Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 2, стр. 178-184

ВВЕДЕНИЕ

Исторически сложилось так, что положение организмов в системе живой природы определялось их внешним подобием друг другу, прежде всего сходством строения (классический подход). С появлением молекулярной биологии и компьютеров положение организмов стало почти полностью определяться генетическим сходством (молекулярно-биологический подход). Оба подхода оперируют разными типами исходных данных (континуальные морфологические признаки и символьные последовательности соответственно), что предопределило их различное представление при компьютерном анализе, а также характер используемых методов. В классическом подходе – это геометрическое пространство, одномерное или многомерное, осями которого являются признаки, и в которое помещены объекты. Различия между объектами отображаются расстояниями в этом пространстве. На сегодняшний день основными способами анализа считаются линейные многомерные методы типа главных компонент (PCA, MR, DA, CCA и их PLS-аналоги) и нелинейные – типа неметрического шкалирования (NMDS, t-SNE, UMAP). В молекулярно-биологическом подходе сначала превалировал кластерный анализ на основе матрицы расстояний между последовательностями (UPGMA, NJ, ME), а сейчас чаще используется прямое моделирование филогенетического дерева (MP, ML). В результате всегда получаются дендрограммы, т.е. деревья кластеров. По сути, речь идет о противопоставлении непрерывного и дискретного подходов.

Мы полагаем, что оба подхода не противоречат друг другу и их можно и желательно использовать совместно. Разница в типах исходных данных не является препятствием. Поскольку имеется матрица расстояний, последовательности всегда можно представить точками в многомерном пространстве и, следовательно, описать геометрически. Обязательно нужно учитывать дискретность. На любом шаге кластеризации все объекты разделены на несколько непересекающихся кластеров. Для каждого кластера можно вычислить центроид. Для каждого объекта можно вычислить отклонение от центроида своего кластера. В результате общая изменчивость распадется на межвыборочную и объединенную внутривыборочную изменчивость. Все варианты изменчивости можно исследовать с помощью обоих подходов – и классического (непрерывного, геометрического), и молекулярно-биологического (дискретного, кластерного).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы. Из GenBank (NCBI) [1] взяты аминокислотные последовательности митохондриального белка цитохрома b (Cytb), по одной для каждого вида млекопитающих отряда Rodentia Северного полушария Старого Света, у которых в описании присутствовала опция “lat_lon”, всего 61 вид. Дополнительно в качестве внешней группы взяты шесть последовательностей семейства Ochotona отряда Lagomorpha. Все 67 последовательностей были выравнены с помощью пакета MEGA 11 [2]. Последняя 380-я позиция из-за неполноты данных удалена. Во избежание разночтений использовали таксономическую принадлежность последовательностей, указанную в GenBank. Кроме того, из базы данных AAindex взяты 553 индекса физико-химических свойств 20 протеиногенных аминокислот (далее AA-индексы) [3].

Методы. Все AA-индексы были предварительно стандартизированы (центрированы и нормированы). Для каждого AA-индекса в матрице аминокислотных последовательностей каждая аминокислота заменена на соответствующее значение физико-химического свойства и по полученной числовой матрице рассчитана матрица квадратов межвидовых евклидовых расстояний размера 67 × 67. Все 553 матрицы квадратов расстояний суммированы, и в суммарной матрице из каждого элемента извлечен квадратный корень. Эта процедура эквивалентна вычислению евклидовых расстояний между 67 видами по 209 587 (379 × 553) признакам. Далее по матрице межвидовых евклидовых расстояний методом главных координат вычислены главные компоненты [4]. Для однорангового разбиения на кластеры выбран уровень подсемейств, поскольку даже на родовом уровне молекулярная систематика млекопитающих все еще не устоялась. По матрице главных компонент вычислены центроиды всех подсемейств и для каждого вида вычислено отклонение от центроида своего подсемейства. Этот способ предложил Фишер в методах ANOVA и MANOVA [5, 6]. Идея состоит в том, что из общей изменчивости вычитается межгрупповая и остается внутригрупповая изменчивость, в которой межгрупповая отсутствует. Обе изменчивости по построению отображаются в пространства, ортогональные друг другу. В нашем случае общая матрица главных компонент раскладывается на межтаксонную и объединенную внутритаксонную (таксоны − подсемейства). Для каждой новой матрицы снова вычислена матрица евклидовых расстояний между видами и ее главные компоненты. Сумма квадратов расстояний между двумя видами в новых матрицах равна квадрату расстояния между ними в общей матрице, а главные компоненты новых матриц в совокупности ортогональны друг другу. Таким образом получается ортогональное разложение общей межвидовой матрицы расстояний на две новые, каждая размером 67 × 67. Одна характеризует изменчивость между подсемействами, точнее, между их центроидами, а вторая – изменчивость, которая получится из общей, если совместить центроиды всех 10 подсемейств и собрать вместе их внутривыборочную изменчивость. По всем трем матрицам расстояний методом Варда проведен кластерный анализ, построены дендрограммы и тем самым получено ортогональное разложение общей дендрограммы на две другие, межтаксонную и объединенную внутритаксонную. Точно так же для всех трех матриц главных компонент вычислены корреляции с внешними факторами, в данном случае, широтой и долготой. Расчеты проведены с помощью пакетов MEGA 11 [2], PAST4 [7] и Jacobi4 [8].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Из табл. 1 видно (столбцы Sum, последняя строка), что доля всей межтаксонной изменчивости в общей составляет 68.3% (71.32/104.48). Видно также (столбцы λ), что первые компоненты общей изменчивости почти полностью соответствуют межтаксонной изменчивости. Суммарное число главных компонент не изменилось (9 + 56 = 65), но произошло перераспределение дисперсий.

Таблица 2.  

Коэффициенты корреляции (×1000) с широтой (lat) и долготой (lon) первых 9 главных компонент трех матриц межвидовых расстояний

Примечание: All – общая, Inter – межтаксонная, Intra – объединенная внутритаксонная. *p < 0.05; *⁵p < 10^–5.

Из табл. 2 видно, что высокую и достоверную корреляцию с широтой (p < 10^–5; N = 67) демонстрируют вторые главные компоненты общей и межтаксонной изменчивости.

Очевидно, что это одна и та же корреляция, но в данном случае мы видим, что она целиком относится именно к межтаксонной изменчивости и никак не проявляет себя во внутритаксонной. Корреляции на первом уровне значимости можно не принимать во внимание.

На рис. 1а–в приведено расположение видов на плоскости главных компонент всех трех вариантов изменчивости. Учитывая, что с широтой коррелирует именно вторая компонента, возможно, что на рис. 1а, б мы наблюдаем последствия давнего отбора под влиянием среды, причем в двух расходящихся направлениях. Ochotona расположилась, хотя и близко, но все же за пределами отряда Rodentia. Что касается первой компоненты, на которую приходится более четверти общей межтаксонной изменчивости, то ее содержательный смысл еще предстоит выяснить.

Рис. 1.

Расположение видов на плоскости главных компонент. а – Первые две компоненты общей изменчивости; б – первые две компоненты межтаксонной изменчивости; в – первые две компоненты внутритаксонной изменчивости; г – первые компоненты межтаксонной и внутритаксонной изменчивости. Allactaginae; Arvicolinae; Cricetinae; Dipodinae; Leithiinae; Murinae; Ochotonidae; Sicistinae; Spalacinae; Xerinae.

Объединенная внутритаксонная изменчивость (рис. 1в) “размазана” на много компонент с маленькими дисперсиями. Можно предположить, что главное направление изменчивости внутри каждого таксона формируется так, чтобы меньше пересекаться с остальными таксонами, живущими на той же территории. В частности, подсемейство Arvicolinae явно образовало свою собственную компоненту. При этом один вид (Arvicola amphibius) вообще отделился от всех в другую сторону.

На рис. 1г четко видна ортогональность внутри- и межтаксонной изменчивости. Показаны только первые компоненты, но такая же картина получается на всех рисунках, на которых противопоставлены внутри- и межтаксонные главные компоненты (не приведено).

Ортогональное разложение общей матрицы расстояний позволяет ортогонально разложить не только главные компоненты на блоки, соответствующие разным вариантам изменчивости, но и дендрограммы (рис. 2а–в). Поскольку по каждой матрице расстояний каким-либо алгоритмом кластерного анализа можно вычислить дендрограмму, мы автоматически получаем ортогональное разложение дендрограммы, отражающей общую изменчивость (1а), на две дендрограммы, отражающие межтаксонную и внутритаксонную изменчивость по отдельности (1б и 1в соответственно).

Рис. 2.

Ортогональное разложение общей дендрограммы (а), характеризующей сходство аминокислотных последовательностей цитохрома b, на межтаксонную (б) и объединенную внутритаксонную (в) дендрограммы.

Очевидно, что на рис. 1а–в отражена та же самая многомерная изменчивость, что и на рис. 2а–в, только первые показывают взаимное расположение видов в пространстве и направления их изменчивости, а вторые – сходство видов и их объединений между собой. Таким образом, главные компоненты и дендрограммы дополняют друг друга, позволяя составить более точное представление об изучаемой совокупности объектов. Преимущество дендрограмм заключается в том, что они легко отображают сходство объектов в пространстве любой размерности, просто ее игнорируя, а компоненты, из-за особенностей человеческого восприятия, приходится рассматривать попарно, максимум, по три. С другой стороны, дендрограммы не способны адекватно отобразить корреляцию с внешними факторами, из-за этого приходится наносить кластеры прямо на географические карты. Это наглядно, но непригодно для дальнейшей обработки.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Основной результат – это высокая статистически значимая корреляция второй главной компоненты (17.05% межтаксонной изменчивости) с широтой и отсутствие этой корреляции у первой главной компоненты со значительно большей дисперсией (39.48%). Безусловно, нужно учитывать, что исследуемый массив признаков, более 200 тыс., строго говоря, не представляет именно молекулярную изменчивость, хотя и получен оцифровкой набора молекулярных последовательностей. Считается, что физико-химические свойства аминокислот по своей природе ближе не столько к структуре, сколько к функции белков, тем более, что цитохром b участвует, наряду с другими митохондриальными белками, в самой важной биохимической функции: обеспечении организма энергией.

Митохондриальный ген cytb в настоящее время является основой молекулярной таксономии организмов. Долгое время он считался селективно нейтральным. Однако в последнее время это утверждение все чаще подвергается сомнению и выявляются адаптивные компоненты изменчивости кодируемых им аминокислотных последовательностей цитохрома b [9–12].

Несмотря на все разнообразие адаптаций к широкому спектру экологических условий, имеющихся в классе млекопитающих, существуют базовые механизмы функционирования организма, общие для всего класса в целом. Из этого следует, что при адаптации к сходным условиям можно ожидать некоторого сходства эволюционных путей в различных группах, например, перестройки энергетического метаболизма системы клеточного дыхания при адаптации к условиям гипотермии. Это сходство может, в частности, проявляться в одних и тех же мутациях в аминокислотных последовательностях разных видов. В таком случае логично ожидать, что такие мутации должны вызывать и сходные изменения физико-химических свойств самих аминокислотных последовательностей. Обычно вычисляют соотношения синонимичных и несинонимичных различий между нуклеотидными последовательностями или анализируют радикальные аминокислотные замены (т.е. замену на аминокислотный остаток с радикально иными физико-химическими свойствами). Для учета внешних факторов, на которые предположительно идет отбор, обычно подбирают пары контрастных условий, например, высокогорье и равнина, подземный и наземный образ жизни, пресноводные и соленые водоемы и т.д. Для общего представления о близости последовательностей практически всегда вычисляют филогенетические деревья либо на основе матрицы расстояний и алгоритмов кластерного анализа, либо прямым моделированием множественных деревьев и выбирают наиболее подходящее методами максимальной парсимонии или максимального правдоподобия. Считается, что поиски проявлений адаптивной эволюции на высоких таксономических уровнях бесперспективны, так как в этом случае и сходство, и различия между видами очевидно определяются, в первую очередь, степенью их филогенетического родства. Поэтому поиски проявлений адаптивной эволюции в молекулярных последовательностях обычно ведутся внутри близкородственных видов или даже на внутривидовом уровне.

Давно известное в классической математической статистике ортогональное разложение общей изменчивости на межвыборочную и внутривыборочную позволяет искать эти проявления на любых таксономических уровнях. То, что корреляция с широтой (а это, безусловно, следствие корреляции со средой) нашлась на уровне подсемейств, подтверждает перспективность подобных поисков. Более того, выявляемое первой главной компонентой четкое разделение на две группы (рис. 1a, 2a), не совпадающее с таксономическим, указывает на возможную физико-химическую подоплеку различий между ними. Это требует дальнейших исследований.

Работа выполнена в рамках бюджетного проекта Института цитологии и генетики СО РАН FWNR-2022-0019 Министерства науки и высшего образования Российской Федерации.

Выражаем искреннюю признательность рецензенту и редактору выпуска за полезные замечания.

Процедур с участием людей и животных не было.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.