Российские нанотехнологии, 2022, T. 17, № 2, стр. 270-274

ВВЕДЕНИЕ

Адресная доставка лекарственных препаратов является быстроразвивающимся направлением медицины. Исследователи ведут активный поиск новых способов адресной доставки и усовершенствования имеющихся технологий. Липосомы занимают особое место среди таких средств в силу того, что с их помощью возможно нивелировать токсические эффекты лекарственных препаратов на здоровые ткани [1–4]. Также ведутся исследования по созданию и возможному практическому применению липосом, содержащих в своем составе магнитовосприимчивые наночастицы (НЧ). Например, липосомы с включенными НЧ оксида железа показали свою эффективность при лечении железодефицитной анемии у крыс линии Wistar [5]. Перспективным представляется использование магнитоуправляемых липосом для адресной доставки лекарственных препаратов, при этом оксид железа может выступать в качестве МРТ-контрастирущего вещества.

Одним из возможных путей доставки противоопухолевых препаратов может быть их доставка к опухолевым клеткам посредством нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ). Исследование [6] показало, что при стимуляции форболмеристацетатом нейтрофилы формируют ретикулярную структуру ДНК вокруг клеток рака легких A549. Согласно [7] опухолевые клетки взаимодействуют со структурами НВЛ, адсорбируясь на них с помощью молекулы β1-интегрина. Эти данные позволяют рассматривать НВЛ в качестве возможного средства доставки противоопухолевых препаратов. Местом взаимодействия липосом с НВЛ могут служить молекулы гистона H3, которые являются неотъемлемой частью внеклеточных сетей, но в свободном виде в кровеносном русле не циркулируют [8]. В связи с этим разработаны иммунолипосомы, функционализированные антителами к гистону H3 в качестве вектора.

Тем не менее одной из главных проблем при применении липосомальных НЧ является возможное токсическое воздействие на здоровые клетки и ткани в силу разрушения со временем липосомальных структур и “утечки” их содержимого. Поэтому оценка токсического воздействия используемых средств доставки лекарственных препаратов является необходимой частью исследований при их создании. Микроводоросль Chlorella vulgaris является удобным объектом для токсикологических исследований, так как у нее достаточно короткий цикл развития, составляющий 22 ч.

Цель исследования заключалась в изучении токсических свойств иммуномагнитолипосом, синтезированных в настоящей работе, по отношению к культуре микроводорослей Chlorella vulgaris. В качестве магнитовосприимчивого вещества использовали НЧ магнетита, покрытые цетилтриметиламмония бромидом, в качестве вектора присоединяли антитела к гистону H3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез наночастиц магнетита, стабилизированных цетилтриметиламмония бромидом. НЧ магнетита получали модифицированным методом Массарта путем соосаждения солей железа(II) и железа(III) в щелочной среде [9]. В качестве осаждающего реагента использовали 1%‑ный раствор аммиака (Вектон, Россия), от которого НЧ магнетита отмывали 3 раза дистиллированной водой. Поверхность полученных НЧ магнетита модифицировали цетилтриметиламмония бромидом (Sigma, США) в концентрации 0.06 М, после чего трижды отмывали НЧ дистиллированной водой и высушивали в лиофильной сушилке Labconco (США) в течение 3ч.

Получение иммуномагнитолипосом. Липосомы синтезировали методом гидратации/регидратации [10, 11]. Раствор фосфатидилхолина (0.5%) (Sigma, США), холестерина (0.5%) (Sigma, США) и дистероилфосфоэтаноламин–полиэтиленгликоля (2000) (0.1%) (Avanti Polar lipids, США) в этиловом спирте испаряли в роторном испарителе RV10 control (IKA, Германия) при температуре водяной бани 60°С. К полученной липидной пленке добавляли 0.1 М натрий-фосфатного буфера с НЧ магнетита (1 мг/мл) и перемешивали в течение одной минуты. При получении липосом, содержащих азид натрия (Sigma, США), последний в концентрации 0.03% также вносили в натрий-фосфатный буфер. Антитела к гистону H3 (Cloud-Clone corp., США) инкубировали с реагентом Траута (Sigma, США) 1 ч. Тиолированное антитело добавляли к синтезированным липосомам и инкубировали в течение 12 ч при t = 4°С. Следующим этапом стала диспергация получаемых липосом, для чего растворы подвергали воздействию ультразвука. Облучение проводили в ультразвуком дезинтеграторе Qsonica Sonicators (США) в течение 15 мин (20 кГц, 10-секундный импульс с перерывом 3 с) [12].

Изучение размеров синтезированных наночастиц методом динамического рассеяния света (ДРС). Размер полученных липосом определяли с помощью спектрометра ДРС Zetasizer Nano ZSP (Malvern, Великобритания). Измерения проводили в кювете с длиной оптического пути 1 см при температуре 37°С.

Расчет количества липосом. Для оценки токсичности получаемых липосом необходимо контролировать их содержание в системе. Количество добавляемых к микроводорослям липосомальных НЧ рассчитывали согласно [13].

Количество молекул липидов на одну липосому рассчитывали по формуле

где N_tot – общее количество молекул липидов, d – диаметр липосом, h – толщина бислоя (около 5 нм), a – площадь “головки” липида 0.71 нм², π – математическая константа, выражающая отношение длины окружности к длине ее диаметра.

Количество липосом в растворе вычисляли с учетом молярной массы липидов, входящих в состав липосомы, и их концентрации по формуле

где N_lipo – число липосом; n₁, n₂, n₃ – количество липидов (моль); N_tot – число молекул липидов в одной липосоме; N_A – число Авогадро – 6.02 × 10²³.

Определение токсических свойств наночастиц на примере водоросли Chlorella vulgaris. Методика основана на регистрации различий в оптической плотности тест-культуры водоросли хлорелла, выращенной в водной среде, не содержащей искусственных НЧ (контроль), и в водных дисперсных системах, содержащих тестируемые НЧ (опыт). Критерием токсичности НЧ является снижение на 20% и более величины оптической плотности культуры водоросли, выращиваемой в течение 22 ч (при 37°С) в дисперсной системе НЧ, по сравнению с ее ростом на контрольной среде, приготовленной на дистиллированной воде. Количественная характеристика токсичности при этом определяется общепринятым показателем: индексом токсичности (I) – относительной (процент) величиной прироста оптической плотности для дисперсионной среды по сравнению с контролем:

где ΔD_к и ΔD_дс – средние значения прироста оптической плотности в контроле и дисперсной системе соответственно [14]. Синтезированные иммуномагнитолипосомы добавляли к суспензии микроводорослей в соотношениях клетка/липосома = 1/1–1/1000, инкубировали 22 ч и определяли индекс токсичности. Измерения проводили при длине волны 650 нм. Концентрацию клеток хлореллы контролировали до и после инкубации во всех образцах. Подсчет концентрации клеток проводили с помощью камеры Горяева на микроскопе Микмед-2 (Ломо, Россия). Подсчитывали количество клеток в пяти больших квадратах камеры Горяева. В общее количество подсчитанных клеток включали все клетки, лежащие на верхней и левой сторонах квадрата камеры Горяева, но не учитывали клетки, расположенные на его нижней и правой сторонах [15].

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетов прикладных программ Microsoft Excel 2010. Достоверность различий контрольных и опытных величин устанавливали с использованием t-критерия Стьюдента. В процедурах статистического анализа рассчитывали достигнутый уровень значимости (p), при этом критический уровень значимости в данном исследовании принимали равным 0.05. Полученные данные были представлены в виде среднего арифметического и его стандартного отклонения (M ± Sd).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Структура полученных липосомальных НЧ представлена на рис. 1. Липидный бислой состоит из молекул фосфатидилхолина, холестерина и дистероилфосфоэтаноламин–полиэтиленгликоля (2000), к которому присоединены антитела к гистону H3. НЧ магнетита, покрытые цетилтриметиламмония бромидом ([С₁₆Н₃₃N(CH₃)₃]Br), встраиваются преимущественно в липидный бислой за счет взаимодействия поверхностно-активного вещества с используемыми липидами [16, 17].

Размер липосом контролировали методом ДРС. Исследование размера полученных липосом показало, что липосомальные НЧ имеют размеры 176.4 ± 12.9 нм (рис. 2). Данный размер позволяет рассматривать полученные липосомы в качестве возможного средства адресной доставки лекарственных препаратов.

Токсическое действие липосом оценивали, добавляя синтезированные НЧ в соотношениях клеток хлореллы/липосом от 1/1 до 1/1000. Исследовали влияние “пустых” липосом и липосом, содержащих в своем составе азид натрия в концентрации 0.03%. Данное вещество использовали в качестве модельной системы, позволяющей оценить стабильность липосом и выход лекарственного препарата из них. Азид натрия – токсичное химическое вещество, накапливаясь в митохондриях, вызывает разобщение окислительного фосфорилирования [18]. Исследование индекса токсичности полученных липосом по отношению к водорослям показало, что при соотношении клетка/липосома от 1/1 до 1/100 статистически значимых различий в индексе токсичности не наблюдается (табл. 1).

При увеличении числа липосом до соотношения клетка/липосома = 1/1000 наблюдается снижение индекса токсичности (рис. 3), что говорит об увеличении содержания хлорофилла в суспензии микроводорослей Chlorella vulgaris.

Подсчет концентрации клеток показал, что после инкубации в течение 22 ч в соотношении клетка/липосома = 1/1000 происходит статистически значимое увеличение количества клеток (рис. 4).

Стимуляция роста клеток микроводоросли хлорелла, по-видимому, связана с эффектами оксидов железа, входящих в состав полученных липосом. Железо необходимо для образования хлорофилла. При этом железо катализирует образование предшественников хлорофилла: 5-аминолевулиновой кислоты и протопорфиринов. При недостатке железа нет условий для образования таких важнейших компонентов хлоропластов, как цитохромы, ферредоксин и некоторые другие. Кроме того, целый ряд ферментов содержит железо в негемовой форме. В хлоропластах железо в негемовой форме входит в состав реакционных центров фотосистем I и II [19, 20].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучено влияние синтезированных иммуномагнитолипосом на клетки микроводорослей Chlorella vulgaris. Установлено, что полученные НЧ в исследуемом диапазоне концентраций (соотношения клеток к липосомам от 1/1 до 1/1000) не оказывают токсического эффекта на клетки микроводорослей. Таким образом, результаты имеют практическое значение для оценки биобезопасности липосом, а также для планирования доклинических оценок потенциала их использования в качестве средства адресной доставки лекарственных веществ.

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках государственного задания вузам в сфере научной деятельности на 2020–2022 гг., проект № FZGU-2020-0044.