Российские нанотехнологии, 2023, T. 18, № 1, стр. 38-43

ВВЕДЕНИЕ

Высокие выбросы двуокиси углерода в результате антропогенной деятельности стали глобальной проблемой. Текущие стратегии контроля выбросов CO₂ включают в себя каталитическое восстановление, повышение энергоэффективности, использование менее углеродоемких видов топлива, ядерную энергию, возобновляемые источники энергии и улучшение биологических поглотителей. Одним из альтернативных способов, который естественным образом способствует улавливанию CO₂, является фитосеквестрация – фиксация атмосферного углерода растениями и фототрофными микроорганизмами (водорослями и цианобактериями) [1].

Известно, что ~57% антропогенных выбросов углерода фиксируется и повторно используется в цикле углерода [2] и до 30% глобальной фиксации углерода осуществляется цианобактериями [3]. По эффективности фиксации углекислого газа фототрофные микроорганизмы, в том числе цианобактерии, в десятки раз превосходят наземные растения [4]. Цианобактерии характеризуются высокой скоростью роста, кроме того, за короткие промежутки времени они способны синтезировать и накапливать различные ценные компоненты.

Цианобактерии рода Arthtrospira являются одними из наиболее широко культивируемых в промышленных масштабах фототрофных микроорганизмов в виду высокого содержания белка, а также биологически активных соединений с высокой добавленной стоимостью.

Благодаря присвоению A. platensis статуса GRAS (общепризнано безопасным) и значительному содержанию в ней незаменимых амино- и жирных кислот, антиоксидантов и витаминов биомасса цианобактерии широко используется как пищевая добавка в виде сухого порошка или капсул, а также как кормовая добавка в животноводстве [5]. Помимо этого, в продукты здорового питания могут включаться биологически активные соединения с высокой добавленной стоимостью (каротиноиды, хлорофиллы, полиненасыщенные жирные кислоты и пр.) [6].

Одним из наиболее ценных компонентов, получаемых из биомассы A. platensis, является С-фикоцианин (С-ФЦ) – пигмент-белковый комплекс, обладающий рядом полезных свойств, среди которых антиоксидантные, противовоспалительные, иммуностимулирующие и противораковые [7, 8]. Учитывая эти свойства и естественный насыщенный синий цвет, С-ФЦ используется не только в качестве натурального пищевого красителя, но и как действующий агент для косметической и фармацевтической промышленностей, а также как флуоресцентный краситель в лабораторных исследованиях [9]. Кроме того, возможно использование С-ФЦ в проточной цитометрии, флуоресцентном иммуноанализе и флуоресцентной микроскопии [10].

При рассмотрении крупномасштабного (промышленного) производства биомассы фототрофных организмов (микроводорослей и цианобактерий), а также ценных продуктов, синтезируемых данными организмами, одним из ключевых вопросов для исследователей и инвесторов является определение экономической целесообразности производства. Анализ затрат любого производства зависит от досконального знания всех этапов производственного процесса: от входных данных, баланса массы и энергии до деталей используемого оборудования [11].

Доказано, что на активность ростовых процессов и накопление биомассы Arthrospira, на ее способность синтезировать белки и C-ФЦ влияет ряд химических и физических факторов, а именно, состав питательной среды, концентрация солей, температура, интенсивность освещения, световой режим, а также параметры культивирования и конфигурации фотобиореактора [5].

Arthrospira, будучи алкофильной, характеризуется стабильным ростом на средах с высоким рН (9–11) и высокими концентрациями солей (карбонаты и бикарбонаты) [12]. Отметим, что бикарбонаты включаются в состав компонентов питательной среды для достижения высокой щелочности, обеспечивая при этом постоянное снабжение источником углерода для оптимального роста [5].

Стандартной, классической, эталонной питательной средой для культивирования Arthrospira (Spirulina) является среда Заррука [13] ввиду оптимального состава компонентов, который способствует быстрому росту и высокому выходу (г/л) биомассы. Для крупномасштабного культивирования цианобактерии классический состав питательной среды Заррука подвергался различным модификациям за счет изменения концентрации компонентов, а также с использованием недорогих источников питательных веществ [14]. Кроме того, в качестве альтернативы для обеспечения экономической жизнеспособности производства Arthrospira были рассмотрены сточные воды [15, 16], промышленные отходы, такие как стоки анаэробного сбраживания, меласса [11].

Отметим, что наряду с данными о составах питательных сред одним из ключевых моментов для создания рентабельного производства и экономической эффективности культивирования коммерчески значимых цианобактерий и микроводорослей являются фундаментальные знания о физиологии организма, в том числе для подготовки и производства инокулята [11, 17].

Цель исследования – изучение влияние возраста инокулята на рост цианобактерии A. platensis и накопление С-ФЦ для стандартизации инокулята.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования была выбрана нитевидная цианобактерия Arthrospira platensis В-12619 (ВКПМ).

Условия культивирования. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера (объемом 500 мл с 200 мл питательной среды) на питательных средах трех составов [13, 17, 19] в шейкере-инкубаторе Innova 42R (30°С, 140 об./мин, круглосуточное освещение с плотностью потока фотонов 15 ± 1 мкмоль/(м² ⋅ с)).

Рост и накопление биомассы контролировали по изменению оптической плотности суспензии клеток при 750 нм (OD₇₅₀, спектрофотометр Genesys 10S UV-Vis) и величине рН.

Биомассу собирали центрифугированием (12500 g, 15 мин, SL40R Thermo Scientific, США), дважды промывали дистиллированной водой и до проведения анализов хранили при –20°С.

Определение характеристик посевного материала. Содержание белка определяли согласно [20], липидов – [21, 22], хлорофиллов – [23].

Продуктивность биомассы цианобактерии рассчитывали по формуле

где m_i (мг/л) – выход биомассы с литра среды, t_i (сутки) – время культивирования.

Экстракция С-фикоцианина. Исчерпывающую экстракцию С-ФЦ из предварительно обработанной (трехкратный цикл замораживание/оттаивание: –20/25°C) влажной биомассы проводили 0.1 М натрий-фосфатным буфером (pH 7.00 ± 0.02) при 4°C. Клеточный дебрис отделяли центрифугированием (20 500 g, 30 мин, 4°C), спектры поглощения раствора С-ФЦ снимали в диапазоне 190–700 нм.

Концентрацию (мг/мл) C-ФЦ рассчитывали согласно [24]:

где A_λ – поглощение при λ нм.

Содержание (мг/г) С-ФЦ в биомассе рассчитывали по формуле

где V_э (мл) – объем экстракта С-ФЦ, m_б/м (г) – навеска сухой биомассы цианобактерии A. platensis, взятой для экстракции.

Выход (мг/л) С-ФЦ с литра питательной среды рассчитывали по формуле

где V_э (мл) – объем экстракта С-ФЦ, V_а (л) – объем аликвоты суспензии клеток цианобактерии A. platensis, взятой для экстракции.

Статистический анализ. Численные результаты представлены как среднее значение не менее чем трех независимых повторов (n ≥ 3). Планки погрешностей – стандартное отклонение (SD). Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) и критерий Тьюки использовали для оценки значимости различий (значения p < 0.05 считали статистически значимыми).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно [17] для инициации и поддержания культуры необходима минимальная популяция клеток, тогда как для получения инокулята культуры требуется выращенная концентрированная культура цианобактерии. Различные фазы роста отражают изменения в биохимическом составе биомассы.

С целью стандартизации инокулята исследовали влияние возраста посевного материала на рост цианобактерии A. platensis и накопление С-ФЦ на питательных средах разного состава.

Отметим, что в публикациях, посвященных культивированию цианобактерий и микроводорослей, количество вносимого посевного материала (инокулята) выражается либо в количестве биомассы в пересчете на сухой вес (не более 200 мг/л), либо как процент (объемный) суспензии клеток (не более 10%), либо указывается начальная величина OD при определенной длине волны (560, 680, 720 или 880 нм).

При проведении исследований посевной материал вносили в питательную среду до достижения начальной величины OD₇₅₀ 0.050, что обусловлено результатами предварительных исследований по влиянию исходной концентрации биомассы на рост цианобактерии (данные не приведены). При культивировании A. platensis на классической среде Заррука с начальными величинами OD₇₅₀ 0.050, 0.100, 0.150, 0.200 существенной разницы в конечных (максимальных) значениях не выявлено. Все кривые роста достигали стационарной фазы на 15–16-е сутки (OD₇₅₀ 1.90 ± ± 0.05), что согласуется с результатами, полученными в [25].

Согласно [26] при культивировании фототрофных микроорганизмов в начале лагфазы можно наблюдать некоторую задержку роста, которая, с одной стороны, может быть связана с наличием в посевном материале нежизнеспособных клеток, с другой, может быть обусловлена периодом физиологической адаптации из-за изменений в питательных веществах или условиях культивирования. Следовательно, сократить лагфазу можно при использовании в качестве инокулята клеток в поздней экспоненциальной фазе роста, которые были выращены на той же питательной среде в аналогичных условиях культивирования.

При проведении исследований биомассу A. platensis, используемую в качестве инокулята, выращивали на среде того же состава в условиях, аналогичных эксперименту.

В данной работе исследовали влияние возраста инокулята при культивировании цианобактерии A. platensis на трех питательных средах: среда I – классическая среда Заррука [13] и на двух ее модификациях: среда II – модификации Корнета [18] и среда III – модификации Аиба–Огава [19].

В качестве инокулята использовали 4-, 10- и 17-суточную культуру клеток. В табл. 1 представлены данные о содержании белка, липидов и фотосинтетических пигментов инокулята. Как видно из таблицы, наибольшее содержание белка, липидов и фотосинтетических пигментов отмечено для инокулята, выращенного на среде III. При рассмотрении разновозрастного инокулята отмечено, что 4-суточный инокулят характеризуется максимальным содержанием липидов и белка, за исключением среды II, для которой максимальное содержание белка отмечено для 10-суточного инокулята. Что касается содержания фотосинтетических пигментов (С-ФЦ и хлорофилла), их максимальное содержание было у 10-суточного инокулята независимо от состава среды культивирования.

Кривые роста A. platensis на трех испытуемых средах представлены на рис. 1. Как видно из рисунка, при культивировании цианобактерии на средах I и II стационарная фаза роста, характеризующаяся максимальными значениями OD₇₅₀, достигнута при использовании 17-суточного инокулята (на 25-е и 23-и сутки культивирования – рис. 1а, 1б соответственно). При использовании более молодого инокулята (4- и 10-суточного) стационарная фаза роста достигалась быстрее (15-е и 17-е сутки соответственно независимо от типа используемой среды), при этом максимальная величина OD₇₅₀ была несколько ниже, чем при использовании 17-суточного инокулята. При анализе кривых роста цианобактерии на среде III установлено, что возраст инокулята не оказывал существенного влияния на максимальную величину биомассы (отклонения значений OD₇₅₀ статистически незначимы). Кроме того, кривые роста при культивировании A. platensis на среде III при 4- и 10-суточном инокуляте практически идентичны (рис. 1в).

В табл. 2 приведены данные о максимальном выходе биомассы цианобактерии: при культивировании на среде II выход биомассы с литра среды (1.12–1.18 г/л) был меньше, чем на средах I (1.28–1.42 г/л) и III (1.37–1.42 г/л). Отметим, что биомасса с использованием самого молодого инокулята характеризовалась наибольшей продуктивностью: для среды I продуктивность составила ~95 мг/(л⋅сутки) и ~76 мг/(л⋅сутки) для сред II и III (табл. 2). Независимо от состава питательной среды выявлена зависимость продуктивности биомассы (мг/(л⋅сутки)) от возраста инокулята: снижение продуктивности при увеличении возраста инокулята.

Полученные данные отличаются от полученных ранее для Spirulina platensis (из коллекции Центра изучения автотрофных микроорганизмов Национального исследовательского совета университета Флоренции, Италия) [27]. Согласно которым при культивировании в колбах Эрленмейера на 500 мл с 200 мл питательной среды в экспериментах с 10- и 14-суточным инокулятом был отмечен слабый рост, а при культивировании в 5‑литровых емкостях в опыте с 14-суточным инокулятом роста не наблюдали. Это объяснили тем фактом, что клетки находились в фазе отмирания и была нарушена адаптация к условиям культивирования. Таким образом, используемая в настоящей работе A. platensis B-12619 обладает большей жизнеспособностью.

В результате определения выхода С-ФЦ (мг/л) установлено, что независимо от типа питательной среды максимальный выход достигается при использовании 4-суточного инокулята, при этом максимальный выход на среде II составил ~200 мг/л, на среде I ~300 и ~330 мг/л на среде III.

Таким образом, при культивировании на среде II выход биомассы и С-ФЦ с литра среды был наименьшим для трех исследованных сред. Тогда как среды I и III могут быть рекомендованы для дальнейших исследований процесса масштабирования для выращивания цианобактерии A. platensis B-12619 для получения С-ФЦ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С целью стандартизации инокулята для культивирования цианобактерии A. platensis исследовано влияние возраста инокулята (посевного материала) на рост культуры и накопление С-ФЦ на классической питательной среде Зарукка и двух ее модификациях.

Выявлена зависимость продуктивности биомассы от возраста инокулята для всех испытанных составов питательных сред.

Максимальный выход С-ФЦ не менее 300 мг/л был достигнут при использовании 4-суточного инокулята.

Работа выполнена в рамках тематического плана исследований НИЦ “Курчатовский институт” 1.8. “Создание платформенной технологии для глубокой переработки биомассы фототрофных микроорганизмов с получением широкого спектра востребованной химической продукции”.