Российские нанотехнологии, 2020, T. 15, № 4, стр. 505-512

ВВЕДЕНИЕ

Сохранение и преумножение защитного и ресурсного потенциала лесов, предупреждение обезлесения и деградации – основная задача устойчивого управления лесами. Биотехнологические подходы, основанные на культивировании органов и тканей многолетних растений вне организма, на искусственных питательных средах, в регулируемых асептических условиях, позволяют в полной мере использовать селекционные достижения и проводить интенсивное выращивание качественного посадочного материала ценных генотипов древесных культур для плантационного лесовыращивания [1].

В современном сельском и лесном хозяйстве, а также биотехнологических процессах все большую популярность набирают препараты, содержащие наночастицы, обладающие огромным потенциалом [2]. Специфические свойства металлов в ультрадисперсном состоянии открывают широкие возможности для создания новых эффективных агентов с высокой биологической активностью для применения в различных областях [3]. Установлено, что наночастицы металлов при попадании в живые организмы вызывают биологический ответ, отличающийся от действия традиционной ионной формы элементов [4].

В исследованиях культуры тканей накоплен большой материал, демонстрирующий положительное влияние наночастиц на всех этапах культивирования in vitro. Показано положительное влияние внесения наночастиц Ag в питательную среду на снижение процента контаминированных эксплантов Valeriana officinalis L. [5 ] , Gerbera jamesonii [6], Arabidopsis thaliana [7], Bacopa monnieri [8], Nicotiana tabacum [9] и др. Кроме того, было отмечено, что при обработке эксплантов Rosa hibrida в течение 20 мин в растворе, содержащем 200 мг/л Ag, происходило значительное снижение бактериальной инфекции [10]. В [11] отмечено улучшение ростовых характеристик растений in vitro Brassica juncea под воздействием 50 мг/л наночастиц Ag за счет снижения количества пероксида водорода, малондиальдегида и пролина.

Наночастицы меди, как и наносеребро, проявляют ярко выраженное противомикробное действие. Они часто применяются вместо наночастиц благородных металлов [12]. Так, было показано увеличение числа побегов, количества и длины корней, массы растения Verbena bipinnatifida при добавлении в среду для культивирования 5–15 мг/л наночастиц меди [13]. Растения перца Capsicum annuum, культивированные на среде Мурасиге–Скуга (MS), содержащей наночастицы металлов, в том числе меди, имели улучшенные морфометрические и физиологические показатели: длину корня и его активность, увеличенное содержание хлорофилла в листьях [14]. Добавление 0.5 мг/л наночастиц меди и 0.8 мг/л наночастиц кобальта к модифицированной среде MS увеличивало количество побегов, длину побегов и укоренение Mentha longifolia [15]. Использование наночастиц CuO в концентрации 20 мг/л стимулировало ризогенез Stevia rebaudiana [16], количество укорененных эксплантов увеличивалось почти на 20%.

Однако наряду с описанием положительных эффектов имеются данные, указывающие на негативное действие наночастиц на растения [17, 18]. Основной механизм токсичности наночастиц связан с поглощением, их устойчивостью на клеточном уровне и способностью высвобождать свободные радикалы, вызывая окислительный стресс. Кроме того, в зависимости от их транспорта, свойств и реакционной способности наночастицы могут влиять на различную метаболическую активность и оказывать воздействие на растения [17].

В то же время информация об эффектах наночастиц CuO и Ag на древесные породы в условиях культуры тканей практически отсутствует. Поэтому данная работа посвящена оценке влияния наночастиц оксида меди и серебра в составе питательных сред на растения березы пушистой на разных этапах клонального микроразмножения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение и исследование наночастиц. Наночастицы оксида меди получали золь-гель-методом [19]. К 0.2 М водного раствора CuCl₂ · 2H₂O (≥99%, Sigma-Aldrich) добавляли 1 мл ледяной уксусной кислоты (≥99%, Sigma-Aldrich) и нагревали до 100°C при постоянном перемешивании. При помощи 8 М NaOH (≥98%, Sigma-Aldrich) раствор доводили до pH = 7 ± 0.2. Раствор изменял цвет с зеленого на черный, и наблюдалось выпадение осадка, который доосаждали центрифугированием и промывали 3–4 раза деионизированной водой. Полученный осадок сушили на воздухе в течение 24 ч. Коллоидный раствор готовили путем ультразвукового диспергирования 20 мг порошка в 100 мл дистиллированной воды (pH = 7 ± 0.2) в течение 5 мин. Таким образом получали суспензию с концентрацией наночастиц 200 мг/л.

Наночастицы серебра получали методом химического восстановления [20]. Для этого 50 мл водного раствора, содержащего 0.062 г (3.8 · 10^–4 моль) нитрата серебра (≥99%, Sigma-Aldrich), по каплям и при интенсивном перемешивании добавляли к 50 мл водного раствора, содержащего 0.2 г (5.2 · 10^–4 моль) натриевой соли сульфоэтоксилатадодеканола (SLES, 70%-ный водный раствор Hansa). Через 15 мин после смешения растворов к реакционной системе по каплям при интенсивном перемешивании добавляли 100 мл раствора, содержащего 0.028 г (7.4 · 10^–4 моль) боргидрида натрия (99%, AcrosOrganics). Концентрация серебра в полученной дисперсии составляла 200 мг/л.

Исследование наноматериалов проводили методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) на микроскопе Leo 912 AB Omega (LeoLtd., Германия) и динамического рассеяния света на анализаторе ZetasizerNano ZS (MalvernInstrumentsltd., Великобритания).

Клональное микроразмножение. В качестве эксплантов при введении в культуру использовали апикальные и пазушные меристемы молодых побегов березы пушистой Betula pubescens. Побеги промывали проточной водой с поверхностно-активными веществами и разрезали на сегменты 3–5 см, после чего стерилизовали в течение 35 мин в растворе, состоящем из 200 мл дистиллированной воды и 200 мкл 5%-ного раствора гипохлорита натрия, с последующей однократной промывкой в дистиллированной воде. Основную стерилизацию побегов проводили в ламинар-боксе в растворе, состоящем из 15 мл 5%-ного раствора гипохлорита натрия и 85 мл стерильной дистиллированной воды, в течение 15 мин. Промывку проводили также стерильной водой. Стерильные побеги разрезали в асептических условиях на сегменты величиной 1.5–2 см с одной пазушной почкой – экспланты, которые впоследствии были высажены на агаризованную питательную среду WPM (Woody plant medium) [21] с добавлением растворов наночастиц. На этапе предварительных исследований на стадии введения в культуру in vitro было установлено, что наилучшие результаты получены при использовании наночастиц CuO и Ag в концентрации 5 мг/л. Данную концентрацию наночастиц использовали на всех этапах отработки технологии. В качестве контроля использовали среду без добавления наночастиц. Условия климатического режима: 16-часовой фотопериод при освещенности 2–3 клк и температуре 24–26°С. На протяжении трех недель фиксировали число стерильных эксплантов и эксплантов, сформировавших основной побег. Антифунгальную активность наночастиц CuO и Ag по отношению к фитопатогенам Fusarium oxysporum, Fusarium avenaceum, Alternaria alternata определяли в чашках Петри методом лунок (колодцев) [22]. Степень антагонистической активности оценивали по зонам подавления роста тест-культуры вокруг лунок с исследуемыми наночастицами.

Оценку влияния растворов наночастиц на регенерационные процессы и коэффициент размножения микроклонов березы проводили на среде WPM с добавлением наночастиц и регуляторов роста – 300 мкг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП) и 200 мкг/л гибберелловой кислоты (ГК) (≥99%, Sigma-Aldrich). По истечении трех недель оценивали жизнеспособность, внешний вид, развитость побега и листьев, а также коэффициент мультипликации микроклонов. Состояние микроклонов оценивали по внешнему виду по пятибалльной шкале. Коэффициент мультипликации рассчитывали как среднее количество микропобегов, полученных с одного конгломерата [23].

Процесс укоренения микроклонов под влиянием растворов наночастиц проводили на 1/2 WPM без применения регуляторов роста (безгормональной среде) и на среде 1/2 WPM, дополненной 300 мкг/л индолил-3-масляной кислотой (ИМК). Учитывали число укоренившихся микрорастений через 21 день наблюдения, а также количество корней на одно растениe.

Влияние растворов наночастиц на приживаемость и наличие инфекции после перевода микроклонов березы пушистой в условия закрытого грунта изучали в условиях теплицы в субстрате, состоящем из торфа и перлита в соотношении 3:1, обработаннoм раствором наночастиц (5 мг/л). Почвосмесью заполняли пикировочные контейнеры объемом 150 см³, в которые высаживали растения. На протяжении 21 дня оценивали приживаемость, жизнеспособность и инфицированность исследуемых растений березы.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием программы MicrosoftExcel 2010 (пакет “Описательная статистика”) с применением однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) при 5%-ном уровне значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование наночастиц. ПЭМ-анализ морфологии полученных наночастиц показал (рис. 1), что частицы оксида меди и серебра имеют близкую к сферической форму. Средний размер наночастиц CuO составлял 5–20 нм (рис. 1а), диаметр частиц Ag находился в диапазоне 10–30 нм (рис. 1б). Как видно из микрофотографий, серебро находилось в виде индивидуальных наночастиц, в то время как оксид меди – в скоагулированном состоянии. Исследование дисперсионного состава коллоидных систем наночастиц методом динамического светорассеяния также подтвердило, что коллоидный раствор наночастиц CuO характеризуется полимодальным распределением частиц, отмечен пик при 2–6 нм и второй в диапазоне 10–40 нм (рис. 2а), что говорит о некоторой склонности к агрегации частиц в растворе. Для наночастиц серебра наблюдалось более узкое распределение по размерам 10–25 нм (рис. 2б). Таким образом, диапазон распределений по размерам частиц и агрегатов CuO равнялся 5–40 нм, наночастиц Ag – 10–30 нм.

Рис. 1.

ПЭМ-изображения наночастиц CuO (а) и Ag (б).

Рис. 2.

Дисперсионный состав образцов наночастиц CuO (а) и Ag (б).

Получение асептических жизнеспособных культур березы пушистой. Результаты влияния дисперсий наночастиц CuO и Ag на инфицированность эксплантов и их морфогенный потенциал в процессе введения в культуру in vitro березы представлены в табл. 1. Как показал анализ данных, приведенных в таблице, использование наночастиц CuO и Ag в составе питательной среды способствует снижению количества инфицированных эксплантов березы на 15 и 25% соответственно по сравнению с контролем. При этом максимальный эффект наблюдался с наночастицами Ag. Низкий показатель инфицированности введенных эксплантов березы на питательных средах с наночастицами может быть связан с антибактериальным и антифунгальным действием растворов наночастиц [24, 25].

Анализ влияния наночастиц в концентрации 5 мг/л на фитопатогены (рис. 3) показал значительный антифунгальный эффект CuO в отношении Fusarium oxysporum (диаметр зоны подавления роста гриба d = 16 мм), Alternaria alternata (d = = 13 мм) и Ag в отношении Fusarium avenaceum (d = 20 мм) и Alternaria alternata (d = 12 мм).

Рис. 3.

Антифунгальная активность растворов наночастиц CuO и Ag.

Внесение в состав питательной среды наночастиц CuO и Ag также положительно сказывалось на морфогенном потенциале (формировании хорошо развитого основного побега) введенных эксплантов березы. Так, число эксплантов с хорошо развитым основным побегом при использовании наночастиц CuO и Ag составило 85 и 95% соответственно, в контроле – 65% (табл. 1). Таким образом, положительный эффект от использования растворов наночастиц CuO и Ag на стадии введения березы в культуру in vitro свидетельствует о возможности использования наночастиц на данном этапе технологического процесса микроклонального размножения.

Мультипликация микроклонов березы пушистой. Для оценки влияния наночастиц на проростки березы на этапе мультипликации были отобраны растения-регенеранты, выращенные на питательной среде с наночастицами. Результаты показали, что добавление в среду наночастиц CuO на стадии мультипликации растений березы in vitro действовало угнетающе на ростовые и регенерационные процессы: уменьшались прирост растений, число листьев и коэффициент мультипликации по сравнению с контрольными растениями (табл. 2). По пятибалльной шкале вид растений оценивался на три балла. Использование в составе питательной среды наночастиц Ag увеличивало высоту растений на 10%, однако количество листьев и коэффициент мультипликации уменьшались. Визуальные наблюдения показали, что растения выглядели слабыми, с тонкими побегами, удлиненными междоузлиями, по пятибалльной шкале их состояние оценивалось на 3.7 балла.

Таким образом, внесение в состав среды WPM наночастиц CuO и Ag на стадии мультипликации березы in vitro способствует снижению жизнеспособности, ухудшению внешнего вида, развитости побега и листьев, а также уменьшению коэффициента мультипликации микроклонов. В качестве одного из возможных механизмов токсического действия наночастиц, как говорилось выше, может рассматриваться генерация активных форм кислорода, что приводит к окислительному стрессу [17].

Укоренение микропобегов березы пушистой. Результаты исследований показали, что введение наночастиц негативно сказывалось на количестве укорененных побегов как на гормональной, так и на безгормональной средах (табл. 3). Так, на среде, содержащей только наночастицы CuO и Ag, количество укоренившихся растений березы составило 35 и 45% соответственно, тогда как в контрольном варианте – 60%. Добавление в среду для выращивания стимулятора корнеобразования – ИМК, увеличило количество укоренившихся растений до 35 и 60% соответственно, однако этот показатель в контрольном варианте был выше – 75%. В то же время было отмечено, что добавление в среду для укоренения наночастиц CuO изменяло характер роста корневой системы. Опытные растения березы имели более сильную корневую систему с большим количеством боковых корешков по сравнению с контрольными, корни которых были тонкими и нитевидными (рис. 4). Кроме того, число корней на одно растение было выше для растений, выращенных на среде с наночастицами CuO (табл. 4). Наличие более развитой корневой системы позволяет растениям лучше закрепляться в субстрате, а также проводить воду и питательные элементы среды.

Рис. 4.

Развитие корневой системы березы в питательной среде 1/2 WPM, содержащей наночастицы CuO и Ag.

Таким образом, не было обнаружено положительного эффекта внесения наночастиц на количество укоренившихся микропобегов березы in vitro, однако под воздействием наночастиц CuO корневая система становилась более разветвленной, с большим количеством боковых корешков. Различные эффекты воздействия наночастиц на развитие корневой системы можно, с одной стороны, связать с ингибированием наносеребром накопления ростового фитогормона ауксина в корнях и снижением экспрессии генов, связанных с рецепторами ауксина [26], а с другой стороны, с индукцией ризогенеза под действием наночастиц оксида меди [27], которая может быть связана с действием меди как микроэлемента, входящего в состав различных растительных ферментов. Являясь компонентом ряда окислительных ферментов, медь повышает интенсивность дыхания, влияет на углеводный и белковый обмен растений [28, 29].

Влияние наночастиц на этапе адаптации к почвенным условиям. Исследовано влияние растворов наночастиц CuO и Ag на приживаемость и наличие инфекции у микроклонов древесных пород после перевода их в условия закрытого грунта. Результаты представлены в табл. 4 и на рис. 5.

Рис. 5.

Микрорастения березы через 21 день после перевода в условия закрытого грунта.

Как видно из представленных данных, использование наночастиц CuO и Ag повышает приживаемость растений на 25%. Кроме того, отмечено улучшение основных показателей роста и развития растений. Так, у опытных растений увеличивается высота стебля на 6–12%, количество листьев – 34–45% соответственно по отношению к контрольным растениям. Состояние клонов по пятибалльной шкале оценивалось на 4.6 балла. Данный факт положительного влияния свидетельствует о повышении адаптационных свойств микрорастений березы под влиянием растворов наночастиц, что согласуется с литературными данными. Согласно мнению многих исследователей, применение наночастиц снижает воздействие стрессовых факторов, к которым относится перевод растений в условия закрытого грунта. При этом наночастицы воздействуют на биологические объекты на клеточном уровне, повышая эффективность протекающих в растениях процессов, и обладают пролонгированным действием [30].

Применение наночастиц CuO и Ag способствует также снижению количества инфицированных фитопатогенами растений на 5–10%. Это объясняется наличием у исследуемых растворов наночастиц антагонистической активности в отношении основных возбудителей болезней растений, находящихся в стадии покоящихся спор в почве. Бактерицидное и фунгицидное действие наночастиц CuO и Ag продемонстрировано в ряде работ [31–34].

Таким образом, анализ результатов применения наночастиц на стадии перевода растений в условия тепличного доращивания свидетельствует о возможности повышения приживаемости древесных растений и снижении инфекционной нагрузки путем введения в технологический процесс использования растворов наночастиц CuO и Ag.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали возможность использования в технологическом процессе клонального микроразмножения березы пушистой наночастиц CuO и Ag на стадиях введения эксплантов в культуру in vitro, а также при переводе растений в условия закрытого грунта. Эффект биологического воздействия наночастиц обусловлен как их антифунгальным действием, так и способностью влиять на рост и развитие растений. Не выявлено положительного эффекта применения наночастиц CuO и Ag на стадиях мультипликации и укоренения микроклонов. Отмечено, что под воздействием наночастиц оксида меди корневая система микрорастений березы пушистой формировалась более разветвленной, с большим количеством боковых корешков. Полученные результаты могут быть полезны в биотехнологической практике при использовании наночастиц CuO и Ag в ходе клонального микроразмножения растений.