Российские нанотехнологии, 2023, T. 18, № 1, стр. 53-62

ВВЕДЕНИЕ

Наночастицы (НЧ) обладают целым рядом особенностей и преимуществ в сравнении с макрообъектами из тех же материалов, включая более развитую поверхность, повышенную реакционную способность, адгезионные свойства и др. [1]. Эти свойства обусловили широкое применение НЧ в промышленности, медицине и экологии, например для химического катализа, адресной доставки лекарств, фотоабляционной терапии, создания биосенсоров и решения множества других задач [2–4]. Традиционно для синтеза НЧ используют физико-химические методы, такие как фотохимическое восстановление, литография, УФ-облучение, лазерная абляция, обработка ультразвуком [1, 5]. Однако эти методы энергозатратны и (или) требуют использования токсичных химических веществ, что ограничивает применение полученных таким способом НЧ [2, 5]. В этой связи особое внимание привлекают так называемые “зеленые” способы получения НЧ – их биосинтез с использованием растительных экстрактов и ферментов, а также живых микроорганизмов (бактерий, водорослей и грибов) при атмосферном давлении и комнатной температуре [2, 3]. В отличие от физико-химических методов “зеленые” методы наносят меньший ущерб окружающей среде и открывают больше возможностей для управляемого синтеза биосовместимых, нетоксичных и стабильных нанокристаллитов с заданными свойствами [2, 6].

Известно, что биосинтез НЧ может протекать как в живых клетках микроводорослей, так и с использованием клеточных экстрактов. Синтезируемые данным способом НЧ имеют полисахаридное покрытие, которое стабилизирует водные взвеси НЧ, предотвращает их агрегацию, увеличивает намагниченность НЧ без ущерба для структуры и других свойств [2, 3, 7]. Размер и форма НЧ зависят от условий культивирования и вида микроводоросли [2, 8]. В живых клетках микроводорослей синтез НЧ возможен на поверхности клеток, в клеточной стенке либо в цитоплазме [2, 5].

Образование металлических НЧ на поверхности клеток происходит в результате адгезии ионов металлов с последующим их восстановлением. В этом процессе участвуют карбонильные группы и аминогруппы углеводов и гликопротеинов поверхностных структур клеток [3]. При внутриклеточном образовании НЧ ионы металлов восстанавливаются с участием НАД·H- или НАДФ·H-зависимых редуктаз [9]. Преимуществом использования живых культур является возможность биосинтеза сверхмалых НЧ (≤5 нм), обладающих уникальными свойствами [7].

Наиболее подробно описаны механизмы, условия и виды микроводорослей для “зеленого” биосинтеза НЧ Au и Ag, в то время как образование НЧ других металлов и соединений требует дальнейшего изучения [8]. Большое внимание уделяется “зеленому” синтезу железосодержащих НЧ, таких как магнетит (Fe₃O₄), маггемит (γFe₂O₃) и пирротин (Fe_{1 –х}S). Эти НЧ биосовместимы, химически инертны, обладают адсорбционной стабильностью и высокой магнитной восприимчивостью. Благодаря этому они являются идеальными кандидатами для доставки лекарственных препаратов к мишеням в организме [10], а также могут применяться для адсорбции и деградации поллютантов из окружающей среды [11]. Способность к синтезу НЧ Fe до настоящего времени была выявлена у представителей ограниченного числа родов микроводорослей (Chlorococcum, Euglena, Chlorella и некоторых других) [8, 11].

Отдельные виды микроорганизмов способны синтезировать НЧ Mn окислением Mn²⁺ до Mn⁴⁺ с образованием частиц нерастворимого оксида марганца [12, 13]. Такие НЧ характеризуются электрокаталитическими и флуоресцентными свойствами, обладают антибактериальной и противогрибковой активностью. Это позволяет применять их для производства суперконденсаторов, литиевых аккумуляторов, в медицине, в аналитической химии, для детоксикации опасных микрополлютантов и в других областях [14]. Синтез НЧ Mn описан преимущественно для клеток бактерий и грибов, их образование в клетках микроводорослей наблюдается значительно реже, за исключением нескольких видов микроводорослей [12].

Активно разрабатываются методы получения НЧ фосфатов различных металлов [15]. Так, НЧ Ca₃(PO₄)₂ и FePO₄ обладают антимикробной и противогрибковой активностью и применяются в медицине (например, для восстановления костной ткани), а также в сельском хозяйстве в качестве эффективных удобрений [15, 16]. Однако образование подобных НЧ хорошо изучено только у клеток дрожжей [15]. В живой природе также часто встречаются полифосфаты – НЧ, содержащие фосфор, кислород и металлы-противоионы (Mg, Ca и Na). Образуют их и микроводоросли, формирующие полифосфаты в разных компартментах клеток в виде включений микрометровых размеров [17].

Микроводоросли известны своей способностью к биоконцентрированию тяжелых металлов, например Сu, Zn, Fe, Co, Mn, Ag [18], в частности, из сточных вод при их очистке. Эти металлы накапливаются и в форме НЧ [3]. Образование некоторых видов НЧ, например НЧ Fe, увеличивает адсорбцию биогенных элементов (P и N), повышая эффективность биологической очистки сточных вод [19]. Таким образом, бросовые ресурсы (сточные воды) возможно использовать не только для получения тоннажных биопродуктов (биоудобрений и биотоплива [20]), но и различных НЧ с применением микроводорослей.

В целом образование НЧ Fe, P, Mn в клетках микроводорослей мало изучено, поэтому поиск и исследование новых культур микроводорослей, способных к синтезу НЧ, – важная фундаментальная и прикладная задача. Цель данной работы – исследование способности нового штамма зеленых микроводорослей из рода Micractinium к формированию НЧ, обогащенных Fe, Mn и P; определение элементного состава НЧ методами аналитической электронной микроскопии; установление локализации НЧ в поверхностных структурах клеток в зависимости от доступности P и Mn в среде культивирования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Условия культивирования. Объектом исследования служила альгологически чистая суспензионная культура оригинального штамма зеленой микроводоросли Micractinium simplicissimum IPPAS С-2056. Данный штамм был выделен из эвтрофицированного фосфором биотопа озера Большая Имандра вблизи апатит-нефелиновой обогатительной фабрики (АНОФ-2, г. Апатиты). Результаты предварительных исследований показали, что M. simplicissimum IPPAS С-2056 адаптирован к существованию в условиях повышенных концентраций фосфатов [21].

Культуру микроводоросли выращивали в периодическом режиме в стеклянных колбах (объем 750 мл) на инкубационном шейкере Innova 44R (“New Brunswick”, США) при постоянном перемешивании (120 об./мин), температуре 23°C и освещении интенсивностью 40 мкмоль фотонов ФАР/(м² · с) на среде BG-11 [22], содержащей 22 мг/л неорганического фосфата (далее P_i) в форме K₂HPO₄, 0.5 мг/л Mn²⁺ (далее Mn) в форме MnCl₂·4H₂O и 1 мг/л Fe²⁺ (далее Fe) в форме Fe₂SO₄·7Н₂О.

Далее культуры инкубировали с высокими концентрациями P_i (1500 мг/л) и Mn (500 мг/л), подобранными по результатам предварительных исследований [21, 23]. Для получения культур с варьированием внутриклеточного содержания фосфора использовали метод последовательного истощения–обогащения культуры P_i [24]. Для получения культур с истощенными внутриклеточными резервами P следовали протоколу, описанному ранее [24], включая осаждение центрифугированием (5 мин, 3000 g; “Eppendorf” 5440R, Германия) и промывание средой, не содержащей P_i, с последующей инкубацией клеток в бесфосфорной среде в течение 14 сут. При восстановлении фосфорного питания к суспензии клеток M. simplicissimum добавляли P_i в форме КH₂PO₄ до конечной концентрации P_i в среде 1500 мг/л и культивировали в течение 7 сут.

Для экспериментов с культивированием микроводоросли в присутствии высоких концентраций ионов Mn клетки предкультуры (указано выше) осаждали центрифугированием, ресуспендировали в среде BG-11 с добавлением Mn (в виде MnСl₂) до конечной концентрации 500 мг/л и культивировали 5 сут.

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ). Мониторинг ультраструктурной организации клеток микроводоросли вели с помощью традиционной ПЭМ ультратонких (менее 70 нм) срезов. Элементный анализ проводили методом аналитической ПЭМ, а именно энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (ЭДРС) полутонких (200−250 нм) срезов. Клетки осаждали центрифугированием (5 мин, 3000 g; “Eppendorf” 5440R, Германия) и фиксировали по стандартному протоколу [25], используя последовательно 2%-ный (по объему) раствор глутарового альдегида в 0.1 М какодилатном буфере (pH 6.8–7.4 в зависимости от pH культуры) в течение 30 мин и 1%-ный (по массе) раствор тетраоксида осмия в том же буфере в течение 4 ч при комнатной температуре.

Обезвоживание фиксированных образцов проводили в серии водных растворов этилового спирта возрастающих концентраций от 30 до 96% (по объему) и троекратно в 100%-ном этиловом спирте (“Sigma”, США). Последнюю процедуру обезвоживания сочетали с контрастированием 2%-ным (по массе) раствором уранилацетата в абсолютном этиловом спирте (“Sigma”, США) в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее образцы заключали в эпоксидную смолу Araldite (“Sigma-Aldrich”, США), проводили полимеризацию при 56°С и получали срезы заданной толщины на ультрамикротоме Leica EM UC7 (“Leica”, Австрия). Срезы монтировали на медные сеточки для электронной микроскопии с ультратонкой подложкой из формвара (“Ted Pella”, США). Для изучения ультраструктуры клеток методом ПЭМ срезы дополнительно контрастировали раствором цитрата свинца [26]. Изображения получали на электронном микроскопе JEM-1011 (“JEOL”, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ, а также на микроскопе JEM-1400Flash (“JEOL”, Япония) при ускоряющем напряжении 120 кВ. Размеры структур определяли по изображениям ПЭМ в программе Fiji (ImageJ) v. 20200708-1553 (“NIH”, США).

ЭДРС полутонких срезов, не контрастированных цитратом свинца, проводили, как описано в [27], на аналитическом электронном микроскопе JEOL-2100 (“JEOL”, Япония), оснащенном светлопольным детектором для работы в режиме сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (СПЭМ) (“JEOL”, Япония) и рентгеновским кремний-дрейфовым детектором X-Max с активной площадью кристалла 80 мм² (“Oxford Instruments”, Великобритания). Энергодисперсионные рентгеновские спектры от выбранных точечных или зональных участков образца регистрировали в диапазоне энергий рентгеновского излучения от 0 до 10 кэВ в режиме светлопольной СПЭМ. Время сбора сигнала для одного спектра составляло 120 с. Регистрацию и обработку энергодисперсионных спектров проводили в режиме “Point&ID” в программе INCA (“Oxford Instruments”, Великобритания). Полученные спектры представлены в диапазоне 0.15–7.00 кэВ, в который входят наиболее интенсивные пики всех биологически значимых элементов, включая Mn и Fe. Во всех спектрах ЭДРС, приведенных в указанном диапазоне, присутствовали полосы характеристического рентгеновского излучения углерода (K_α = 0.28 кэВ) и кислорода (K_α = 0.53 кэВ) – основных химических элементов органических соединений биологических образцов и эпоксидной смолы, используемой в процедуре пробоподготовки. Также в спектрах регистрировались пики меди (L_α = 0.93 кэВ) – основного компонента сеточек, на которые монтировали срезы перед их ПЭМ-анализом, осмия (M_β = 1.91 кэВ) и урана (M_α = 3.16 кэВ, M_β = 3.34 кэВ), использованных при фиксации клеток. Присутствие пиков кремния (K_α = 1.74 кэВ) и алюминия (K_α = 1.49 кэВ) в спектрах относится к элементам аппаратного фона. Перечисленные элементы на спектрах, представленных на рисунках, не аннотировали.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Идентификация НЧ, образующихся при культивировании M. Simplicissimum в средах с различным содержанием фосфатов. Ультраструктурная организация исследуемой микроводоросли M. Simplicissimum соответствовала таковой для представителей родственных таксонов. Ее основные черты включали в себя одноклеточность, наличие одного ядра, одного пристеночного хлоропласта с одним пиреноидом (рис. 1а). Клеточная стенка состояла из двух–трех слоев, различающихся по электронной плотности, но не имела трехламелларного (спорополленин-подобного, или альгинатного) слоя. В цитоплазме были выявлены регулярные органеллы: рибосомы, митохондрии, элементы аппарата Гольджи и вакуоли. Среди запасающих структур кроме крахмальных зерен присутствовали олеосомы в цитоплазме и включения в вакуолях (рис. 1а–1в, 1е).

Рис. 1.

Ультраструктура клеток Micractinium simplicissimum IPPAS С-2056, выращенных на средах с различным содержанием Mn и P_i: ПЭМ-изображения ультратонкого среза клетки (а) и ее периферических участков при 22 мг/л P_i и 0.5 мг/л Mn (б, в); СПЭМ-изображения полутонких срезов участков клеток, анализированных ЭДРС: г, д – периферия клеток после 7 сут в среде с 0 мг/л P_i и 0.5 мг/л Mn; через 4 ч (е), 1 сут (ж), 3 сут (з) после добавления 1500 мг/л P_i; клетки и клеточная периферия после 5 сут инкубации в среде с 22 мг/л P_i и 500 мг/л Mn (и–л). В – вакуоль, КЗ – крахмальные зерна, КС – клеточная стенка, М – межклеточный матрикс. П – пиреноид, Ос – олеосома, Хл – хлоропласт. Наночастицы указаны стрелками.

При анализе срезов клеток, культивировавшихся в среде c 22 мг/л P_i и 0.5 мг/л Mn, было установлено наличие в поверхностном слое клеточной стенки скопления НЧ размером ~3 нм и округлых гранул средней и высокой электронной плотности (рис. 1б). При этом ~90% из их числа имели диаметр от 9 до 37 нм и только 2% более 100 нм. В ЭДРС-спектрах округлых гранул (рис. 2а) идентифицировались пики P (K_α = = 2.01 кэВ), N (K_α = 0.39 кэВ) и S (K_α = 2.31 кэВ). Наряду с клеточной стенкой аналогичные НЧ были обнаружены на поверхности клеток (рис. 1а, 1б), ~90% таких НЧ имели округлую форму и диаметр в диапазоне 8–37 нм. Судя по ЭДРС-спектрам (рис. 2б), эти НЧ содержали P и Fe (K_α = 6.40 кэВ, L_α = 0.71 кэВ). Помимо Fe и P в частицах были зарегистрированы небольшие пики Сa (K_α = 3.70 кэВ) и Mg (K_α = 1.25 кэВ) (рис. 2б, табл. 1). Округлые НЧ (7–36 нм) были выявлены и в пространстве между клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной (периплазме) (рис. 1в), по элементному составу они были схожи с НЧ, обнаруженными на поверхности клеточной стенки (табл. 1). При просмотре срезов клеток, культивировавшихся в среде, не содержащей фосфор, было обнаружено наличие на поверхности клеточной стенки (рис. 1г) и в клеточной стенке (рис. 1д) сверхмалых частиц (1–4 нм), объединенных тонко-фибриллярной сетью. ЭДРС-анализ подтвердил наличие в них Fe (рис. 2в). Через 4 ч после добавления P_i к клеткам, предварительно инкубированным в бесфосфорной среде в течение 7 сут, на поверхности клеток было выявлено образование НЧ размером 1–9 нм (рис. 1е). При ЭДРС-анализе не были детектированы пики P, Ca и Mg, а только небольшие пики Fe (табл. 1). В клеточной стенке НЧ не обнаруживались, при этом в спектрах ЭДРС участков клеточной стенки присутствовали пики P и Ca.

Рис. 2.

Репрезентативные спектры ЭДРС клеток микроводоросли Micractinium simplicissimum IPPAS С-2056. Инкубация с 0.5 мг/л Mn²⁺ и 22.0 мг/л P_i (а, б), инкубация без фосфора (в), а также через 1 сут (г–ж) и 3 сут (з) после добавления 1500 мг/л P_i к клеткам, прединкубированным в бесфосфорной среде. Спектры зарегистрированы с электронно-плотных НЧ, локализованных в клеточной стенке (а, ж), на поверхности клеток (б, в, д, з), в периплазматическом пространстве (e), и в области препарата, не содержащего клеточных структур и межклеточного матрикса (эпоксидная смола, г).

Через сутки после добавления P_i в периплазме и на поверхности клеток M. Simplicissimum формировались НЧ диаметром 16–92 нм (рис. 1ж), содержащие P в сочетании с Са и (или) Mg (рис. 2д, 2е). Наряду с более крупными НЧ на поверхности клеток были обнаружены частицы размером 2–9 нм, содержащие Fe и P, а также частицы размером 1–4 нм, в спектрах которых выявлялся только пик Fe (табл. 1). Наряду с этим в периферическом слое клеточной стенки были выявлены частицы размером 2–9 нм, при ЭДРС-анализе которых было подтверждено наличие в них пиков Fe и P (табл. 1).

Через трое суток инкубации на поверхности клеток идентифицировали НЧ (15–75 нм) смешанного состава, содержащие Fe, P и Ca (рис. 2з). Как и после суточной инкубации, на поверхности клеток были обнаружены прикрепленные сверхмалые НЧ диаметром 1–4 нм, содержащие Fe. Через 7 сут после добавления P_i к клеткам, прединкубированным в бесфосфорной среде, НЧ были выявлены только на поверхности клеток, при этом в спектрах ЭДРС указанных частиц был найден только пик Р.

В спектрах ЭДРС клеточных стенок из всех тестированных образцов были зарегистрированы характеристические рентгеновские излучения, соответствующие азоту и сере.

Идентификация НЧ, образующихся при культивировании M. simplicissimum в среде с высоким содержанием марганца. Культивирование в среде с повышенной, но не токсичной концентрацией марганца (500 мг/л, [23]) не вызывало значительных изменений ультраструктуры клеток. Округлые НЧ размером 10–20 нм были выявлены на поверхности клеток и спорангиев, а также в периферическом слое клеточной стенки (рис. 1и, 1к). На поверхности клеток и спорангиев НЧ образовывали нередко сплошной слой толщиной до 100 нм. В клеточной стенке НЧ располагались в виде волнистых слоев без признаков их слипания между собой. В межклеточном матриксе наряду с округлыми были обнаружены НЧ тетрагональной формы размером до 40−60 нм (рис. 1л). В ЭДРС-спектрах, регистрируемых от скоплений НЧ (рис. 3а–3в), были идентифицированы три пика излучения марганца (L_α = 0.64 кэВ, K_α = 5.89 и K_α = 6.49 кэВ), что указывает на обогащенность этим элементом исследуемых НЧ. В НЧ, локализованных в клеточной стенке, также был выявлен пик Fe (рис. 3а, табл. 1), а в НЧ, расположенных на поверхности клеток и внеклеточном матриксе, – небольшой пик P (рис. 3б, 3в, табл. 1). Интересно отметить, что в спектрах ЭДРС клеточных стенок в этом случае не были зарегистрированы характеристические рентгеновские излучения, соответствующие азоту и сере.

Рис. 3.

Репрезентативные спектры ЭДРС клеток микроводоросли Micractinium simplicissimum IPPAS С-2056, инкубированной с 500 мг/л Mn²⁺ и 22.0 мг/л P_i: электронно-плотные наночастицы в клеточной стенке (а), на поверхности клетки (б) и межклеточном матриксе (в), в области препарата, не содержащего клеточных структур и межклеточного матрикса (эпоксидная смола, г).

ОБСУЖДЕНИЕ

Многие виды фотоавтотрофных микроорганизмов, такие как Chlorococcum sp., Chlorella sp., Euglena gracilis, Klebsormidium flaccidum, Anabaena flos-aquae, Spirulina platensis и Calothrix pulvinate, способны синтезировать широкий спектр НЧ [4, 28]. Предполагается, что гидроксильные, карбоксильные и аминогруппы различных компонентов клетки микроводорослей могут выступать в качестве восстанавливающих и стабилизирующих агентов. Образование НЧ может происходить на поверхности клеток, в клеточной стенке, а также в цитоплазме, но точные механизмы биосинтеза до сих пор не известны [2].

Новый штамм M. simplicissimum IPPAS C-2056 привлек внимание по причине его толерантности к действию высоких концентраций экзогенного фосфата и марганца, описанной в [21, 23].

Исследования по изучению токсичности высоких концентраций фосфатов на клетки этой зеленой миководоросли показали, что одним из механизмов, обеспечивающих ее высокую толерантность к избытку экзогенного P_i (до 14 г/л), является помимо образования обильных и разнообразных внутриклеточных обогащенных фосфором включений способность адсорбировать фосфор на поверхности клеток и в клеточной стенке, таким образом препятствуя проникновению его избытка внутрь клетки [21]. Именно в этой работе мы впервые столкнулись с детекцией Fe в спектрах ЭДРС от клеточной стенки.

При подробном исследовании микроводоросли M. simplicissimum, выращенной в средах с различным содержанием фосфатов, было выявлено образование фосфорсодержащих НЧ, локализующихся на поверхности клеток, в периферическом слое клеточной стенки и периплазме (табл. 1). Помимо пиков P в спектрах ЭДРС от таких НЧ в большинстве случаев были идентифицированы пики Mg и/или Ca. Такой элементный состав НЧ и специфическая флуоресценция поверхностных структур клеток, окрашенных красителем 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) [21], могут указывать на то, что эти НЧ содержат P в форме полифосфатов. Косвенным подтверждением этой гипотезы может служить присутствие в клеточной стенке заметных количеств азота и серы, возможно, принадлежащих белкам-ферментам биосинтеза полифосфатов [29].

Помимо фосфорсодержащих НЧ было обнаружено образование сверхмалых НЧ размером до 5 нм, содержащих Fe, локализующихся преимущественно в клеточной стенке и на ее поверхности (рис. 1б, 1г–1з, 2б, 2в, 2ж, 2з, табл. 1). Присутствие пика кислорода в спектрах ЭДРС от этих НЧ не исключает участие в них кислорода в виде оксидов железа.

В процессе биосинтеза НЧ Fe клетками микроводорослей выделяют три фазы [30–33]: активации (медленный рост НЧ и частичное восстановление ионов металлов биомолекулами), роста (полное восстановление ионов металлов с агрегацией НЧ) и терминации (возникновение покрытия из слоя биомолекул, переход НЧ в стабильную форму и их обособление). Синтезированные физико-химическими методами НЧ, как правило, реакционноспособны и легко подвергаются окислению кислородом воздуха, их суспензии неустойчивы и легко агрегируют. Напротив, НЧ, полученные методами “зеленого” синтеза, более устойчивы в силу наличия “покрытия” из полисахаридов и других биомолекул [2]. Отметим, что изученная микроводоросль M. simplicissimum способна к биосинтезу НЧ Fe при сравнительно низких концентрациях ионов этого металла в среде. Так, для синтеза НЧ Fe к культурам Chlorella sp., Chloroccum sp. и Euglena gracilis добавляли от 0.5 г до 10 г/л ионов Fe²⁺, в то время как клетки M. simplicissimum синтезировали НЧ при значительно более низких концентрациях Fe²⁺ в среде (1 мг/л) [7, 11].

Помимо НЧ FeO_x клетки микроорганизмов могут синтезировать НЧ фосфата железа. Так, при добавлении к клеткам дрожжей хлорида железа ионы Fe³⁺ связываются с гидроксильными группами и аминогруппами белков поверхностных структур клеток; при последующем добавлении фосфата натрия на поверхности клеток образуются НЧ фосфата железа [34]. В представленных экспериментальных условиях клетки M. simplicissimum помимо НЧ, содержащих только Fe либо P, формировали НЧ смешанного состава: в их спектрах ЭДРС одновременно с Fe и P выявлялись Ca и (или) Mg (рис. 2б, 2ж, 2з, табл. 1), которые отличались, как правило, более крупными размерами (см. выше). Клетки M. simplicissimum, прединкубированные в бесфосфорной среде, формировали в клеточной стенке и на ее поверхности НЧ, содержащие Fe, но не содержащие P, Ca, Mg. Интересно, что при восстановлении фосфорного питания (добавлением P_i) образование НЧ смешанного состава, включавших P, наблюдалось только через сутки. Возможное объяснение этого явления связано с предполагаемым присутствием P в составе НЧ именно в форме полифосфатов. В этом случае для ассимиляции экзогенного P_i и конверсии его в полифосфаты требуется энергия (обычно в виде аденозинтрифосфата, генерированного в ходе фотосинтеза) и время для активации метаболизма клетки после выхода из фосфорного голодания [35].

У микроводоросли M. simplicissimum была обнаружена способность к образованию НЧ марганца в самых разных внеклеточных сайтах и структурах: на поверхности клеток, в клеточной стенке, оболочке спорангиев и в межклеточном матриксе. Известно, что этот процесс связан с окислением растворенного в среде Mn²⁺ до Mn⁴⁺ и образованием нерастворимого оксида марганца [14, 36, 37]. Окислению могут способствовать рост pH среды при поглощении клетками неорганического углерода и синтез активных форм кислорода внеклеточными пероксидазами, участвующими в “сшивке” молекул клеточной стенки [12]. Отметим, что в составе клеточной стенки НЧ Mn были обнаружены преимущественно в ее периферическом слое, при этом в их локализации отмечалась упорядоченность, что может свидетельствовать об участии в их синтезе ферментных комплексов клеточной стенки, а не только спонтанных химических реакций. Возможно, способность M. simplicissimum к синтезу широкого спектра НЧ Mn детерминирована развитыми поверхностными структурами этого организма. Известно, что экзополисахаридный межклеточный матрикс бактерий, водорослей и грибов, в котором возможно повышение рН и концентрации различных субстратов и ферментов, выделяемых клетками, может быть местом образования и адсорбции НЧ MnO_x [37]. Сайтами связывания ионов металла в клеточной стенке микроводорослей могут быть также тиоловые группы белков, аминокислот, карбоксильные группы пектинов, белков, уроновых кислот [2]. Однако в проведенных экспериментах в поверхностных структурах и межклеточном матриксе M. simplicissimum не были обнаружены характеристические рентгеновские излучения азота и серы, что, очевидно, обусловлено пределами чувствительности метода ЭДРС (регистрировали не точечные спектры, региональные для зон скопления НЧ). В спектрах НЧ были детектированы также небольшие пики P и Fe (рис. 3).

Помимо поверхностных структур пики Mn были обнаружены в вакуолярных фосфорсодержащих включениях, по элементному составу схожих с гранулами полифосфатов [17]. Накопление Mn в такой форме описано для микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii [38]. Физиологическое значение интенсивного образования НЧ Mn на поверхности клеток и в межклеточном матриксе, а также структурированного накопления НЧ Mn в клеточной стенке и оболочке спорангиев может быть связано с необходимостью исключить избыток потенциально токсичного Mn из метаболически активных компартментов, препятствуя его проникновению внутрь клетки. Эти представления соответствуют выявленной в [23] толерантности M. simplicissimum к высоким концентрациям этого тяжелого металла.

Отметим, что при повышенных концентрациях экзогенных P и Mn непосредственно в области препарата, не содержащего клеточных структур и межклеточного матрикса (эпоксидная смола), частицы, обогащенные этими элементами, не были обнаружены, что указывает исключительно на биогенную природу НЧ.

В целом полученные данные позволяют сделать вывод о высоком потенциале исследованного штамма M. simplicissimum IPPAS С-2056 для “зеленого” синтеза разнообразных по составу и размерам НЧ, содержащих Mn, Fe и P. Вероятно, одним из его детерминантов является высокая толерантность данной микроводоросли к экзогенным уровням P_i и Mn. Полученные данные, а также опубликованные позволяют предположить, что и другие виды микроводорослей, толерантные к высоким уровням поллютантов, могут быть использованы для получения НЧ, синтез которых традиционными физико-химическими методами был бы затруднителен. Существенно и то, что на характеристики синтезируемых клетками НЧ влияют состав и концентрация соединений соответствующих элементов в среде культивирования. Это открывает возможности для параметрического управления “зеленым” синтезом НЧ клетками микроводорослей, но и требует дополнительных исследований. Особого внимания заслуживают поиск и исследование новых штаммов микроводорослей – потенциальных продуцентов НЧ с ценными свойствами.

Авторы выражают благодарность сотрудникам кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Л.Р. Семеновой, И.О. Селях и П.Н. Щербакову за помощь в культивировании в экспериментах последовательного истощения–обогащения культуры M. simplimissimum фосфатами и предоставление образцов суспензий клеток для приготовления препаратов ПЭМ.

Исследования методом ПЭМ проведены с использованием оборудования ЦКП “Электронная микроскопия в науках о жизни” МГУ им. М.В. Ломоносова (УНУ “Трехмерная электронная микроскопия и спектроскопия”).

Выявление субклеточного распределения Mn выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант № 21-74-20004). Анализ фосфатных НЧ выполнен при поддержке Научно-образовательной школы МГУ “Молекулярные технологии живых систем и синтетическая биология”.