Российские нанотехнологии, 2020, T. 15, № 1, стр. 72-78

ВВЕДЕНИЕ

Астаксантин (3,3'-дигидрокси-β,β'-каротин-4,4'-дион) – ярко-красный природный жирорастворимый кетокаротиноид, обладающий высокой антиоксидантной активностью. Наличием данного пигмента обусловлена окраска лососевых рыб, обнаружен астаксантин у ракообразных и микроорганизмов: представителей бактерий, микроводорослей, дрожжей [1].

Астаксантин можно выделить из упомянутых выше природных источников или получить синтетическим путем. Однако синтетический астаксантин законодательно разрешен для применения только в качестве пищевой добавки для рыб [2]. Для более широкого применения с целью удовлетворения потребностей человека в качестве компонента пищевых продуктов, в косметической и фармацевтической промышленности используется природный астаксантин, основным коммерческим продуцентом которого является микроводоросль Haematococcus pluvialis [3, 4].

Биологическая активность астаксантина, доказанная в опытах как in vitro, так и in vivo, вызвала большой интерес в связи с перспективным использованием данного каротиноида для профилактики и лечения широкого спектра заболеваний [5, 6].

Доказано положительное воздействие астаксантина на состояние кожи человека, в том числе защита от фотостарения под воздействием УФ-лучей [7, 8]. Показано, что астаксантин обладает противовоспалительными, иммуномодулирующими свойствами, оказывает проапоптотическое и противоопухолевое действие [9, 10].

Согласно данным [11–13] антиоксидантная эффективность астаксантина может быть связана с сопряженными двойными связями в молекуле. Однако из-за своей ненасыщенной структуры астаксантин чувствителен к температуре, окислению, воздействию света в процессе производства и хранения. Нестабильность астаксантина вызывает снижение его биологической активности, что существенно ограничивает его использование.

Согласно литературным данным для повышения стабильности и биодоступности астаксантина весьма эффективна инкапсуляция: получение различных эмульсий, коллоидных дисперсий, суспензий и наночастиц. Для коммерческого использования и применения в случае фармпрепаратов важна скорость высвобождения инкапсулированного материала, при этом необходимо, чтобы системы доставки оставались физически и химически стабильными при воздействии различных сред, хранении, транспортировке, а также способствовали увеличению срока годности конечного продукта [14].

Эмульсии масло-в-воде (O/W) представляют собой смесь дисперсной и непрерывной фазы в четко определенной объемной доле. В O/W-эмульсиях астаксантин растворяется в масляной фазе.

Большинство методов эмульгирования, в основе которых лежит высокое напряжение сдвига, таких как гомогенизация под действием высокого давления, ультразвуковая гомогенизация, механическое диспергирование, сопровождаются нагревом эмульсионной системы во время процесса инкапсулирования, что может привести к преждевременной деградации каротиноидов, в том числе астаксантина. Кроме того, сложность в регулировании и подборе оптимальных параметров процесса позволяет создавать полидисперсные системы, которые могут иметь низкую стабильность и снижать эффективность инкапсулирования [15]. Для повышения монодисперсности и ограничения теплового воздействия в последние десятилетия были разработаны многочисленные микрофлюидные устройства.

Микрофлюидная система представляет собой компактное устройство, позволяющее работать с небольшими количествами (нанолитровый объем) при использовании каналов с размерами 10–100 мкм [16]. Использование микрофлюидных устройств в процессе эмульгирования имеет преимущества благодаря “мягким” условиям проведения процесса, высокой пропускной способности и более точной способности контролировать параметры процесса.

Кроме того, микрофлюидные устройства характеризуются высокой производительностью, определяемой геометрией каналов (ширина, глубина), вязкостью фаз, свойствами смачивания поверхности канала, соотношением скорости потоков несмешивающихся фаз и межфазным натяжением [17].

Таким образом, микрофлюидное эмульгирование является одним из наиболее интересных и перспективных методов, позволяющих проводить процесс эмульгирования в “мягких” условиях, не нарушая структуру и свойства инкапсулированного соединения, регулировать параметры процесса, в результате чего можно получить стабильные капли.

Цель данной работы – изучение возможности использования микрофлюидной системы для получения стабильных O/W-эмульсий, масляная фаза которых содержит пигменты микроводоросли H. pluvialis IPPASH-629, оценка стабильности полученных эмульсий и сохранности включенного в их состав астаксантина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. Используемые в работе пигменты были выделены из биомасcы микроводоросли H. pluvialis IPPASH-629 (коллекция микроводорослей Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН).

Культивирование проводили на питательной среде OHM (optimal Haematococcus medium) [18] следующего состава (г/л): KNO₃ – 0.41, Na₂HPO₄ – 0.03, MgSO₄ ⋅ 7H₂O – 0.246, CaCl₂ ⋅ 2H₂O – 0.11; микроэлементы (1 мл/л): биотин – 25 мкг/л; тиамин – 17.5 мкг/л; приготовленной на дистиллированной воде без добавления витаминов, начальное значение pH среды 6.5–6.7.

Выращивание проводили в колбах Эрленмейера на 250 мл, затем на 1000 мл и в итоге 5000 мл при постоянном освещении люминесцентными лампами дневного света. Вегетативные клетки выращивали при 2.5 Вт/м² ФАР (фотосинтетически активная радиация), затем культуру переносили на 50 Вт/м² ФАР и культивировали в течение восьми суток при непрерывном барботировании смесью CO₂ и воздуха (1:99) при температуре 24 ± 2°C. Клетки микроводорослей отделяли центрифугированием и до проведения анализов хранили при –20°С.

Экстракция. Выделение суммарных пигментов проводили согласно [19]. Суммарные каротиноиды получали путем омыления биомассы микроводоросли 5%-ным раствором КOH в 30%-ном метаноле (70°С, 5 мин) [20]. Свободный астаксантин получали ферментативным гидролизом согласно [21].

Состав пигментов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на жидкостном хроматографе Agilent Technologies (США) модели 1200 с DAD-детектором; колонка Kromasil C18 (5 мкм, 150 × 4.6 мм); подвижная фаза: ацетонитрил–дихлорметан–вода (7:2:1, v/v); скорость потока 1 мл/мин; объем вводимой пробы 8 мкл; УФ-детектирование при 476 и 458 нм [22].

Количественное определение астаксантина проводили спектрофотометрически (спектрофотометр Thermo Scientific Genesys 10S UV-Vis, США), содержание (мг/мл) рассчитывали по формуле [23]:

где A – оптическая плотность при длине волны 470 нм; V– объем раствора, мл; $A_{{1~{\text{см}}}}^{{1\% }}$– коэффициент молярной экстинкции, для астаксантина в ацетоне – 2100 $\frac{{{\text{мл}}}}{{{\text{г}}\,{\text{см}}}}$ [24].

Определение состава жирных кислот эфиров астаксантина проводили согласно [25].

Получение эмульсий. Астаксантинсодержащие O/W-эмульсии получали с использованием микрофлюидной установки, состоящей из двух шприцевых насосов (KDS Legato 100 и Legato 110, США) для подачи фаз, микрочипа из полиметилметакрилата с внутренним диаметром каналов 150 мкм и микроскопа Leica EZ4 (Германия) для наблюдения за процессом формирования капель. В качестве дисперсионной среды использовали 5%-ный раствор додецилсульфата натрия (SDS) в деионизированной воде, в качестве дисперсной фазы – 0.5%-ный раствор астаксантина в соевом масле. Перевод пигментов из экстракта в соевое масло осуществляли при непрерывном перемешивании компонентов с постепенным удалением растворителя. Формирование эмульсии проводили при соотношении расходов дисперсионной среды (5% SDS) к дисперсной фазе (соевое масло) 9:1. Полученную O/W-эмульсию собирали в приемник при комнатной температуре.

Концентрацию астаксантина в эмульсии определяли спектрофотометрически после экстракции ацетоном из аликвоты эмульсии по формуле (1).

Эффективность инкапсуляции астаксантина вычисляли как отношение концентрации астаксантина в эмульсии к начальной концентрации астаксантина в масле.

Размер капель определяли с помощью оптического микроскопа (Nikon Eclipse L200ND, Япония) с использованием встроенной программы. Анализ полученных данных проводили в программах Image J и Microsoft Excel 2010. Статистические данные (средний диаметр капель, стандартное отклонение, коэффициент вариации, полидисперсность) получали при обработке не менее 500 капель.

Определение стабильности. Стабильность полученных эмульсий определяли в течение двух месяцев при хранении при комнатной температуре в темноте, контролируя размер капель дисперсной фазы и содержание астаксантина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате качественного и количественного анализа пигментов H. pluvialis установлено, что в составе суммарных пигментов клеток микроводоросли хлорофилл содержится в следовых количествах. Основным каротиноидом является астаксантин, присутствующий главным образом в этерифицированным виде: содержание моно- и диэфировастаксантина составило 66.5 и 24.0% соответственно, содержание свободного астаксантина – 5.05%, суммарное содержание прочих каротиноидов (β-каротина и лютеина) не превышало 5%.

Методом газовой хроматографии был определен состав жирных кислот эфиров астаксантина. Преобладающими являются С₁₈-жирные кислоты (более 50% от суммы жирных кислот), главным образом ненасыщенные: олеиновая С_18:1 (18.00%), линолевая С_18:2 (18.83%) и линоленовая С_18:3 (12.34%). Основной насыщенной кислотой является пальмитиновая С_16:0 (24.81). Близкие результаты по составу жирных кислот представлены в [26].

Согласно литературным данным, при получении астаксантинсодержащих эмульсий используется астаксантин, выделенный из клеток микроводоросли H. pluvialis, как свободный (аналитический, чистотой 97–98%) [27, 28], так и коммерческие масляные растворы астаксантина: AstaReal^®, содержание астаксантина (95% – эфиры астаксантина, 5% свободный астаксантин) в котором составляет 20%, и Zanthin^® с 10%-ным содержанием астаксантина (97% – эфиры астаксантина, 3% – свободный астаксантин) [15, 29].

Поскольку биотехнологическое получение астаксантина в свободной форме из микроводоросли H. pluvialis включает в себя стадию ферментативного гидролиза, что невыгодно с экономической точки зрения, в настоящих исследованиях было проведено сравнение эмульсий трех типов. Тип I содержал суммарные пигменты микроводоросли (аналог коммерческих препаратов), тип II – суммарные каротиноиды, тип III – свободный астаксантин. Дисперсная фаза представляла собой 0.5%-ный раствор астаксантина в соевом масле.

Основным критерием выбора эмульгаторов для получения микроэмульсий является показатель гидрофильно-липофильного баланса (HLB), а также доступность и возможность коммерческого использования эмульгатора в косметических и фармацевтических целях. Для стабилизации прямых эмульсий используют водорастворимые поверхностно-активные вещества (ПАВ) с высокими числами HLB, как правило, в диапазоне от 8 до 18 [30]. В настоящей работе на основе анализа литературных данных в качестве анионного ПАВ был выбран додецилсульфат натрия, характеризующийся высоким числом HLB 40 и критической концентрацией мицеллообразования (ККМ) 8.1 × 10^–3 М.

В ходе предварительных исследований (данные не приведены) были испытаны микрофлюидные ячейки с различной геометрией каналов, подобраны оптимальные параметры (соотношения потоков, концентрация SDS) для получения эмульсий O/W с использованием соевого масла.

Наибольшая эффективность инкапсуляции отмечена для эмульсии, содержащей свободный астаксантин, наименьшая – для эмульсии, содержащей суммарные пигменты (табл. 1).

На рис. 1 представлены полученные образцы эмульсий. На микрофотографиях видно, что для всех образцов капли имеют сферическую форму. Однако в зависимости от вида используемых пигментов эмульсии имеют различное распределение капель дисперсной фазы по размерам (рис. 2, рис. 3).

Распределение капель по размерам образца эмульсии типа I характеризуется наименьшим интервалом 12–98 мкм, при этом больше половины капель имеют размер от 21 до 46 мкм. Эмульсии типа II и III объединяет то, что размер капель образцов находится в более широком интервале 13–130 мкм. С другой стороны, их различие в том, что в образце эмульсии типа II, содержащей главным образом астаксантин в этерифицированной форме, более 50% капель находится в интервале 29–64 мкм, тогда как в образце эмульсии типа III, содержащей свободную форму астаксантина, – в интервале 40–130 мкм. Следует отметить, что все образцы имеют полидисперсное распределение капель по размерам, о чем свидетельствуют величины коэффициентов вариации и степени полидисперсности (табл. 1). Кроме того, для образов эмульсий типа I и III характерно бимодальное распределение капель по размерам.

По-видимому, различие в формировании капель можно объяснить тем, что ацильные фрагменты жирных кислот в моно- и диэфирах астаксантина могут оказывать дополнительное стабилизирующее воздействие на капли за счет гидрофобных взаимодействий с SDS.

При изучении стабильности было установлено, что эмульсии стабильны в течение 56 суток, при этом независимо от типа эмульсии значительных изменений размера капель не наблюдали. Следовательно, в процессе длительного хранения не произошло слияния капель O/W-эмульсий, содержащих астаксантин.

Кроме того, анализ стабильности показал, что при использовании астаксантина в этерифицированной форме (эмульсии с суммарными пигментами и суммарными каротиноидами микроводоросли) содержание инкапсулированного астаксантина остается выше 90% от исходного количества после 56 сут хранения при 25°С, при этом пигмент не подвергался ни изомеризации, ни химической деградации. В то время как в эмульсии, содержащей свободный астаксантин, наблюдается почти двукратное снижение содержание пигмента за этот же период, при этом в спектре поглощения на фоне снижения интенсивности характеристического максимума поглощения астаксантина (470 нм) наблюдали появление и рост дополнительных максимумов поглощения, что свидетельствовало об образовании продуктов окисления астаксантина [31].

Таким образом, представлены результаты исследования практического применения микрофлюидной системы для получения стабильных O/W-эмульсий, содержащих астаксанин. Эмульсия, содержащая суммарные каротиноиды микроводоросли H. pluvialis, главным образом моноэфиры астаксантина, характеризовалась высокой степенью инкапсуляции, наибольшей степенью полидисперсности, концентрация астаксантина осталась практически неизменной после 56 сут хранения при комнатной температуре.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что предлагаемая методика является перспективным способом получения стабильных O/W-эмульсий, содержащих астаксантин, и является отправной точкой для исследования антиоксидантной (биологической) активности полученных эмульсий и подтверждения возможности их применения в составе косметических продуктов.