Российские нанотехнологии, 2020, T. 15, № 1, стр. 89-92

ВВЕДЕНИЕ

Gluconacetobacter sucrofermentas ВКПМ B-11267 филогенетически близки к бактериям Gluconobacter oxydans ВКМ 1280 [1, 2], которые, как показано в [3–5], являются эффективным объектом для формирования микробных биосенсоров. В данном исследовании выясним, насколько клетки G. sucrofermentas ВКПМ B-11267 могут быть эффективны при конструировании биосенсоров; влияет ли присутствие наноматериала на характер поведения клеток и какую роль играет оболочка этой бактериальной клетки – не приводит ли она к значительному росту сопротивления слоя иммобилизованных бактерий и значительной потери сигнала.

Бактерии G. sucrofermentas ВКПМ B-11267 являются продуцентом бактериальной целлюлозы [6, 7]. Бактериальная целлюлоза (БЦ) – перспективный материал для получения широкого спектра продуктов и наноматериалов. Она имеет большой потенциал использования в медицине как биоматериал для тканевой инженерии, создания раневых покрытий и трансдермальных терапевтических систем, может использоваться в диетологии в качестве носителя добавок для сбалансированного питания, в промышленной электронике для получения оптически прозрачных соединений с ультранизким коэффициентом теплового расширения, для изготовления акустических диафрагм, способна служить заменой растительной целлюлозы в производстве бумаги [7, 8]. Бактериальная целлюлоза является перспективным источником получения нанокристаллической целлюлозы и биокомпозитных материалов [9]. В настоящее время БЦ указанных бактерий широко используется для создания микробных топливных элементов [10].

Конечная цель настоящего исследования заключалась в том, чтобы оценить возможность использования БЦ как нового материала для иммобилизации широкого спектра клеток микроорганизмов и белков при формировании рецепторного элемента биосенсоров. На первом этапе изучения необходимо было оценить влияние БЦ на генерируемый бактериальными клетками сигнал, выяснить, могут ли клетки G. sucrofermentas ВКПМ B-11267 являться основой биорецептора. Для получения этих данных использовали биоэлектрохимические методы, а в качестве окисляемого субстрата – этиловый спирт и глюкозу.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение биосенсора. Культивирование бактериальных клеток G. sucrofermentas ВКПМ B-11267 (предоставлены сотрудниками кафедры биотехнологии, биоинженерии и биохимии Мордовского национального исследовательского университета им. Н.А. Огарева) описано в [11]. Для формирования биосенсора использовали 3-контактные электроды, полученные матричной печатью (ООО “КолорЭлектроникс”, Москва, Россия). На рабочий электрод наносили смесь суспензии клеток (1 мг сырого веса/мкл) с 2%-ным раствором хитозана, растворенным в 1%-ной уксусной кислоте [12]. Объемное соотношение в смеси “биокатализатор–хитозан” составляло 1:1. Затем электрод подсушивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Концентрация биокатализатора на поверхности электрода составляла 0.12 мг сырой массы/мм².

Электрохимические измерения. Измерения проводили в 25 мМ калий-фосфатном буферном растворе (рН 6.5), содержащем 10 мМ хлорида натрия. Объем измерительной ячейки составлял 2 мл. В качестве редокс-медиатора использовали 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) в концентрации 40 мкМ. Электрохимические измерения проводили с помощью потенциостата/гальваностата “VersaSTAT 4” с модулем FRA (Princeton Applied Research, США). В качестве модифицирующего материала использовали многостенные углеродные нанотрубки (МУНТ) “Таунит-М” (ООО “НаноТехЦентр”, Тамбов, Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 1 представлены циклические вольт-амперные характеристики клеток G. sucrofermentas ВКПМ B-11267 в присутствии медиатора. Увеличение анодных токов в системе при добавлении 1 мМ этанола свидетельствует о том, что клетки производят активное окисление данного субстрата, что согласуется с аналогичным процессом у бактерий G. oxydans ВКМ 1280. Наличие процессов электронного переноса в системе в присутствии этанола подтвердили с помощью метода электрохимической импедансной спектроскопии (ЭИС). На рис. 2 представлены диаграммы Найквиста для скрин-принт-электродов, содержащих клетки G. sucrofermentas ВКПМ B-11267. Как видно из полученных данных, добавление субстрата снижает общее сопротивление системы и сопротивление переноса заряда более чем в 50 раз (с ~20 МОм до ~400 кОм). Сопротивление переноса заряда определяли как экстраполированную точку пересечения диаграммы с осью Zre (Zre – активное сопротивление) в области низких частот. Измерения проводили в диапазоне частот 40 кГц–0.1 Гц с амплитудой сигнала в 10 мВ.

Рис. 1.

Циклические вольтамперные характеристики скрин-принт-электрода с иммобилизованными клетками G. sucrofermentas в присутствии и в отсутствие 1 мМ этанола.

Рис. 2.

Диаграммы Найквиста для скрин-принт-электродов с клетками G. sucrofermentas в присутствии и в отсутствие 1 мМ этанола. На вставке представлена увеличенная область высоких частот. Zim – мнимое сопротивление.

Была проверена чувствительность бактерий к глюкозе, а также выполнена оценка влияния МУНТ на окислительную активность бактерий.

На рис. 3 представлены калибровочные зависимости для биосенсоров, содержащих клетки G. sucrofermentas ВКПМ B-11267, для двух субстратов – глюкозы и этанола в присутствии и в отсутствие углеродных нанотрубок. Показано, что добавление в систему углеродного наноматериала приводит к резкому росту получаемых сигналов биосенсоров для обоих рассмотренных субстратов. Отметим, что произошло изменение значения Констант Михаэлиса (К_М). Константа Михаэлиса является показателем сродства фермента к субстрату; его увеличение означает снижение сродства фермента к субстрату. Для системы с глюкозой в качестве субстрата значение К_М увеличилось с 0.75 до 1.66, что отображает снижение сродства фермента к субстрату. Для системы с этанолом наблюдали противоположный эффект – снижение значения К_М с 0.87 до 0.26. Эти данные совпадают с данными, полученными ранее для клеток G. oxydans в [5]. Этот эффект может свидетельствовать о том, что различные ферментные комплексы клеток по-разному взаимодействуют с углеродными нанотрубками, и влияние их на фермент может быть как положительным (увеличение сродства к субстрату, как в случае алкогольдегидрогеназы), так и отрицательным (уменьшение сродства к субстрату, как в случае глюкозодегидрогеназы). Полученные данные свидетельствуют о том, что изученные бактериальные клетки могут выступать в качестве биологической основы биосенсоров. Чувствительность биосенсоров и общий уровень сигналов увеличивались для обоих исследованных субстратов.

Рис. 3.

Калибровочные зависимости штамма G. sucrofermentas для стандартных электродов и электродов, модифицированных углеродными нанотрубками (НТ) при использовании глюкозы (1) и этанола (2) в качестве субстратов.

Представленные эксперименты были выполнены с клетками, отделенными от БЦ, выделяемой ими в процессе роста на питательной среде. На рис. 4 приведены сигналы биосенсора на основе клеток G. sucrofermentas, находящихся непосредственно в выделенной ими БЦ. Как видно из рисунка, БЦ не влияет на скорость роста сигнала, т.е. не препятствует прохождению субстрата и медиатора к клеткам и электроду, что предполагает возможность ее использования для создания биосенсора. В то же время при таком способе иммобилизации клеток на поверхности электрода сигнал биосенсора быстро снижается (на вставке показано изменение сигнала в течение шести суток, видно падение сигнала в ~10 раз), что свидетельствует, скорее всего, о вымывании клеток из БЦ на поверхности электрода.

Рис. 4.

Вид сигналов биосенсора на основе клеток G. sucrofermentas, иммобилизованных в БЦ, на введение субстратов (1 – глюкоза, 2 – этанол). На вставке показано изменение сигналов биосенсора на этанол в течение недели (2а – первые сутки, 2б – четвертые сутки, 2в – шестые сутки).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение отметим, что в исследовании ставили задачу получить начальные данные о некоторых биоэлектрохимических характеристиках штамма G. sucrofermentas ВКПМ B-11267, который филогенетически близок к хорошо известному штамму G. oxydans ВКМ 1280. Представленные данные получены впервые. Указанный штамм интересен тем, что в процессе роста генерирует БЦ, которую в дальнейшем можно применять для создания биосенсоров. Показано, что клетки штамма достаточно активны и окисляют глюкозу и этиловый спирт. Выявлено, что сопряжение клеток с МУНТ позволяет получить положительный эффект, проявляющийся в росте тока и снижении общего сопротивления. В дальнейшем планируется выполнить расширенные исследования биоэлектрохимических параметров данного штамма и изучить возможность его эффективного использования в микробных биосенсорах и биотопливных элементах.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 18-49-08005).