Российские нанотехнологии, 2021, T. 16, № 2, стр. 261-268

ВВЕДЕНИЕ

Пищевая промышленность является одной из перспективных отраслей применения нанотехнологий в хозяйственной деятельности человека [1]. Включение наноматериалов в состав продуктов питания и пищевых упаковок в качестве красителей, биоцидных компонентов, противослеживающих добавок обеспечивает эффективное повышение качества продукции, выпускаемой предприятиями данной отрасли. При всех своих положительных свойствах наноматериалы обладают высокой проникающей способностью через защитные барьеры организма и реакционной активностью, следствием чего может являться увеличение токсических свойств при поступлении в организм в процессе производства и потребления продукции, содержащей в своем составе наноматериалы [2].

Одним из активно применяющихся в пищевой промышленности материалов являются наночастицы (НЧ) оксида алюминия (Al₂O₃). Наноразмерный Al₂O₃ входит в состав консервантов, красителей, противослеживающих добавок, эмульгаторов, соевых детских смесей, защитных антибактериальных упаковок [3–5]. Поступление в организм человека НЧ Al₂O₃ возможно и через продукцию сельского хозяйства, для выращивания которой используют регуляторы роста растений, содержащие в своем составе соединения, образующиеся в процессе гидролиза НЧ оксида алюминия [6].

С помощью in vitro- и in vivo-исследований установлено, что НЧ Al₂O₃ способны генерировать активные формы кислорода [7], обладают цитотоксичностью [8], накапливаются в различных органах и тканях, вызывая патоморфологические изменения [7, 9], воздействуют на протеомный профиль [10], имеют такие отдаленные эффекты токсичности, как канцерогенность и генотоксичность [11, 12].

В связи с активным применением в пищевой промышленности НЧ Al₂O₃ возрастает риск алиментарного поступления в организм наноматериала, обладающего токсическими свойствами, что может привести к увеличению числа случаев заболеваний центральной нервной системы, желудочно-кишечного тракта и крови [13]. Исходя из сказанного выше, исследования, направленные на изучение токсиколого-гигиенических свойств НЧ Al₂O₃ при алиментарном поступлении в организм, приобретают особую актуальность.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве тестируемого образца использовали порошок нанодисперсного Al₂O₃ (CAS 1344-28-1, продукт № 718475) производства компании Sigma Aldrich (США). Для сравнительного анализа использовали порошок микродисперсного Al₂O₃ (CAS 1344-28-1, продукт № 265497) производства той же компании.

Оценка размера частиц Al₂O₃ выполнена в водных суспензиях методом динамического рассеяния света (ДРС) на анализаторах Horiba LB-550 (Horiba, Япония) и Microtrac S3500 (Microtrac, США), а также в виде нативных порошков методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на микроскопе высокого разрешения S-3400N (HITACHI, Япония). Исследование и оценка удельной площади поверхности частиц Al₂O₃ выполнены методом БЭТ (Брунауэра, Эммета и Теллера) на приборе ASAP 2020 (Micromeritics, США).

Исследования на животных проведены в соответствии с требованиями этического комитета ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения и Руководством по уходу и использованию лабораторных животных [14]. Исследование токсичности НЧ Al₂O₃ при алиментарном поступлении осуществляли в экспериментах по изучению действия тестируемого наноматериала при многократном пероральном и однократном интратрахеальном введении. Исследование токсического действия НЧ Al₂O₃ при многократной пероральной экспозиции проводили на половозрелых самцах крыс линии Wistar массой 250–300 г в соответствии с методикой, предложенной в [15]. Экспериментальных животных (n = 24) случайным образом распределили на опытную группу (n = 8) для исследования водной суспензии нанопорошка, группу сравнения (n = 8) – для исследования микропорошка, и контрольную группу (n = = 8), не экспонированную изучаемыми материалами. Начальная исследуемая доза как для нано-, так и для микровещества составила 1510 мг/кг массы тела, что соответствует 1/10 от среднелетальной дозы (LD₅₀) Al₂O₃ [16]. Каждые четверо суток дозу увеличивали в 1.5 раза. Для проведения пероральных экспозиций порошки нано- и микродисперсного Al₂O₃ переводили в форму суспензий на основе бидистиллированной воды. Необходимые концентрации суспензий рассчитывали с учетом средней массы животных в экспериментальных группах и объемом введения 1.5 см³/крысу. Для равномерного распределения частиц полученные водные суспензии подвергали обработке ультразвуковым гомогенизатором Sonopuls Hd (Bandelin, Германия) при комнатной температуре в течение 15 мин в режиме непрерывной пульсации на 80%-ной мощности. Экспозицию осуществляли до достижения гибели 50% особей в одной из групп. По показателю гибели установлено значение LD₅₀ при многократном введении.

Выживших животных (опытная группа – 4 особи, группа сравнения – 6, контрольная группа – 8) для изучения особенностей бионакопления и патоморфологических изменений выводили из опыта через 24 ч после последней экспозиции методом цервикальной дислокации. Для изучения бионакопления алюминия у экспериментальных животных отбирали печень, почки, головной мозг и кровь. Забор крови осуществляли до эвтаназии из подъязычной вены в объеме 3 см³. Каждый отобранный орган делили на три части примерно одинаковой массы, две из них использовали для определения концентрации алюминия, одну – для гистологического исследования. В целом с учетом образцов крови концентрацию исследуемого вещества определяли в 126 образцах (количество образцов опытной группы – 28, группы сравнения – 42, контрольной группы – 56). Для установления патоморфологических изменений тканей органов проводили гистологическое исследование печени, почек, головного мозга, желудка и селезенки на 90 образцах (количество образцов опытной группы – 20, группы сравнения – 30, контрольной группы – 40).

Для определения концентрации алюминия отобранные образцы подвергали термическому озолению в течение 9 ч в муфельной печи при температуре 450–500°С. Количественное определение содержания алюминия в образцах осуществляли методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на масс-спектрометре Agilent 7500cx (Agilent, США) с октопольной реакционной/столкновительной ячейкой. В качестве газа-реактанта использовали гелий.

Для установления патоморфологических изменений тканей органов экспериментальных животных проведено гистологическое исследование. Извлеченные образцы фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина с добавлением фосфатного буфера. Дегидратацию фиксированных кусочков тканей проводили в автоматическом гистологическом процессоре “Excelsior ES” (Thermo Scientific, Германия). Гистологические препараты изготавливали из парафиновых срезов толщиной 3–4 мкм, окрашивая по общепринятой методике гематоксилином и эозином в роботе-окрашивателе “Varistain Gemini ES” (Thermo Scientific, Германия). Микрофотографии сделаны с помощью камеры “Mikroskopkamera AxioCam ERc 5s” (Carl Zeiss, Германия).

При алиментарном поступлении в организм некоторая доля НЧ может проникнуть в легкие интратрахеальным путем. В связи с этим проведено исследование реакции альвеолярных макрофагов при интратрахеальной экспозиции НЧ Al₂O₃. В качестве биологической модели использовали крыс-самцов линии Wistar массой 250–300 г. Экспериментальных животных (n = 27) случайным образом распределили на три группы: опытная группа (n = 9) – животные, экспонированные суспензией нанодисперсного Al₂O₃, приготовленной на основе стерильного изотонического 0.9%-ного раствора хлорида натрия (0.9% NaCl), группа сравнения (n = 9) – животные, экспонированные суспензией микродисперсного аналога на той же основе, контрольная группа (n = 9) – животные, получавшие стерильный изотонический физиологический раствор без тестируемых веществ. Для инстилляции использовали суспензии в концентрации 0.013 г/см³, вводимые интратрахеально под эфирным масочным наркозом в объеме 0.4 см³ на крысу. Животные контрольной группы получали 0.9% NaCl в аналогичном объеме. Через 24 ч после введения суспензий экспериментальным животным проводили однократное промывание дыхательных путей стерильным изотоническим физиологическим раствором в объеме 10 см³. Полученные промывные воды центрифугировали в течение 4 мин при 1000 об./мин. Надосадочную жидкость декантировали, из клеточного осадка готовили мазки. Высушенные препараты фиксировали метиловым спиртом в течение 1 мин и окрашивали азур-эозином по Романовскому в течение 20 мин. Для определения количества и диаметра повреждений проводили анализ цифровых изображений мазков, полученных с помощью светового микроскопа DМ 1000 (Leica, Германия) с иммерсионной системой с использованием универсального программного обеспечения ImageJ-FiJi. Степень повреждения макрофагов оценивали как долю повреждений от общей удельной площади их поверхности, вычисляемой по величине среднего размера единичного повреждения и частоте расположения повреждений на поверхности.

Математическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью параметрических методов статистики, предварительно оценивали соответствие полученных результатов закону нормального распределения, выполняли расчет выборочного среднего (М) и стандартной ошибки (m), проверку гипотезы о совпадении выборочных средних с использованием t-критерия Стьюдента. Различия полученных результатов считали статистически значимыми при р ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

По результатам ДРС установлено, что средний размер частиц нанопорошка Al₂O₃ в водной среде составил 129.90 ± 11.46 нм, что в 103.62 раза меньше данного показателя частиц микродисперсного аналога (13.46 ± 3.14 мкм) (рис. 1). При верификации методом СЭМ средний размер частиц нанопорошка Al₂O₃ составил 40.48 ± 6.07 нм, что в 139.58 раза меньше данного показателя у микродисперсного аналога (5.65 ± 0.74 мкм) (рис. 2). Удельная площадь поверхности НЧ составила 113 м²/г, что в 161.43 раза больше значения у микрочастиц (0.70 м²/г).

Рис. 1.

Гистограмма распределения по размеру в водной суспензии нано- (а) и микрочастиц Al₂O₃ (б).

Рис. 2.

СЭМ-изображение нано- (а) и микрочастиц Al₂O₃ (б).

Гибель 50% (n = 4) особей опытной группы при многократной пероральной экспозиции НЧ Al₂O₃ достигнута на 10-е сутки эксперимента, суммарная доза тестируемого вещества составила 21895 мг/кг массы тела. В группе сравнения гибель животных, экспонированных микроматериалом в той же дозе, составила 25% (n = 2).

После многократного перорального введения НЧ Al₂O₃ отмечено увеличение концентрации алюминия относительно контрольных значений в головном мозге, печени и крови экспонированных животных в 4.40 (р < 0.0001), 1.23 (р = 0.044) и 1.48 раза (р = 0.002) соответственно. После экспозиции микрочастицами Al₂O₃ повышение концентрации алюминия относительно контроля установлено в головном мозге в 3.59 раза (р = = 0.001) и крови в 1.82 раза (р = 0.007). Отмечено различие показателей бионакопления алюминия после экспозиций нано- и микрочастицами исследуемого химического соединения. При действии нанодисперсного вещества отмечено повышение концентрации алюминия в головном мозге в 1.23 раза (р = 0.036) и печени в 1.41 раза (р = = 0.020) относительно данного показателя при действии микродисперсного аналога. У животных экспонируемых групп статистически достоверных изменений по показателю концентрации алюминия в почках относительно контроля не установлено (табл. 1).

Гистологическими методами исследования у животных опытной группы зафиксированы патоморфологические изменения тканей органов в виде острого венозного полнокровия печени (рис. 3) и эозинофильной инфильтрации желудка (рис. 4), чего не отмечено у экспериментальных животных групп сравнения и контроля. Как в опытной группе, так и в группе сравнения установлены гиперплазия лимфоидной ткани и увеличение объема белой пульпы селезенки (рис. 5). Действие НЧ Al₂O₃ на селезенку более выражено и приводит к увеличению объема белой пульпы на 70%, что на 20% больше значения данного показателя при действии микроразмерного аналога (50%). У животных экспонируемых групп патоморфологических изменений тканей почек не установлено.

Рис. 3.

Микрофотографии гистологических препаратов тканей печени крыс линии Wistar (окраска гематоксилин-эозином, масштаб 400:1): а – опытная группа, б – группа сравнения, в – контрольная группа.

Рис. 4.

Микрофотографии гистологических препаратов тканей желудка крыс линии Wistar (окраска гематоксилин-эозином, масштаб 400:1): а – опытная группа, б – группа сравнения, в – контрольная группа.

Рис. 5.

Микрофотографии гистологических препаратов тканей селезенки крыс линии Wistar (окраска гематоксилин-эозином, масштаб 100:1): а – опытная группа, б – группа сравнения, в – контрольная группа.

Результаты исследования жидкости бронхоальвеолярного лаважа, извлеченной через сутки после однократной интратрахеальной инстилляции нано- и микрочастиц Al₂O₃, позволили установить повреждение альвеолярных макрофагов у животных обеих экспонированных групп. При этом в опытной группе среднее число повреждений составило 2.40 ± 0.04 шт./мкм², что в 8 раз больше, чем в группе сравнения (0.30 ± ± 0.06 шт./мкм²). Средний диаметр повреждений, вызываемых действием НЧ Al₂O₃, составил 0.40 ± 0.05 мкм, что в 2.25 раза меньше данного показателя при экспозиции микрочастицами (0.90 ± 0.08 мкм). Степень повреждения альвеолярных макрофагов у животных опытной группы достигает 18.00%, что в 2.50 раза больше значения в группе сравнения (7.20%) (рис. 6).

Рис. 6.

Трехмерная реконструкция морфологических параметров альвеолярных макрофагов крыс линии Wistar: а – опытная группа, б – группа сравнения, в – контрольная группа.

Обобщение полученных результатов показало, что исследованный образец Al₂O₃ является наноматериалом, так как содержит в своем составе частицы размером до 100 нм, обладающие высокой удельной площадью поверхности по сравнению с микрочастицами. Методом ДРС установлено, что средний размер частиц нанопорошка составляет 129.90 ± 11.46 нм, методом СЭМ – 40.48 ± 6.07 нм. Данную разницу можно объяснить вероятной агломерацией НЧ Al₂O₃ в связи с повышением ζ-потенциала в средах со значением pH, близких к 7 [17]. Несферическая форма НЧ Al₂O₃ может также являться одной из причин искажения результатов, полученных методом ДРС. Для НЧ Al₂O₃ при многократном пероральном введении установлен показатель LD₅₀, равный 21 895 мг/кг массы тела, в то время как при действии микрочастиц в аналогичной дозе достигается лишь LD₂₅. Многократная пероральная экспозиция нано- и микроразмерным Al₂O₃ вызывает увеличение концентрации алюминия в головном мозге и крови экспериментальных животных. Материальная кумуляция НЧ более выражена по сравнению с микрочастицами, на что указывают более высокие значения концентраций исследуемого вещества в перечисленных выше органах, а также увеличение данного показателя в тканях печени, что не зафиксировано при действии микрочастиц. Присутствие алюминия в организме неэкспонированных животных можно объяснить низкой степенью биофильности данного элемента. Примерная доля содержания алюминия в организме человека составляет около 10^–5% от общего количества веществ, в том числе отмечено его наличие в крови (0.20 мг/дм³), печени (1–10 мг/кг), почках (0.40 мг/г), головном мозге (2.00 мкг/кг) [18]. В тканях печени животных опытной группы установлено острое венозное полнокровие, что указывает на затрудненное кровообращение, вызванное, вероятно, увеличением количества тромбоцитов в результате прямого действия НЧ Al₂O₃ [19, 20]. Эозинофильная инфильтрация желудка и гиперплазия тканей селезенки могут указывать на развитие воспалительного процесса в результате увеличения в крови уровня медиаторов воспаления, индуцированного действием активных форм кислорода, генерируемых наноразмерным Al₂O₃ [21–24]. Альвеолярные макрофаги животных опытной группы после интратрахеальной инстилляции НЧ Al₂O₃ обладают большим количеством повреждений меньшего диаметра, чем при инстилляции частиц микроразмерного аналога, что связано с размером частиц и разницей в их количестве в вводимых суспензиях, обусловленной разной насыпной плотностью нано- и микроматериала.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследований установлено, что бионакопление наночастиц Al₂O₃ при многократной пероральной экспозиции более выражено, чем у микрочастиц, и происходит преимущественно в тканях головного мозга, печени и крови. Наноматериал более токсичен относительно микроразмерного аналога, на что указывают гибель большего числа животных опытной группы при одинаковой дозе пероральной экспозиции, более выраженные патоморфологические изменения тканей селезенки, наличие изменений тканей желудка и печени, не установленные у животных группы сравнения, а также более выраженная степень повреждения альвеолярных макрофагов при интратрахеальном поступлении исследуемого наноматериала. Полученные результаты необходимо учитывать для повышения эффективности обоснования мер профилактики для производителей и потребителей пищевой продукции, содержащей в своем составе наночастицы Al₂O₃.