Российские нанотехнологии, 2020, T. 15, № 1, стр. 108-117

ВВЕДЕНИЕ

В связи с глобальным изменением климата в северных и восточных территориях расширяется ареал обитания фитопатогенных организмов [1–3]. Одним из таких патогенов является грамположительная бактерия Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms), вызывающая заболевание картофеля – кольцевая гниль [4], которая, согласно новой классификации, обозначается как Clavibacter sepedonicus [5]. У инфицированных растений наблюдается вилт стеблей, пожелтение листьев и значительное снижение урожайности [4]. На сегодняшний день не найдено эффективных методов регуляции численности Cms. Обеззараживающие мероприятия, как правило, носят превентивный характер, включают в себя применение агрессивных агентов. Также осуществляется удаление больных растений с полей ручным методом [6, 7]. В связи с этим важно разработать экологически безопасный способ на основе химических соединений по оздоровлению культурных растений от бактериозов, в частности картофеля от кольцевой гнили.

В качестве потенциальных агентов для этих целей интересно применение нанокомпозитов (НК) – комплекса наночастиц (НЧ) с полимерными матрицами. Такая конструкция соединений является выигрышной, так как в НК токсичные НЧ плотно упакованы в безопасную для растений матрицу природного происхождения и способны высвобождаться под действием экзоферментов бактерий, убивая их. В качестве матриц НК перспективно применение полисахаридов. Это обусловливается не только их безвредностью для человека и животных, но и их антибактериальными свойствами. Имеются сведения об антимикробной активности полисахаридов в отношении патогенов человека и животных, как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов [8, 9]. Считается, что такая активность связана с кислотным разрушением поверхностных структур бактериальной клетки и нарушением адгезии бактерий к субстрату [10, 11].

В качестве матрицы для НЧ в нанокомпозитах перспективно использование крахмала, так как он относится к безопасным для человека и животных растворимым пищевым волокнам. Кроме того, он является наиболее предпочтительным питательным субстратом для Cms. Имеются исследования биологической активности веществ с использованием крахмала. Так, на основе очищенного кукурузного крахмала было синтезировано новое биологически активное вещество – сульфаминовое производное, обладающее антимикробным эффектом в концентрации 50 мг/мл к следующим микроорганизмам: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Streptococcus faecalis и Streptococcus pyogenes [12]. Крахмал используется для создания препаратов, применяемых в медицине и ветеринарии. Например, с помощью плазменной технологии на основе НЧ меди и серебра в комплексе с крахмалом синтезирован порошкообразный препарат с антибактериальным эффектом для регенерации мягких тканей [13]. Разработаны добавки к пище для кур-несушек и цыплят-бройлеров в виде йодистого крахмала [14, 15]. Таким образом, крахмал является хорошо зарекомендовавшим себя веществом в качестве матрицы НК.

В [16–19] был исследован ряд НК селена с природными матрицами – арабиногалактаном и каррагинаном, содержание НЧ селена в которых варьировалось от 1.23 до 6.4%. Наличие явного антибактериального эффекта выявлено только у некоторых НК [16]. Возможно, это связано с неспецифичностью матриц НК из арабиногалактана или каррагинана как пищевого субстрата для Cms. В некоторых случаях отмечалась стимуляция прироста растений картофеля in vitro под влиянием НК [16, 19]. В [20] были проведены предварительные исследования НК селена и крахмала на жизнеспособность Cms, в которых показан его значительный антибактериальный эффект.

Цель настоящей работы – изучить влияние НК селена на основе крахмала с высоким содержанием НЧ селена (12.0%) на возбудитель кольцевой гнили Clavibacter sepedonicus, растения картофеля in vitro, а также исследовать безопасность его применения для окружающей среды.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез НК селена на основе крахмала (НК Se/Кр) осуществляли на основе водорастворимого крахмала (Sigma-Aldrich, USA) по описанной ранее методике [20]. К раствору крахмала (500 мг) в 30 мл воды со средней молекулярной массой 342 кДа добавляли при перемешивании раствор 12 мг H₂SeO₃ в 3 мл воды. Через 10 мин добавляли 5 мг NaBH₄ и выдерживали при комнатной температуре в течение 15 мин. Образовавшийся НК высаживали в четырехкратный объем 95% этилового спирта и промывали. Получали серый порошок с содержанием селена 12.0% (выход 89%). Для экспериментов использовали растворы НК Se/Кр, в которых содержание селена составляло 0.000625% в конечной концентрации.

Культивирование растений картофеля. Влияние НК Se/Кр изучали на растениях картофеля in vitro сорта Лукьяновский, восприимчивого к Сms [21]. Микроклональное размножение пробирочных растений осуществляли с помощью черенкования на агаризованной питательной среде Мурасиге–Скуга (Sigma, USA). Растения культивировали в факторостатных условиях в течение 20 сут при 26°С и освещенности 5–6 кЛк.

Бактерии. Использовали штамм Clavibacter sepedonicus (Сms) Ac-1405, возбудителя кольцевой гнили картофеля (получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов, г. Пущино, Московская обл.). Бактерии Cms выращивали на среде с глюкозой, пептоном и дрожжевым экстрактом (GPY) [22]. Влияние НК Se/Кр на биопленкообразование Cms исследовали с применением планшетного метода [23].

Бактерии Acinetobacter guillouiae и Rhodococcus erythropolis были выделены из ризосферы Пырея ползучего (Elytrigia repens), произрастающего на нефтезагрязненной территории Заларинского района Иркутской области (п. Тыреть), Россия. Бактерии культивировали в течение одних суток в темноте на твердой среде, состоящей из агара, ферментативного гидролизата говяжьего мяса, и жидкой питательной среде аналогичного состава. Для исследования бактериостатической активности НК Se/Кр в отношении почвенных бактерий их жидкую культуру инкубировали в аэрируемых условиях (80 об./мин) в темноте при 26°С, измеряя оптическую плотность бактериальной суспензии при 595 нм в динамике: в начале инкубации и через 2, 4, 6, 8, 24, 28, 48, 52 и 72 ч.

Схема эксперимента с растениями. Для проведения эксперимента в среду роста картофеля вносили водный раствор НК Se/Кр. В вариантах с заражением в среду роста вносили односуточную бактериальную суспензию Cms. Растения инкубировали 26 сут, отслеживая каждые двое суток биометрические показатели (длину растений и количество листьев, длину междоузлий, массу корней и массу вегетативной части).

Активность гвояколзависимой пероксидазы определяли по методу Бояркина [24]. Активность фермента измеряли спустя 60 мин коинкубации растений с НК Se/Кр.

Для выявления областей продукции активных форм кислорода (АФК) растения заражали Cms, выдерживали четверо суток, затем обрабатывали НК Se/Кр, спустя 1 ч кокультивирования осуществляли подготовку проб для анализа. Образцы ткани корня растений инкубировали 30 мин с  5 мкM CellROX Deep Red Reagent (ex/em 644/665 nm) (Thermo Fisher Scientific Inc., USA), растворенном в фосфатном буфере. Далее ткань фиксировали 2%-ным параформальдегидом в течение 15 мин. Полученные препараты заключали в ProLong Gold antifade reagent (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) и исследовали на конфокальном микроскопе LSM 710 (Zeiss, Germany). Для исследования применяли лазеры 405, 561 нм и фильтры Ch1 410–522.

Определение содержания первичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) – диеновых конъюгатов в тканях картофеля проводили по методике [25] с использованием гексана и изопропанола спустя 30 и 60 мин после внесения раствора НК Se/Кр в среду роста картофеля in vitro.

Методика пробоподготовки для рентгеновского спектрального энергодисперсионного микроанализа (РСЭДМА). Растение заражали Cms. Через двое суток, когда оно было полностью колонизировано патогеном, его обрабатывали НК Se/Кр. Спустя двое суток кокультивирования в факторостатных условиях осуществляли подготовку проб для анализа. Пробы, полученные из растертой и слегка подсушенной растительной ткани, наклеивали на электропроводный клей и помещали в камеру для съемки при помощи электронного сканирующего микроскопа Hitachi ТМ 3000 с X-детектором SDD Xflash 4304, где они подвергались электронному удару. С помощью пучка электронов атомы исследуемого образца возбуждались, испуская характерное для каждого химического элемента рентгеновское излучение. Исследуя энергетический спектр такого излучения, делали выводы о качественном и количественном составе образца.

Электронная микроскопия. НК Se/Кр растворяли в воде, после чего наносили на сетки с формваровыми подложками и высушивали. Подготовленные пробы исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) LEO 906E (Carl Zeiss, Германия) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Микрофотографии получали камерой MegaView II и обрабатывали с помощью программного обеспечения Mega Vision.

Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием пакета программ MS Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Синтезированный НК Se/Кр по данным рентгенофазового анализа представлял собой рентгеноаморфный порошок серого цвета. Наночастицы селена, визуализированные в ПЭМ, имели округлую форму. Размер частиц варьировал в интервале 20–90 нм со средним значением 40 нм. Наночастицы селена равномерно распределены в полисахаридных матрицах. Установлено, что НЧ селена способны образовывать кластеры (рис. 1).

Рис. 1.

НК Se/Кр, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии (LEO 906E).

Ранее было показано, что НК Se/Кр обладает бактериостатическим эффектом по отношению к Cms. При использовании красителя пропидий иодид, окрашивающего мертвые клетки, было выявлено, что доля мертвых клеток в суспензии с НК Se/Кр достигала от 33 до 59% в поле зрения ПЭМ. Отмечена деформация бактериальных клеток. Так, их длина по сравнению с контролем значительно уменьшалась, а ширина увеличивалась на 9–22% [20]. Это свидетельствует о токсичности исследуемого НК селена и его высокой биодоступности, вероятно, вследствие наличия полисахаридной крахмальной матрицы.

Важным аспектом патогенности кольцевой гнили является биопленкообразование. Благодаря этой способности бактерии скапливаются в сосудах ксилемы растений, вызывая их закупоривание, что приводит к вилту стеблей [4]. В связи с этим изучено влияние НК Se/Кр на способность Cms образовывать биопленки. Выявлено, что крахмал не влиял на биопленкообразование Cms, НК Se/Кр снижал этот процесс (рис. 2). Таким образом, продемонстрировано широкое антибактериальное действие НК Se/Кр по отношению к фитопатогену Cms – бактериостатический эффект, эффект нарушения морфологии бактериальных клеток [20] и антибиопленочный эффект.

Рис. 2.

Биопленкообразование бактерий Cms под влиянием НК Se/Кр. К – контроль, Кр – бактерии Cms после инкубации с крахмалом, НК Se/Кр – бактерии Cms после инкубации с НК Se/Кр.

Следующий этап исследования – оценка влияния НК Se/Кр на растения, зараженные возбудителем кольцевой гнили картофеля. Были измерены биометрические характеристики растений. НК Se/Кр не оказывал влияния на прирост здоровых растений в течение всего эксперимента (рис. 3). Заражение растений Cms снижало прирост растений. Обработка НК Se/Кр зараженного Cms картофеля на начальном этапе наблюдения не оказывала воздействия на прирост, но спустя 20 сут инкубации снизила негативный эффект заражения (рис. 3а).

Рис. 3.

Влияние заражения Cms и обработки НК Se/Кр на прирост растений картофеля (а), длину междоузлий (б), массу корней (в), массу вегетативной части (ВЧ) (г). К – контроль, Б – растения картофеля, зараженные Cms, НК Se/Кр – растения картофеля, обработанные НК Se/Кр, Б + НК Se/Кр – зараженные Cms растения картофеля, обработанные НК Se/Кр.

Рис. 3.

Окончание.

Вторым использованным биометрическим показателем было количество листьев у растений картофеля, подвергнутых обработке НК Se/Кр и его предшественниками. Достоверного воздействия как заражения Cms, так и обработки растений НК на количество листьев выявлено не было. При этом не наблюдалось эффекта “вытягивания” растений. Наоборот, при обработке здорового картофеля НК отмечалось увеличение количества узлов кущения по сравнению с контролем. Заражение растений Cms способствовало уменьшению длины междоузлий. Не выявлено какого-либо влияния на исследуемый показатель растений при совместном действии НК и Cms (рис. 3б). При завершении эксперимента была измерена масса надземной части растений и их корней (рис. 3в, 3г). Обнаружено, что заражение растений снижало биомассу корней и вегетативной части. НК Se/Кр не оказывал влияния на биомассу как вегетативной части растений, так и корней. Обработка НК Se/Кр растений, зараженных Cms, снижала негативный эффект заражения по отношению к контролю. Таким образом, показано отсутствие негативного воздействия НК Se/Кр на биометрические характеристики картофеля in vitro. В случае добавления НК Se/Кр к зараженным растениям негативный эффект заражения снижался.

Для выявления механизмов воздействия НК Se/Кр на защиту растений от стрессовых факторов были исследованы изменение активности пероксидазы, содержание АФК и содержание продуктов ПОЛ в тканях картофеля, инфицированного Cms и подвергнутого обработке НК. На рис. 4 представлены результаты воздействия НК Se/Кр на активность пероксидазы в тканях листьев картофеля. Известно, что пероксидаза является очень чувствительным ферментом к различным стрессовым факторам, поэтому некоторые исследователи предлагают использовать его для оценки устойчивости организма к стрессу [26–28]. Выявлено, что заражение Cms несколько повышает активность фермента. Обработка растений НК Se/Кр влияет на активность фермента в тканях картофеля, внесение НК к здоровым растениям приводило к повышению активности фермента приблизительно в 2 раза. Добавление НК Se/Кр к зараженным Cms растениям демонстрирует еще большее повышение активности фермента по сравнению с вариантом опыта – зараженные растения без обработки НК. Такой результат свидетельствует об усилении защитной реакции растения при биотическом стрессе под влиянием НК Se/Кр (рис. 4).

Рис. 4.

Влияние НК Se/Кр на активность пероксидазы в тканях листьев картофеля. К – контроль, Б – растения картофеля, зараженные Cms, НК Se/Кр – растения картофеля, обработанные НК Se/Кр, Б + НК Se/Кр – зараженные Cms растения картофеля, обработанные НК Se/Кр.

Известно, что АФК являются одними из первых молекул, свидетельствующих о наличии стрессового состояния у растений [29–31]. Для оценки уровня стресса с помощью АФК были использованы растения, больные кольцевой гнилью. Они были полностью колонизированы патогеном, так как с момента их заражения прошло четверо суток, и в этот период времени повышения АФК в тканях корня у них уже не было зафиксировано (рис. 5б). Наблюдаемая картина вполне объяснима, поскольку известно, что уровень АФК значительно поднимается на начальном этапе ответа растения на воздействие стрессового фактора [29–31]. Если здоровые растения подвергали обработке НК Se/Кр, наблюдали значительное увеличение количества АФК в тканях корня картофеля более чем в 4 раза по сравнению с контрольными значениями (рис. 5в). Очевидно, это говорит о повышении защитной реакции клеток растений на стресс благодаря влиянию НК Se/Кр. В случае обработки НК растений, больных кольцевой гнилью, также было отмечено повышение содержания АФК. Полученный результат указывает на активизацию защитных функций растительного организма при стрессе.

Рис. 5.

ПЭМ-изображение влияния НК Se/Кр на образование АФК в тканях растений картофеля, неинфицированного (а), инфицированного Cms (б), обработанного НК Se/Кр (в), обработанного НК Se/Кр и инфицированного Cms (г). Количество АФК, образовавшегося в тканях картофеля при воздействии Cms (Б, Б + НК Se/Кр) и нанокомпозита селена (НК Se/Кр, Б + НК Se/Кр) (д). К – контроль, Б – растения картофеля, зараженные Cms, НК Se/Кр – растения картофеля, обработанные НК Se/Кр, Б + НК Se/Кр – зараженные Cms растения картофеля, обработанные НК Se/Кр.

Высокое количество АФК способно спровоцировать биохимическое повреждение клеток – перекисное окисление липидов [32]. Содержание продуктов ПОЛ некоторыми исследователями предлагается применять в качестве показателя степени повреждения клеток растений при стрессе [33]. Было исследовано влияние НК Se/Кр на содержание диеновых конъюгатов в тканях корня и листьев картофеля. Обработка растений НК Se/Кр не приводила к выраженному изменению содержания диеновых конъюгатов в корнях и листьях картофеля через 30 и 60 мин после внесения НК в среду роста растений (табл. 1). Полученные данные указывают на отсутствие отрицательного влияния НК Se/Кр на липидные компоненты клеток растений.

Таким образом, изучение влияния исследуемого нанокомпозита на картофель свидетельствует об отсутствии негативного эффекта НК Se/Кр на картофель как зараженный Cms, так и свободный от инфекции. Обработка здоровых растений НК Se/Кр способствовала повышению защитных функций организма благодаря усилению продукции АФК в тканях корня, причем такое количество АФК не приводило к повреждению липидов мембран растительных клеток. Обработка НК Se/Кр зараженных растений снижала концентрацию АФК, что доказывает ингибирующий эффект НК Se/Кр по отношению к возбудителю кольцевой гнили.

Следующий этап работы посвящен исследованию безопасности НК Se/Кр для окружающей среды. Большинство применяемых в сельском хозяйстве пестицидов накапливается в семенах и плодах культурных растений [34, 35], проникает в водоемы [36] и почву [37, 38], негативно влияя на ее обитателей [39, 40]. Накопление действующих веществ пестицидов в плодах культурных растений является серьезной проблемой используемых сейчас препаратов [41]. В связи с этим необходимо проверить, накапливается ли селен в тканях картофеля после обработки НК Se/Кр. Были проведены эксперименты по выявлению селена в тканях картофеля методом РСЭДМА спустя одни сутки после обработки. Для чего провели расчет количества обнаруженных биогенных элементов (углерод, кислород, азот, фосфор, магний, селен) в тканях картофеля. Был проведен анализ следующих вариантов – контрольные растения; растения, зараженные Cms; растения, обработанные НК Se/Кр; растения, зараженные Cms и обработанные НК Se/Кр. Во всех исследуемых пробах селена выявлено не было. Полученный результат свидетельствует о безопасности обработки растений НК Se/Кр в используемой концентрации.

Также было изучено влияние НК Se/Кр на жизнеспособность ризосферных микроорганизмов Acinetobacter guillouiae и Rhodococcus erythropolis, обитающих не только в ризосфере растений, но и встречающихся в почве. В почве они способны осуществлять биодеструкцию углеводородов, биоремедиацию почв [41–44]. Кроме того, родококк обладает фитостимулирующей активностью [45]. Так, при обработке семян микроорганизмом Rhodococcus erythropolis всхожесть семян редьки масличной в условиях нефтезагрязнения повышалась на 25% относительно контроля, длина корня увеличивалась на 50%, высота надземной части и ее масса на 40%. Это свидетельствует о снижении ингибирующего действия нефти на растение. Rhodococcus erythropolis проявлял высокие фитозащитные свойства, снижая негативное влияние нефти на растения редьки масличной. Проведенные в настоящей работе эксперименты демонстрируют отсутствие бактериостатического эффекта НК Se/Кр по отношению к исследуемым микроорганизмам (рис. 6). Изучено наличие бактерицидного и антибиопленочного эффектов НК Se/Кр по отношению к исследуемым ризосферным бактериям. В результате проведенных экспериментов негативного воздействия НК Se/Кр на жизнеспособность бактерий и их биопленкообразование выявлено не было. Различный эффект НК Se/Кр на ризосферные бактерии и патоген Cms, вероятно, связан с природой исследуемых микроорганизмов. A. guillouiae и R. erythropolis, как микроорганизмы, обитающие в почве, обладают высокой биологической активностью: являются биоремедиантами, способны снижать негативное влияние углеводородов на растения [45], оказывать фитостимулирующий эффект благодаря выработке фитогормонов, поверхностно активных веществ и биосурфактантов [46]. Возможно, изучаемые ризосферные бактерии из-за наличия в их клетке плазмид [47] обладают высокой устойчивостью к действию различных стрессовых факторов, что предстоит доказать в будущих исследованиях.

Рис. 6.

Влияние заражения обработки НК Se/Кр на прирост ризосферных бактерий Acinetobacter guillouiae (A. q.) и Rhodococcus erythropolis (R. e.).

Таким образом, представленные результаты демонстрируют наличие у НК Se/Кр антибиопленочного эффекта по отношению к фитопатогену Cms. Не наблюдалось негативного влияния НК на биометрические характеристики здоровых растений картофеля in vitro. Отмечено снижение негативного эффекта заражения растений Cms в результате обработки НК Se/Кр. Кроме того, показано, что селен не накапливается в тканях картофеля после их обработки композитом. Отсутствует негативное влияние НК Se/Кр на жизнеспособность ризосферных бактерий. Полученные данные позволяют сделать заключение о возможности рассматривать НК Se/Кр в качестве эффективного и экологически безопасного вещества для регуляции численности бактериозов культурных растений.

Работа выполнена с использованием коллекций ЦКП “Биоресурсный центр” Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН, ЦКП “Ультрамикроанализ” ЛИН СО РАН (http://www.lin.irk.ru/copp/rus/), материально-технической базы Байкальского аналитического центра коллективного пользования. Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Президента Российской Федерации молодых ученых – кандидатов наук (грант № МК-1220.2019.11, проект АААА-А19-119022690046-4).