A; rs1805321 (PMS2) – STAT5A (https://regulomedb. org/regulome-search/, https://pubs.broadinstitute.org/ mammals/haploreg/haploreg.php, http://mulinlab. tmu.edu.cn/gwas4d/gwas4d/gwas4d/gwas4d_server) (рис. 4). Большинство из этих TF экспрессируются с разным уровнем в широком спектре тканей, за исключением TFAP2A, который экспрессируется в тканях пищеварительной системы (малая слюнная железа, слизистая оболочка пищевода), мочевыводящей системы (кора и мозговое вещество почки, мочевой пузырь), репродуктивной системы (семенники, влагалище), коже (вне зависимости от солнечной экспозиции) (https://genome. ucsc.edu/, https://www.encodeproject.org/).

Чтобы проанализировать, связывание каких TF подтверждено экспериментально, мы привлекли данные ChIP-Seq-анализа из ресурсов JASPAR (https://jaspar.genereg.net/) [19], ORegAnno (http:// www.oreganno.org/) [20], ENCODE (https://www. encodeproject.org/) [21], а также Vann-oPortal (http://www.mulinlab.org/vportal/index. html), на котором представлены объединенные данные CistromeDB 20181120, DeepBlueR V1.0, GTRD 2020-06, EpiMap 2021-01-11, включающие информацию о связывании TF и других взаимодействующих с хроматином белков [22‒24] (рис. 4, овальные диаграммы Венна).

На основании данных по иммунопреципитации хроматина можно сделать вывод, что регионы локализации анализируемых SNP в кодирующей последовательности минимально связаны с TF. Так, по данным JASPAR, ORegAnno и ENCODE, не обнаружено сайтов связывания TF для rs560191 в гене TP53BP1, rs1801516 в гене ATM, rs1805321 в гене PMS2. Однако по данным VannoPortal, для этих нуклеотидных последовательностей показано связывание в отдельных тканях/клеточных линиях с TF либо иными белками: модификаторами хроматина, ферментативными комплексами и другими, также влияющими на уровень экспрессии белков. Например, в регионе локализации rs560191 выявлено связывание лизиновой метилтрансферазы KMT2A (в клеточной линии RS4 острого лимфобластного лейкоза) и POLR2A – субъединицы А РНК-полимеразы II (в клетках влагалища); с регионом локализации rs1801516 в гене ATM связывается BRD4 (в клетках крови); в области гена PMS2, содержащей rs1805321, обнаружено связывание 13 белков (каждый в 1‒3 типах клеток). В регионах еще двух SNP в кодирующей последовательности и одного маркера в 5'UTR факты связывания с единичными TF зарегистрированы в нескольких базах данных, но эти результаты не перекрываются. Так, с регионом локализации rs1799977 в гене MLH1 по данным ENCODE связывается CTCF (в клетках аденомы паращитовидной железы), по данным VannoPortal – FOXA1 (в клетках простаты), SPIB (в костном мозге), GATA4 и FOXA2 (в коже). С регионом локализации rs709816 в гене NBN связывается ряд белков: ZSCAN4, CEBPD, CEBPA (JASPAR); E2F1 (ORegAnno); AR, MYC, POLR2A, BRD4 (VannoPortal). Область локализации rs473297 в гене MRE11 совпадает с сайтом связывания SMARCA4 (ORegAnno); ARID1A, FOXA2, GATA3, GATA4, GATA6 (VannoPortal) (http:// www.mulinlab.org/vportal/index.html, https://www. encodeproject.org/, https://jaspar.genereg.net/, http:// www.oreganno.org/).

Только для трех изученных маркеров (5'UTR генов NBN, LIG1, ATM) списки связываемых с областью их локализации белков частично пересекаются (рис. 4). Для rs1805800 выявлено связывание нуклеотидной последовательности с TFEB (JASPAR); SMARCA4 и CTCF (ORegAnno); CTCF (в 150 тканях), H2AZ, EP300, SNAI2, SMC3, NR3C1 (VannoPortal); CTCF (в 187 тканях) и еще 8 TF (в 1‒5 тканях) (ENCODE). Таким образом, в трех из проанализированных ресурсов содержится информация о связывании этой нуклеотидной последовательности с транскрипционным репрессором CTCF. В регионе rs20579 (в гене LIG1) зарегистрировано связывание MITF (ORegAnno); H2AZ, MITF, FOXP1 (VannoPortal). В двух базах в этом регионе зарегистрировано связывание MITF.

Наибольшее число ДНК-белковых взаимодействий зарегистрировано для региона, в котором находится rs189037 (ген ATM). В ресурсе JASPAR для этой области показано взаимодействие с факторами ZNF263, SP5 и ZNF148. Согласно ORegAnno, ДНК в этом регионе ассоциирована с SMARCA4, RBL2, RB1, ZNF263, CTCF и MITF. С этой областью взаимодействует 156 TF по данным ENCO-DE, 517 ‒ по данным VannoPortal; для двух последних ресурсов 118 белков общие. В списках сразу трех ресурсов встречаются SMARCA4, RB1, CTCF, MITF (ORegAnno, ENCODE, VannoPortal) и ZNF263 (ORegAnno, JASPER, VannoPortal); из них к TF, связываемым в широком спектре тканей, относится только CTCF (рис. 4).

Как можно заметить, для двух промоторных регионов (rs1805800 и rs189037) характерно связывание с CTCF. Это CCCTC-связывающий фактор, играющий важную мультифункциональную роль в ремоделировании хроматина [12, 25]. Хорошо известна роль CTCF в связывании инсуляторных последовательностей, поэтому можно предположить, что именно эта функция CTCF наиболее значима в данных локусах.

В то время как результаты, полученные с помощью методов биоинформатического анализа, указывают на наличие возможности связывания с ДНК определенных TF, методы иммунопреципитации хроматина показывают реально существующие связи, но в отдельных клетках/тканях на определенной стадии развития, в определенном физиологическом состоянии и с определенной нуклеотидной последовательностью. В связи с этим отсутствие экспериментального подтверждения теоретических расчетов нельзя рассматривать как доказательство отсутствия такого взаимодействия в принципе ‒ просто оно не зарегистрировано в проанализированных биообразцах. Мы сопоставили результаты биоинформатического анализа и данные ChIP-seq для исследованных маркеров. Только для rs189037 выявлено совпадение TF и других белков хроматина, аффинность которых к сайтам связывания теоретически изменяется в результате нуклеотидной замены и связывание которых с этим регионом имеет экспериментальное подтверждение. Для аннотированных в базе JASPAR TF не выявлено изменений аффинности к мотивам связывания, а для ряда TF, аннотированных в трех других базах, такие мотивы идентифицированы (табл. 3).

Экспериментально выявляемые регионы ДНК-белковых взаимодействий достаточно протяженны (среди проанализированных их длина составила 152‒1975 п.н.). Длина рассчитанных теоретически мотивов значительно короче (8‒20 п.н.). Для всех потенциально изменяющихся мотивов подтверждена их локализация внутри региона взаимодействия (на рис. 5 в качестве примера приведены данные для мотивов четырех TF). Таким образом, нуклеотидная замена в ДНК может приводить к изменению аффинности связывания соответствующих TF и тем самым определять эффективность их функционирования. Кроме того, при наличии альтернативного аллеля биоинформатические ресурсы предсказывают появление de novo сайтов связывания TF, предполагающих появление новых регуляторных контуров. Появление таких сайтов предсказано для всех изученных SNP. Непонятно, реализуется ли эта возможность, но с учетом тканеспецифичности широкого спектра TF можно определить, какие ткани могут быть мишенями в этом случае.

Рис. 5.

Локализация изменяемых мотивов связывания транскрипционных факторов в регионах иммунопреципитации соответствующих белков в различных тканях (составлено по данным Polympact и VannoPortal). Вертикальная полоса представляет собой теоретически рассчитанный изменяемый мотив, цветные горизонтальные полосы – экспериментально выявленные регионы ДНК-белковых взаимодействий в различных тканях. Ось Х представляет собой длину мотивов связывания TF (в нуклеотидах); за нулевую отметку принято положение теоретически рассчитанного изменяемого мотива. Ось Y – ткани, в которых с помощью иммунопреципитации хроматина показано связывание этих TF (число тканей составляет 1457, 912, 89 и 11 для CTCF, RAD21, MYC и USF1 соответственно).

Таким образом, разнообразие изменяемых мотивов связывания TF может объяснить роль исследованных SNP в качестве QTL-вариантов. Так, например, с регионом локализации rs1189037 (в гене АТМ) связывается фактор USF1 (http://www. mulinlab.org/vportal/index.html), регулирующий экспрессию широкого спектра генов метаболизма липидов и глюкозы [26, 27]. В литературе описана мутация в гене USF1, приводящая к семейной гиперлипидемии [28], из чего можно сделать вывод о его важной роли в детерминации уровня липидов. rs1189037 меняет аффинность связывания USF1. Так, согласно ресурсу GWAS4D, при наличии альтернативного аллеля появляется новый, ранее не существовавший мотив связывания этого TF с локализацией 11:108093828–108093837; согласно ресурсу Polympact, увеличивается аффинность пяти вероятных мотивов и появляется один новый (с точкой старта в 11:108093826). Таким образом, при наличии альтернативного аллеля сродство TF к последовательности ДНК усиливается, что может влиять на эффективность его функционирования. Следовательно, этот путь может быть еще одним механизмом, объясняющим ассоциированность rs1189037 с липидными показателями у больных ИБС [7]. Вместе с тем вышеприведенная информация указывает на то, что рассматриваемые маркеры при ассоциативных исследованиях могут отражать участие в патологическом процессе не только “своего” гена, но и тех, в регуляции функционирования которых они принимают участие.

АДАПТОГЕННЫЙ И ПАТОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ АНАЛИЗИРУЕМЫХ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ

Межвидовые сравнения свидетельствуют о высоком уровне консервативности четырех из девяти проанализированных локусов. В первую очередь это касается SNP в кодирующем регионе гена ATM – rs1801516, для которого консервативность у позвоночных определена с помощью всех анализируемых алгоритмов (табл. 4). Немногим ниже уровень консервативности rs1799977 – замены в кодирующем регионе гена MLH1: методом PhyloP (измеряет эволюционную консервативность отдельных последовательностей ДНК) выявлена высокая консервативность у млекопитающих и позвоночных в целом, но не у приматов. Методами PhastCons, GERP⁺⁺ консервативность этого локуса на разных эволюционных уровнях подтверждена (табл. 4). Можно предположить, что данный регион в ходе эволюционной истории стал изменяться именно у приматов.

Таблица 4.  

Эволюционная роль изученных полиморфных вариантов генов, кодирующих белки систем репарации ДНК

[i] ^a Показатели PhyloP и PastCons оценивают эволюционную консервативность на основании межвидовых сравнений, за исключением человека (приставки обозначают классификационные ранги: ver – позвоночные, mam – млекопитающие, pri – приматы). Балл PhyloP соответствует ‒lg p-value нулевой гипотезы нейтральной эволюции; положительные значения (до 3) указывают на очищающий отбор, а отрицательные значения (до ‒ 14) свидетельствуют об ускоренной эволюции консервативных (и, следовательно, вероятно функциональных) элементов [29, 30]. Показатели PhastCons оценивают вероятность того, что локус содержится в консервативном элементе, варьируют от 0 до 1 и отражают вероятность отрицательного отбора [30‒32]. Оценки GerpN и GerpS основаны на анализе отдельных нуклеотидов: высокое значение GerpN указывает на высокую гомологию локуса у разных видов; положительные значения GerpS ‒ на дефицит замен, отрицательные – на их избыточность ‒ и оценивают уровень “ненейтральности” локуса [30, 33]. FitCons оценивает вероятность того, что нуклеотид в данном положении влияет на приспособленность (на основании метода INSIGHT); показатель варьирует от 0 до 1 [34]. bStatistic ‒ оценка фонового отбора, указывающая на ожидаемую долю нейтрального разнообразия, присутствующего на соответствующем участке: значения, близкие к 0, означают почти полное удаление разнообразия в результате отбора; значения, близкие к 1, указывают на незначительный эффект отбора на разнообразие.

^b Score – оценка, полученная для каждого варианта с помощью использованного алгоритма; Phred Score – показатель качества полученной оценки (значение ≥20 соответствует вероятности ошибки 1%). Цифры в светло-серой заливке отображают вероятно консервативные точки генома; в темно-серой заливке – высокое влияние на приспособленность; светло-серая заливка с жирным шрифтом указывает на сильный фоновый отбор, темно-серая с белым шрифтом – локус находится под положительным отбором, черная – локус высоконейтрален.

Несколько менее выражена консервативность промоторной последовательности гена ATM – для rs189037 устойчивое сохранение последовательности выявлено с помощью анализов PhyloP и GERP⁺⁺, но не PhastCons (определяющего вероятность того, что каждый нуклеотид принадлежит консервативному элементу) (табл. 4). Напротив, для rs560191 в гене TP53BP1 консервативность определена методом PhastCons на различных уровнях, но PhyloP подтверждает ее наличие только у приматов, а оценки GERP⁺⁺ ‒ наличие высокой гомологии у разных видов (табл. 4). Статистика GerpN (оценивающая сохранение последовательности у видов) определяет как консервативные наибольшее число проанализированных локусов (rs560191, rs709816, rs189037, rs1801516, rs1799977, rs1805321), причем только этот метод считает “вероятно консервативными” rs709816 (в гене NBN) и rs1805321 (в гене PMS2) (табл. 4). Согласно всем видам анализа, к консервативным не относятся промоторные регионы генов NBN (rs1805800), MRE11 (rs473297) и LIG1 (rs20579).

Не все полученные оценки хорошо согласуются между собой. Так, показано, что 7 из 9 изученных SNP оказывают выраженное влияние на приспособленность (согласно оценкам пригодности FitCons), в том числе и “высоконейтральный” rs20579. В то же время локус rs473297, находящийся под действием позитивного отбора (то есть замена в этом локусе, вероятно, имеет некоторые адаптивные преимущества), оценки FitCons определяют как не оказывающий влияния на приспособленность. Интересно, что действие фонового отбора зарегистрировано для четырех локусов: обеих замен в гене ATM и несинонимичных замен в генах TP53BP1 и MLH1 (табл. 4). Фоновый отбор показывает воздействие не на сами анализируемые локусы, а на тесно сцепленные с ними, то есть консервативность этих регионов может быть связана не столько (или не исключительно) с важной ролью именно анализируемых последовательностей, но и быть следствием сцепления. В пользу этого свидетельствует тот факт, что почти во всех генах, в которых локализованы рассматриваемые SNP, описаны мутации, приводящие к моногенным заболеваниям (за исключением TP53BP1). Это такие патологии, как атаксия-телеангиэктазия и сходное с ней заболевание (Ataxia-telangiectasia-like disorder 1 ‒ заболевание, подобное атаксии-телеангиэктазии, типа 1), вызываемые мутациями в генах AТМ и MRE11 соответственно; синдром хромосомных поломок Ниймеген (мутации в гене NBN); синдром Линча и синдром Туркота (причина которых ‒ мутации и в MLH1, и в PMS2), синдром Мюир‒Торре (мутации в гене MLH1); аутосомно-рецессивный иммунодефицит-96 (мутации в LIG1) (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/omim/?term).

С позиций “менделевского кода” полиморфные варианты в генах менделевских заболеваний могут оказаться значимыми для многофакторных патологий, в которых задействованы те же биохимические пути. Замечено, что по результатам полногеномных ассоциативных исследований наиболее значимые ассоциации нередко выявляют с маркерами, локализованными вблизи генов менделевских заболеваний, причем наблюдается некоторое перекрывание фенотипических проявлений изучаемых моногенных и сложнонаследуемых заболеваний [35]. Считается, что до четверти генов, мутации в которых приводят к менделевским заболеваниям, ассоциировано и с многофакторной патологией [36]. С этой точки зрения изучаемые маркеры перспективны для ассоциативного анализа широкого спектра патологий.

Оценки патогенности исследованных SNP неоднозначны. С одной стороны, данные по оценкам патогенности несинонимичных вариантов, полученные на основании широкого спектра наиболее часто используемых алгоритмов, подтверждают отсутствие патологически значимых нарушений белковых молекул вследствие указанных нуклеотидных замен (табл. 5). С другой стороны, геномная оценка патогенности (по regBase [37]) указывает на вероятность вовлеченности в патологические процессы всех анализируемых вариантов (табл. 6). В наибольшей степени это касается SNP в генах ATM (rs189037 в 5'UTR, rs1801516 в экзоне 37) и MLH1 (rs1799977 в экзоне 8). Можно предположить, что геномные оценки патогенности отображают вероятность вовлеченности маркера в развитие многофакторной патологии. Оценки онкогенности также указывают на вероятность “драйверного” эффекта (likely cancer driver) данных нуклеотидных замен для развития онкопатологии (табл. 6).

Таблица 5.  

Оценка патогенности несинонимичных нуклеотидных замен^a

^a Представлены данные по статусу патогенности миссенс-вариантов, полученные с помощью различных алгоритмов оценки, аккумулированные в dbNSFP (составлено по данным VannoPortal, http://www.mulinlab.org/vportal/index.html). В зависимости от алгоритмов и решаемых с их помощью задач статус патогенности оценивали в разных терминах. В таблице сохранена исходная терминология: к благоприятным вариантам относятся Tolerated, Benign, Neutral, Polymorphism automatic, Low; к неблагоприятным ‒ Deleterious, Damaging.

Таблица 6.  

Геномная оценка патогенности и онкогенности нуклеотидных замен^а

^а Суммированы данные по геномной оценке патогенности и онкогенности, полученные с помощью различных часто используемых алгоритмов оценки некодирующих вариантов, заархивированных в базе данных regBase (RegBase_PAT и RegBase_CAN) [24, 37]. Составлено на основании информации в VannoPortal (http://www.mulinlab.org/vportal/index.html). Светло-серые блоки – оценка “вероятно патогенный”, темно-серые – “вероятный фактор развития рака”.

Следует отметить, что вовлеченность данных маркеров в развитие многофакторной патологии в литературе обсуждается мало. Так, в базе DisGeNet (https://www.disgenet.org/) отсутствует информация относительно rs1805800, rs473297, rs1805321 в контексте привлечения их к ассоциативному анализу при любых патологиях. Только с точки зрения вовлеченности в развитие онкопатологии и/или ее осложнений изучают rs560191, rs709816, rs1801516 и rs20579. Преимущественно при онкопатологии изучают также rs189037 и rs1799977, хотя анализировали вовлеченность rs1799977 в развитие язвенного колита [38, 39], rs189037 ‒ в развитие сердечно-сосудистой патологии, азооспермии, когнитивных нарушений [40‒43]. В отношении всех рассматриваемых маркеров результаты ассоциативных исследований противоречивы, в некоторых случаях обсуждается вероятность этноспецифических особенностей ассоциаций (https://www.disgenet.org/).

Таким образом, всесторонний анализ изучаемых локусов дает большой объем дополнительной информации, которая может быть полезной для объяснения результатов ассоциативных исследований и более адекватной оценки патологического и адаптогенного потенциала изучаемых локусов. Результаты проведенного анализа указывают на высокий регуляторный потенциал рассматриваемых локусов. Так, показано, что большинство из них находится в составе крупных блоков сцепления QTL-SNP, оказывающих влияние на уровни экспрессии широкого спектра генов (например, rs560191 является eQTL для 20 генов), а влияние этих замен может сказаться не только на изменении генной экспрессии в целом, но и на сплайсинге. Выявлен возможный эффект варианта rs189037 на усиление топологической роли включающего его хромосомного региона. Показано, что рассматриваемые маркеры при ассоциативных исследованиях могут отражать участие в патологическом процессе не только “своего” гена, но и тех генов, в регуляции которых они принимают участие.

Работа выполнена при частичном финансировании Госзадания Министерства науки и высшего образования (№ 122020300041-7).

Этические нормы соблюдены. Обзор написан с использованием открытых публикаций.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.