Российские нанотехнологии, 2023, T. 18, № 2, стр. 233-240

ВВЕДЕНИЕ

Семейство цитокинов (ЦТ), насчитывающее несколько сотен пептидных и белковых молекул с массами 3–50 кДа, активно изучается с момента открытия наиболее значимых из них – интерферонов (ИФН) [1]. Как регуляторы межклеточных взаимодействий ИФН вместе с другими ЦТ участвуют во всех биохимических процессах жизненного цикла организма, включая процессы, формирующие иммунный ответ. Врожденный клеточный иммунный ответ определяет вероятность заражения, характер течения и исход многих заболеваний, в том числе вирусных, борьба с которыми составляет приоритетную задачу мирового здравоохранения [2].

Глобальные угрозы пандемии COVID-19 связаны прежде всего с мутациями вируса SARS-CoV-2 [3], высокая изменчивость и резистентность которого диктуют необходимость поисков новых противовирусных средств широкого спектра действия. Одно из наиболее перспективных направлений этих поисков предполагает активацию врожденного клеточного иммунитета [4].

В норме клетки имеют хорошо сбалансированную систему механизмов, использующих клеточные ЦТ и формирующих адекватный противовирусный иммунный ответ. Например, в случае гриппа иммунная система после распознавания патогена начинает продуцировать ИФН, активизирующие экспрессию провоспалительных ЦТ, вызывающих адекватный воспалительный ответ. Последующая секреция противовоспалительных ЦТ, среди которых ключевую роль играет интерлейкин ИЛ-10, приводит к торможению репликации вирусных частиц (ВЧ), снижению воспалительного ответа, подавлению иммунопатологических процессов и заживлению возможных повреждений клеточных тканей. Иммунный клеточный ответ на вирус SARS-CoV-2 иной [5]. Синтез ИФН здесь запускается с достаточно большой задержкой и в меньшей степени. Первичный воспалительный ответ при этом может быть чрезмерным. Активности противовирусных агентов может оказаться недостаточно для подавления процессов репликации ВЧ. Как следствие, становятся возможными неконтролируемое продуцирование ЦТ и быстрое развитие гиперцитокинемии, которое приводит к летально опасной полиорганной недостаточности, так называемому “цитокиновому шторму” [6]. По современным представлениям неадекватный клеточный иммунный ответ является ключевой детерминантой патогенеза всех осложненных заболеваний COVID-19 [7, 8]. Поэтому требуются новые молекулярные иммуномодуляторы со свойствами регуляторов и провоспалительных, и противовоспалительных ЦТ. На роль таких модуляторов могут претендовать соединения гетерополикислот (ГПК) – обширной группы полиоксометаллатов (ПОМ), все свойства которых, в том числе биологические, допускают тонкую целевую подборку [9–11].

Давно известные, во многом уникальные, биологические свойства ПОМ недавно были дополнены примерами повышенной противовирусной активности ГПК в отношении флави- и коронавирусов [12–14] и ГПК-стимулированной экспрессии генов иммуноактивных ЦТ в нормальных фибробластах эмбриона человека (ФЭЧ) и раковых (А549 и L 41) клетках [15–17]. Природа новых, перспективных для борьбы с вирусными инфекциями, биологических свойств ГПК в литературе до сих пор не обсуждалась.

Цель настоящей работы – анализ и систематизация экспериментальных результатов, полученных в [12–17], и построение на этой основе молекулярных моделей биохимических процессов, определяющих повышенные противовирусные свойства ГПК в отношении (+)оцРНК-вирусов и формирующих уникальные иммуномодулирующие свойства ГПК в отношении нормальных и раковых клеток.

Решения этих задач, приведенные ниже, получены с учетом выводов работ [18–20], в которых впервые был обнаружен и интерпретирован новый, фундаментальный для биохимии ПОМ эффект – истощение многозарядными анионами ГПК холестерина в бислойных липидных мембранах, позволивший построить протонно-анионную модель многоэтапного (последовательного) разрушения клеток и ВЧ водными растворами ГПК. Молекулярная модель формирования иммуномодулирующих свойств ГПК, предложенная в настоящей работе, учитывает не замеченные ранее корреляции иммуноактивных ГПК с механическими свойствами клеток-мишеней, их жесткостью.

Новые результаты, полученные в работе, дают простое объяснение природы повышенной противовирусной активности ГПК в отношении флави- и коронавирусов, бислойные липидные мембраны которых формируются из внутриклеточных, т.е. малохолестериновых, липидных мембран. Высокая активность ГПК при этом объясняется совместным действием двух механизмов инактивации ВЧ. Один из них связан с прямым разрушением ВЧ многозарядными анионами ГПК. Такое разрушение описывается протонно-анионной моделью, построенной в [19, 20], где изучались процессы инактивации вирусов гриппа А концентрированными водными растворами ГПК Кеггина (25–250 мкМ). Второй механизм, впервые обозначенный в [15–17], связан с воздействием на ВЧ иммуноактивных (противовирусных) ЦТ, которые при концентрациях 0.5–15 мкМ, представляющих наибольший интерес, продуцируются клетками при разрушении ВЧ гетерополикислотами. Отметим, что во множество ВЧ с малохолестериновыми липидными мембранами помимо флавивирусов [12, 13] и коронавирусов [14] входят пандемические штаммы SARS-CoV-2 [21, 22]. Возможность инактивации этих вирусов растворами ПОМ продемонстрирована в [23].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы. Использовали водные растворы гетерополикислот Кеггина H₃PW₁₂O₄₀, H₃PMo₁₂O₄₀, H₄SiW₁₂O₄₀, H₄SiMo₁₂О₄₀ (с начальными концентрациями 0.01 мкМ), воздействовавшие на перевиваемые линии клеток ФЭЧ, а также онкоклетки карциномы легкого человека (А549) и клетки костного мозга больного лейкемией (L41), полученные из коллекции культур клеток ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава РФ. Клетки культивировали в средах Игла и Игла МЭМ производства ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им М.П. Чумакова РАМН. В культуральную среду добавляли 10% эмбриональной телячьей сыворотки фирмы “ПанЭко”.

Методы. Цитотоксическое действие ГПК Кеггина определяли с помощью метилтетразолиевого теста. Клетки рассевали на 96-луночную панель фирмы Wink в концентрации 2 × 10⁵ кл./мл в каждую лунку в объеме 100 мкл с последующим внесением растворов ГПК в количестве 100 мкл в разведении от 1/2 до 1/2048. Клетки инкубировали в термостате при 37°С в атмосфере с 5%-ной СО₂ при 98%-ной влажности в течение 72 ч.

Определение активности мРНК цитокинов в клетках после воздействия на них ГПК проводили с использованием методов обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. Клетки помещали в шестилуночные панели в концентрации 2 × 10⁵ кл./мл, инкубировали 24 ч до образования монослоя. Затем после смены среды в лунки вносили разбавленные водные растворы ГПК (для разведений начальных 1/10, 1/20, 1/100, 1/500). Экспрессию генов интерлейкина ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-17, ИЛ-18, фактора некроза опухолей (ФНО) ФНО-α, интерферона ИФН-α, ИФН-β, ИФН-γ, ИФН-λ1, ИФН-λ2, ИФН-λ3 оценивали по активности их мРНК. Регистрацию результатов ПЦР осуществляли электрофоретически в 2.5%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Для идентификации нуклеотидных последовательностей использовали маркер для электрофореза фирмы Promegа (G 1758) (17–19). В качестве положительного контроля использовали β-актин.

Уровень продукции цитокинов ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИФН-α определяли методом иммуноферментного анализа на коммерческих тест-системах согласно протоколу фирмы-производителя Вектор-Бест (Новосибирск).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

Активация экспрессии генов иммуноактивных цитокинов гетерополикислотами (эксперимент [15–17]). Результаты экспериментов, характеризующие особенности ГПК-активации (и дезактивации) экспрессии генов ЦТ в нормальных и онкоклетках, приведены в табл. 1–3. Основными, установленными в работе, особенностями клеточной активации генов ЦТ гетерополикислотами отметим ярко выраженные зависимости этих процессов от элементного состава ГПК и выбора клеток-мишеней. Эти особенности, дополненные корреляциями результатов, полученных инструментальными методами анализа, с механическими свойствами клеток-мишеней, будут использованы ниже при формулировке молекулярных моделей образования частиц-паттернов в условиях воздействий ГПК на незараженные клетки, нормальные и раковые (линии ФЭЧ, А549 и L 41) [15–17], а также на клетки почки собаки, HeLa и Vero, зараженные флавивирусами [12, 13] и коронавирусами [14].

Отметим также, пользуясь табл. 1, возможность сосуществования разнонаправленных изменений уровней продуцирования про- и противовоспалительных ЦТ. Это имеет место, например, для H₃PW₁₂O₄₀. При выраженном (почти двукратном) увеличении количества интерферона (ИФН-α) здесь может наблюдаться значительное снижение уровня провоспалительных ЦТ, что представляет интерес в связи с отмеченной выше необходимостью коррекции ЦТ-системы на начальном этапе заболевания COVID-19 [5–8]. Особый интерес представляют и случаи активации ИФН на фоне дезактивации ИЛ-10.

Интерфероны, в частности α, β и γ, снижают пролиферацию инфицированных клеток, активно ограничивая общее распространение вирусов. Терапевтический эффект ИФН на ранних этапах различных вирусных заболеваний, в том числе вызванных вирусом SARS-CoV-2, хорошо известен [24, 25]. Однако роль ИЛ-10 в генезисе вирусных заболеваний может быть неоднозначной [26]. Давно известный как мощный противовоспалительный депрессант в тяжелых случаях COVID-19, особенно на ранних этапах этого заболевания, ИЛ-10 может приобретать свойства активного провоспалительного агента, способствующего развитию полиорганной недостаточности (цитокинового шторма). В этой связи можно отметить, что в ряде работ последних лет ставилась сложная поисковая задача, нацеленная на синтез эффективных и селективных ингибиторов ИЛ-10 (например, [28]). Согласно данным табл. 2 такими ингибиторами могут быть ГПК Кеггина.

Современная практика применения ЦТ-профилей в качестве маркеров каких-либо заболеваний или патологий исходит из предположения о зависимости механизмов синтеза различных ЦТ от функционального состояния соответствующих клеток-продуцентов. Для ГПК-стимулированной клеточной активации экспрессии генов ЦТ эту зависимость демонстрируют результаты экспериментов [15–17], собранные в табл. 1–3. Анализ этих результатов приводит к построению молекулярной модели клеточной ГПК-регуляции синтеза ЦТ, что подтверждает выводы [15–17] о возможном участии ЦТ в формировании противовирусной активности ПОМ, действующих на зараженные клетки.

Анализируя табл. 2, 3, можно заметить более высокую активность ГПК в случае клеток ФЭЧ по сравнению с онкоклетками (A549 и L41). Действительно, для клеток ФЭЧ изменения уровней мРНК достоверно наблюдаются для всех ЦТ и всех четырех ГПК. В отношении раковых клеток изменения уровней мРНК цитокинов наблюдались значительно реже. Для клеток A549 такие изменения (снижение мРНК интерлейкина ИЛ-10) были отмечены только для H₃PW₁₂О₄₀. В случае онкоклеток L41 синтез мРНК всех интерферонов для всех ГПК был бóльшим, но все же вдвое меньшим, чем в случае нормальных клеток ФЭЧ. Для клеток L41 примерно в половине экспериментов наблюдалась специфическая ГПК-стимулированная экспрессия генов ИЛ-8, -10 и -18, а также генов ИФН-α, -β, -γ и -λ. При этом уровень генов ФНО для всех гетерополикислот оставался практически неизменным.¹¹

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Несовпадение иммуномодулирующих свойств ГПК для раковых и нормальных клеток, впервые обнаруженное в [15–17], – факт, в целом, ожидаемый, поскольку эти клетки кардинально различаются и по строению, и по своим биологическим (функционально значимым) свойствам [29, 30]. Столь же естественен и факт снижения иммунного ответа на действие ГПК при раковом перерождении клеток. Клетки нередко прибегают к различным адаптациям своих биологических свойств к меняющимся внешним условиям. Итогом адаптаций оказывается снижение активности естественных защитных механизмов, в частности возникновение лекарственной устойчивости.

Корреляции иммуномодулирующих свойств ГПК с механическими свойствами клеток-мишеней и содержанием в них мембранного холестерина. Чтобы установить природу адаптаций раковых клеток к воздействию ГПК, рассмотрим корреляции иммунного ответа с механическими свойствами нормальных и онкоклеток клеток. Для этого, учитывая отмеченные выше особенности ГПК-стимулированной экспрессии генов ЦТ в здоровых (ФЭЧ) и в раковых (L41 и А549) клетках, запишем строгие неравенства для иммуномодулирующих активностей (ИА) ГПК, действующих на соответствующие клетки-мишени:

Принципиально важно, что неравенства (1), как можно убедиться, положительно коррелируют с жесткостями (модулями Юнга, Е_s) соответствующих клеток-мишеней. Значения Е_s хорошо известны из экспериментов, в которых механические свойства живых клеток, в частности клеток ФЭЧ, М549 и L41, исследовались методами атомно-силовой спектроскопии [31–37]. Согласно выводам и результатам этих работ имеем совокупность следующих строгих неравенств:

Сопоставляя неравенства (1) и (2), приходим к основному выводу анализа результатов экспериментов, приведенных в [15–17] и [31–37], – иммунный клеточный ответ на действие ГПК оказывается тем выше, чем больше жесткость соответствующих клеток-мишеней. Природу этой корреляции, которая указывает на ключевую роль в ГПК-активации экспрессии генов ЦТ биофизических процессов, зависящих от механических свойств клеток-мишеней, можно понять, если учесть зависимости жесткости живых клеток от липидного состава их плазматических мембран (ПМ).

В последнее десятилетие во многих работах (например, [38–40]) было установлено, что механические свойства живых клеток, такие как жесткость, эластичность, деформируемость, силы сцепления (адгезии), а также текучесть и проницаемость их ПМ, в решающей степени зависят от содержащегося в клетках холестерина (ХОЛ). Его межкомпартментное распределение существенно неоднородно. В норме ХОЛ (до 70–90% от общего количества) в основном содержится в ПМ и только малая его часть (~1–5%) приходится на внутриклеточные компартменты (на мембраны эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи [41]). Ориентируясь на корреляции (1), (2), ограничимся анализом влияния мембранного холестерина (мХОЛ) только на жесткость клетки.

Физические параметры, характеризующие твердость, вязкость и прочность модельных бислойных мембран (мБCМ), обычно положительно коррелируют с содержащимся в них холестерином [42]. То есть значения этих параметров тем больше, чем больше в мБСМ холестерина. Это находит объяснение в рамках физических моделей, адекватно учитывающих особенности строения молекул ХОЛ и фосфолипидов и связанный с этим характер межлипидных взаимодействий в БСМ. Молекулы ХОЛ занимают в бислойных липидных мембранах свободное пространство между гидрофобными хвостами сфинголипидов, не позволяя им изгибаться. Снижение количества пустот в липидном бислое модельных мембран приводит к повышению их механических характеристик, таких как жесткость, плотность, вязкость и прочность. То есть увеличение содержания ХОЛ в бислойных мембранах независимо от его причин всегда сопровождается повышением прочности поверхностных (оболочечных) структур. Снижение количества холестерина в мБСМ сопровождается, соответственно, противоположными изменениями [43]. Характер изменений механических свойств клеточных мембран при вариациях содержащегося в них ХОЛ может оставаться таким же, как в случае модельных мембран, но корреляции количества мХОЛ с жесткостью клетки (модулем Юнга) оказываются противоположными, они отрицательны [44–46]. То есть снижение ХОЛ в клеточной мембране сопровождается не уменьшением, но повышением жесткости клеток как целого. Этот экспериментальный факт, впервые установленный в [46], на первый взгляд, возможно, неожиданный, находит объяснение в рамках сложившихся представлений о силах сцепления (адгезии) холестериновых рафтов с примыкающими к ним участками актинового цитоскелета. Снижение холестерина в ПМ в рафтах сопровождается накоплением белков адгезии, одновременно в цитосклетах происходят структурные перестройки, что совокупно повышает прочность и жесткость клеток как целого. Отсюда следует принципиально важный вывод, что корреляции (1) и (2) можно дополнить двумя новыми неравенствами, которые соответствуют содержанию в клетках ФЭЧ, М-549 и L41 мембранного холестерина (мХОЛ)²²:

Сопоставляя неравенства (1), (2), (3), приходим к основному выводу анализа имеющихся экспериментальных данных – иммуномодулирующая активность ГПК отрицательно коррелирует с количеством мХОЛ в клетках-мишенях. С учетом результатов [19, 20] сделанный вывод позволяет сформулировать молекулярную модель экспрессии клеточных генов ЦТ гетерополикислотами.

Обогащение холестерином клеточных мембран как фактор, снижающий иммунный ответ клеток на воздействие ГПК. Известно, что вне воспалительной реакции и вне иммунного ответа ЦТ в клетках не синтезируются. То есть экспрессия генов клеточных ЦТ, впервые наблюдавшаяся в [15–17], – это существенно индуцибельный процесс. В этой связи возникает вопрос о физической природе частиц-паттернов в экспериментах по клеточной активации ЦТ [15–17] и механизмах молекулярных процессов, лежащих в основе корреляций (1)–(3). Ответ находим в модели многоэтапного (последовательного) разрушения бислойных клеточных мембран, аналогичной протонно-анионной модели, которая использовалась для описания деструкции ВЧ гриппа А многозарядными анионами ГПК [19, 20]. Согласно предлагаемой ниже модели паттернами, распознаваемыми клеточными рецепторами, запускающими последующие каскады процессов синтеза ЦТ, являются фрагменты частично (или полностью) разрушенных клеток.

Процессы нарушения (или разрушения) структуры и/или состава каких-либо клеточных компартментов – это один из многочисленных возможных механизмов формирования цитотоксических свойств ГПК. Во всех известных случаях высокие значения индекса цитотоксичности, СС₅₀, препятствуют практическому применению потенциально перспективных ПОМ-препаратов. Снижение цитотоксичности соединений ГПК – приоритетная задача современной биохимии ПОМ, успех решения которой во многом предопределяется объемом достоверной информации о динамике молекулярных процессов, ответственных за нарушение жизнеспособности соответствующих клеток-мишеней. Такая информация сегодня отсутствует.

Ограничимся анализом динамики первичных процессов взаимодействий ГПК с бислойными липидными мембранами, которые сводятся к актам неупругих отражений многозарядных анионов от бислойных липидных мембран [20]. Согласно [48–51] такие акты осуществляются по механизму образования и последующего распада долгоживущих поверхностных комплексов, в состав которых вместе с анионами ГПК могут входить различные мембранные липиды. В клетках чаще всего это ХОЛ, энергия связи которого с другими липидами мембраны минимальна. Поэтому распады поверхностных комплексов сопровождаются заметным уменьшением количества мХОЛ (до 50–60%) [18]. Это снижение приводит к начальному снижению прочности клеточной мембраны, росту поверхностного натяжения, способствующего образованию разрывов, повышению проницаемости ПМ за счет образования нанопор, экспоненциальному росту размеров дефектов со временем и заключительному лизису клеток [20]. Ясно, что лимитирующим процессом, определяющим кинетику и константы скоростей процессов разрушения мембраны, являются первичные акты истощения ХОЛ, которые тем более существенны, чем меньше содержание ХОЛ в клетке-мишени.

Возможности инактивации коронавирусов гетерополикислотами. Инактивация вирусов гриппа А концентрированными водными растворами ГПК исследовалась в [19, 20], где было установлено, что при высоких концентрациях (25–250 мкМ) инактивация осуществляется по механизму последовательного многоэтапного разрушения ВЧ, стартующего с истощения мХОЛ анионами с последующим подключением процессов закисления матриксных и капсидных белков протонами среды.

Липидные мембраны гриппа А, как и мембраны других (–)оцРНК-вирусов, формируются из поверхностных микродоменов (рафтов) соответствующих клеток-хозяев. Рафты, занимающие 10–15% общей поверхности клетки, существенно обогащены ХОЛ. В среднем они содержат до 50–70% всего клеточного ХОЛ, т.е. в рафтах и, соответственно, вирусных оболочках холестерина может быть в 3–5 раз больше, чем в свободных от рафтов участках ПМ. Рафты утолщены и малопроницаемы, их жесткости и прочности, зависящие от молярного содержания в них ХОЛ, в сравнении с внерафтовыми участками ПМ повышены. Поэтому повышены и механические свойства вирусных мембран. Как следствие, при высоких концентрациях ГПК, необходимых для эффективной инактивации ВЧ гриппа, воздействие ГПК на зараженные клеточные ткани, стартуя, видимо, с внерафтовых участков, приводит к преимущественному разрушению менее прочных ПМ. Использование концентрированных растворов ГПК в качестве противогриппозных препаратов по этой причине исключено.

Однако можно ожидать, что для обширного семейства (+)оцРНК- вирусов, включающего коронавирусы (в том числе, SARS-CoV-2) и флавивирусы, соотношения между скоростями разрушения клеточных и вирусных мембран во многих случаях будут обратными. Мембраны этих вирусов, как хорошо известно, формируются из внутриклеточных мембран (мембран эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи), в которых содержание ХОЛ не превышает 1–5%. В этих условиях молярное содержание ХОЛ в вирусных мембранах может быть меньше содержания холестерина в ПМ. Процессы разрушения ВЧ анионами ГПК в этих условиях, по-видимому, должны превалировать.

Заметим, что на быстрое разрушение ВЧ в этих случаях косвенно указывают результаты, в которых сообщалось о высокой противовирусной активности ГПК в отношении коронавирусов [14] и некоторых флавивирусов [13]. Характерные значения ЕС₅₀, которые здесь наблюдаются, для ГПК часто находятся в диапазоне ~0.5–10 мкМ, что соответствует значениям терапевтических индексов SI (СС₅₀/ЕС) на уровне 10² и выше (в отдельных случаях до 10⁴).

Причины столь высокой противовирусной активности ГПК в отношении флавивирусов [13] и коронавирусов [14] в литературе до сих пор не обсуждались, хотя деструкция ВЧ как механизм ГПК-инактивации флавивирусов уже была установлена в [14], где наблюдалось образование в ВЧ сквозных отверстий – микроскопических поверхностных дефектов, возникающих в бислойных липидных мембранах на этапе истощения ХОЛ.

Высокая активность ГПК как новых эффективных неспецифических препаратов, инактивирующих (+)оцРНК-вирусы, – это, видимо, следствие совместного влияния двух механизмов – снижения прочности вирусных мембран, сформировавшихся из низкохолестериновых внутриклеточных органелл (легко разрушаемых по протонно-анионному механизму [19, 20]), и активации противовирусных ЦТ (возможно, в основном интерферонов), впервые обнаруженной в [15–17] и проанализированной выше. Можно предположить, что надлежащая оптимизация состава и строения соединений ПОМ, нацеленная на ускорение деструкции непрочных (малохолестериновых) липидных оболочек (+)оцРНК-вирусов, может быть новым и перспективным направлением поисков антиковидных терапевтических средств, свободных от недостатков, присущих препаратам, нацеленным на белковые (кодируемые) мишени.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обнаружена корреляция иммуномодулирующих свойств ГПК с механическими свойствами (жесткостью) клеток-мишеней и содержанием в них мембранного холестерина.

Получена молекулярная модель ГПК-активации экспрессии генов иммуноактивных цитокинов в нормальных и раковых клетках.

Определена молекулярная модель формирования повышенной противовирусной активности ГПК в отношении корона- и флавивирусов.

Обоснована перспективность синтеза новых ГПК-препаратов с повышенной неспецифической противовирусной активностью в отношении пандемических штаммов вируса SARS-CoV-2.

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования в рамках государственного задания ФИЦ ХФ РАН по теме “Наноструктурированные системы нового поколения с уникальными функциональными свойствами” (регистрационный номер № 122040500071-0).