Российские нанотехнологии, 2023, T. 18, № 2, стр. 241-252

ВВЕДЕНИЕ

Разработка наноносителей рассматривается как один из перспективных подходов для повышения селективности и усиления терапевтического эффекта лекарств [1–3]. Исходя из этого, особую актуальность представляет вопрос о механизмах и возможностях регуляции поглощения наночастиц (НЧ) клетками.

Основным путем проникновения в клетку подавляющего большинства НЧ, так же как высокомолекулярных соединений, является эндоцитоз – способ поглощения различных веществ с помощью образования эндосом. Эндоцитоз является сложным процессом. Он реализуется с участием большого числа молекул, служащих субъединицами для образования необходимых структур и/или регуляторами процесса эндоцитоза. К таким молекулам относятся ГТФазы динамин и АДФ-рибозилирующий фактор 1 (Arf 1 – ADP-ribosylation factor 1).

У позвоночных известны три типа динамина: динамин 1, высокий уровень которого выявляется в нейронах, динамин 2, присутствующий во всех клетках, и динамин 3, выявляемый в яичках, легких и мозге [4, 5]. В то же время при значительном превышении мРНК динамина 1 в нейронах в остальных клетках и тканях уровни мРНК динаминов 1 и 2 существенно не различаются. Полагают, что динамин 1 неактивен в большинстве не нейрональных клеток и в покоящихся синапсах из-за фосфорилирования конститутивно активной киназой гликогенсинтазы 3β (GSK3β – glycogen synthase kinase 3β) [6].

Динамин задействован в нескольких типах эндоцитоза. Установлено, что он играет значительную роль в клатрин-опосредованном эндоцитозе [4, 7] и фагоцитозе [8, 9]. Вероятно, динамин участвует в кавеолин-опосредованном эндоцитозе [10, 11], хотя убедительных доказательств, что какое-либо вещество поглощается только кавеолин-опосредованным путем и что динамин необходим для кавеол-опосредованного эндоцитоза, до сих пор не представлено [12].

Наиболее изученная функция динамина в эндоцитозе связана с отщеплением от плазматической мембраны образовавшегося эндоцитозного пузырька. Это обусловлено олигомеризацией диамина в спиральный полимер, ключевым свойством которого является способность сжиматься в присутствии гуанозинтрифосфата (ГТФ) [4, 7]. Имеются экспериментальные данные, свидетельствующие об участии динамина и в более ранних этапах эндоцитоза, в частности регулировании формирования и созревания клатрин-покрытых ямок [5, 13–15].

Основным динамин-клатрин-независимым путем эндоцитоза считают CLIC/GEEC-эндоцитоз, осуществляемый с помощью гликофосфатидил-заякоренных белков. Этот тип поглощения не зависит от клатрина и кавеолина и связан с образованием эндосом, обогащенных гликофосфатидил-заякоренными белками (GEEC – GPI-anchored-protein-enriched endosomal compartment) или клатрин-независимыми носителями (CLIC – clathrin-independent carriers) [16–18]. Эндоцитируемое вещество быстро передается в аппарат Гольджи. В реализации процесса участвует малая ГТФаза Arf 1 [19–21].

Наряду с тем, что уже признана роль динамина и Arf 1 в эндоцитозе различных молекул, участие этих ГТФаз в эндоцитозе НЧ изучено гораздо хуже. Поэтому цель настоящей работы – исследование роли динамина и Arf 1 в поглощении флуоресцентных полупроводниковых НЧ, покрытых полимерной оболочкой, различными типами клеток.

Низкомолекулярные модуляторы динамина, такие как динасор или Ryngo 1-23, широко используются для изучения эндоцитоза и других аспектов мембранной динамики. Эти небольшие молекулы способны проникать сквозь клеточные мембраны, влиять на олигомеризацию, ГТФазную активность динамина и на процесс эндоцитоза [22–25].

Как указывали выше, негативным регулятором динамина является GSK3β, фосфорилирующая динамин 1 в покоящихся синапсах [15] и клетках, не являющихся нейронами [26]. Ингибирование GSK3β способствовало активации динамина и быстрому усилению интенсивности эндоцитоза в нейронах [27] и клетках немелкоклеточного рака легкого [28]. Для повышения активности динамина использовали ингибитор GSK3β – SML1046 (также известный как CHIR99021). Для выявления роли Arf 1 использовали брефельдин А – ингибитор активности Arf 1 и транспорта между эндоплазматической сетью и аппаратом Гольджи [29, 30].

МЕТОДЫ

Клетки. Использовали клетки Hela, глиомы С6, U-937, THP-1, KG-1 из “Белорусской коллекции культур клеток человека и животных” Республиканского научно-практического центра эпидемиологии и микробиологии, Беларусь, клетки асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) из Национального медицинского исследовательского центра онкологии им. Н.Н. Блохина, Россия. Культивируемые клетки выращивали в питательной среде DMEM (Sigma-Aldrich, Великобритания), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Thermo Fisher Scientific, Gibco, Бразилия) и антибиотиком (пенициллин, стрептомицин, амфотерицин) (Sigma-Aldrich, Германия), при 37°С в СО₂-инкубаторе (Shellab, США) с 5%-ным уровнем СО₂. Клетки АКЭ получали из перитонеальной полости мышей на 10-е сутки после внутрибрюшинной прививки опухоли.

Наночастицы. Полупроводниковые квантовые точки (QDs – quantum dots) CdSe/ZnS типа “ядро–оболочка” c максимумом испускания 584 нм (в CHCl₃) синтезировали согласно [31, 32]. Инкапсуляцию в производные амфифильного полимера поли(малеиновый ангидрид альт-1-тетрадецен) (ПМАТ) проводили согласно [33]. Квантовые точки в хлороформе обрабатывали октантиолом, после чего добавляли химически модифицированный ПМАТ. После испарения растворителя при комнатной температуре образовывалась твердая стеклообразная фаза, которую растворяли в воде или соответствующем буфере.

Модификацию ПМАТ проводили по стандартной карбодиимидной методике [34], в которой в реакцию сочетания вводили в присутствии 10-кратного избытка 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида 30 мг (0.1 ммоль) ПМАТ (M_w = 9000 г/моль) и низкомолекулярные модификаторы: 0.11 моль (2-аминоэтил)-триэтиламмония хлорида (QD3) или 0.11 ммоль (2-аминоэтил)-триэтиламмония хлорида и 0.09 ммоль таурина (QD4). Модифицированный полимер очищали посредством процедуры диализа против дистиллированной воды в течение 24 ч в ацетатцеллюлозной мембране.

Оптические свойства коллоидных растворов НЧ исследовали с помощью спектрометра (HR-2000+, Ocean Optics, Германия) и спектрофлуориметра (Agilent Cary Eclipse, США). Квантовый выход фотолюминесценции определяли относительно раствора красителя Rhodamine 6 G (Merk, Германия) в этаноле на длине волны возбуждения λ = 488 нм [35].

ζ-потенциал и гидродинамический диаметр инкапсулированных коллоидных НЧ измеряли с помощью прибора Malvern Zetasizer Nano ZS90 (Великобритания) в фосфатном буфере с рН = 7.0 и I = 10 мМ или в среде DMEM c феноловым красным с добавлением 10% ЭТС.

Проведение экспериментов. К клеткам, культивируемым в среде DMEM c 10% ЭТС, добавляли динасор (Sigma-Aldrich, Великобритания) в конечной концентрации (С) 80 мкМ или Ryngo 1-23 (Abcam, Великобритания), С = 5–80 мкМ; SML1046 (Sigma-Aldrich, Нидерланды), С = 3 мкМ; брефельдин А (Sigma-Aldrich, Германия), С = = 10 мкМ; окситетрациклина гидрохлорид (Биофармгарант, Россия), С = 500 мкМ. Клетки инкубировали с перечисленными выше препаратами 30 мин, вносили НЧ, С = 0.02 мкМ, инкубировали 1–24 ч при 37°С в СО₂-инкубаторе. Затем получали клеточные пробы и анализировали связывание НЧ с клетками методом проточной цитометрии с использованием цитофлуориметра “BD FACSCanto II” с программным обеспечением Diva 7.0 (Becton Dickinson, США). Интенсивность связывания (ИС) наночастиц с клетками оценивали по интенсивности флуоресценции (ИФ) клеток с учетом квантового выхода люминесценции (КВЛ) наночастиц, используя формулу

Определение жизнеспособности клеток. Пробы клеток, культивируемых с НЧ, окрашивали 7-аминоактиномицином (7-ААД) (Sigma-Aldrich, Германия) согласно рекомендациям производителя и анализировали методом проточной цитометрии.

Оптическая микроскопия. Использовали микроскоп ЛЮМ 1 LED (Альтами, Россия) со встроенными системами возбуждения, регистрации и цифровой обработки изображения. Для визуализации ядер клетки окрашивали красителем Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, Германия) в концентрации 10^–5 М (20°С, 10 мин). Затем готовили препараты типа “давленая капля”, позволяющие исследовать живые клетки [36]. Наносили 20 мкл клеточной суспензии на обезжиренное предметное стекло и накрывали покровным стеклом. Сразу анализировали препараты и делали снимки при увеличении объектива ×100.

Статистический анализ данных выполнен с использованием пакетов программ Excel и Statistica 7. Отличия считали статистически значимыми при p < < 0.05 согласно тесту Манна–Уитни. Данные представлены в виде средней и ее ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Среда DМЕМ изменяет ζ-потенциал и квантовый выход наночастиц. Исследование физико-химических свойств НЧ показало, что в фосфатном буфере они характеризуются слабым положительным ζ-потенциалом: +4.5 и +5.2 мВ для НЧ с карбоксильными и сульфонатными группами соответственно, табл. 1. В среде DМЕМ с 10% ЭТС наночастицы приобретали отрицательный поверхностный заряд за счет формирования “протеиновой короны”; средний ζ-потенциал белков ЭТС в среде DМЕМ (10% ЭТС) составлял –9.6 мВ. Из-за наличия красителя фенолового красного в среде инкубирования наблюдалось значительное тушение люминесценции НЧ, и квантовый выход фотолюминесценции снижался в 2.9–3.0 раза, табл. 1.

В присутствии Ryngo 1-23 квантовый выход НЧ снижался в 1.25 и 1.37 раза по отношению к квантовому выходу в среде DMEM и составлял 5.8 и 6.6% для QD3 и QD4 соответственно; другие препараты существенно не влияли на квантовый выход (данные не представлены). Исходя из этого, при оценке интенсивности связывания НЧ с клетками вносили соответствующие поправки в полученные на проточном цитофлуориметре значения интенсивности флуоресценции клеток (разд. Материалы и методы).

Агрегации НЧ в среде культивирования не наблюдали, что подтверждается данными о гидродинамическом диаметре НЧ в фосфатном буфере и среде DMEM. Используемые препараты также не вызывали агрегации НЧ.

Ryngo 1-23 усиливает поглощение НЧ нефагоцитирующими клетками. На клетках С6, Hela и U-937 исследовали влияние модуляторов активности динамина – динасора и Ryngo 1-23, ингибитора GSK-3 – SML1046, ингибитора Arf 1 – брефельдина А на клеточную жизнеспособность и эндоцитоз. Перечисленные выше препараты не влияли на жизнеспособность клеток в течение 24 ч культивирования (данные не показаны).

Как видно из рис. 1а, НЧ проявляли слабую цитотоксичность в отношении клеток глиомы С6. QD3 и QD4 снижали жизнеспособность клеток на 10 и 14% соответственно. Динасор несколько усиливал, а Ryngo 1-23 – снижал цитотоксичность QD3, остальные препараты не повлияли на эффект НЧ. Что касается QD4, то динасор не повлиял на их цитотоксические свойства, остальные использованные препараты ослабляли цитотоксичность этих НЧ на 8–14%.

Рис. 1.

Жизнеспособность клеток (а) и интенсивность связывания НЧ с клетками (б) глиомы С6 в присутствии динасора (Dyn, 80 мкМ), Ryngo 1-23 (Ryngo, 80 мкМ), SML1046 (SML, 3 мкМ) или брефельдина А (Br, 10 мкМ) при 24-часовом культивировании; *р < 0.05 при сравнении с серией “Без QD”, **р < 0.05 при сравнении с серией “QD3”, ***р < < 0.05 при сравнении с серией “QD4”.

Рисунок 1б отражает интенсивность поглощения НЧ клетками и изменения этого параметра, вызванные применением модуляторов эндоцитоза. Представлены показатели, характеризующие живые клетки, не окрасившиеся 7-ААД. При применении динасора наблюдалась слабая тенденция к снижению связывания НЧ с клетками. Брефельдин А снижал связывание QD3 и QD4 с клетками на 35 и 34% соответственно. SML1046 повышал связывание клеток с QD3 и QD4 на 17 и 26%, но при этом усиливал ингибирующее действие динасора – при совместном действии динасора и SML1046 снижение связывания QD3 и QD4 с клетками составило 15 и 26%. Наиболее значительное влияние на поглощение НЧ оказал Ryngo 1-23, повысивший связывание QD3 с клетками в 2.6 раза, QD4 – в 3.5 раза. Динамин не изменил эффект Ryngo 1-23 в отношении QD3 и несколько снизил в отношении QD4.

Закономерности поглощения, характерные для пула жизнеспособных клеток, наблюдались для всей совокупности клеток как в данном эксперименте, так и в других описанных ниже экспериментах. В ряде случаев выявленные изменения связывания клеток с НЧ были несколько более выражены в жизнеспособных клетках, поэтому здесь и далее представлены графики только для пула жизнеспособных клеток.

В экспериментах с клетками Hela наночастицы QD3 и QD4 снижали жизнеспособность клеток на 12 и 8% соответственно (рис. 2а). Ryngo 1-23 и его сочетание с динасором ослабляли цитотоксичность обоих типов НЧ на 7–12%. Остальные препараты существенно не изменили эффект НЧ на жизнеспособность клеток, исключая сочетание SML1046 с динасором, а также брефельдин А, которые усиливали цитотоксичность QD4 на 3–6%, рис. 2а.

Рис. 2.

Жизнеспособность клеток (а) и интенсивность связывания НЧ с клетками (б) Hela в присутствии динасора (Dyn, 80 мкМ), Ryngo 1-23 (Ryngo, 80 мкМ), SML1046 (SML, 3 мкМ) или брефельдина А (Br, 10 мкМ) при 24-часовом культивировании; *р < 0.05 при сравнении с серией “Без QD”, **р < 0.05 при сравнении с серией “QD3”, ***р < 0.05 при сравнении с серией “QD4”.

Исследование связывания НЧ с клетками Hela показало, что действие препаратов в данном случае проявлялось более выраженно, чем в клетках глиомы С6. Ryngo 1-23 повышал связывание QD3 и QD4 с клетками Hela в 7.9 и 5.2 раза соответственно, динасор усиливал этот эффект, в присутствии динасора и Ryngo 1-23 клетки связывались с наночастицами QD3 и QD4 в 12.4 и в 8.3 раза интенсивнее, чем в серии без добавления препаратов. Брефельдин А снижал связывание с QD3 и QD4 на 34 и 45% соответственно. Динасор усилил связывание с НЧ на 29 и 30%, SML1046 не повлиял на связывание НЧ с клетками Hela и не изменил эффект динасора, рис. 2б.

В опытах с клетками U-937 статистически значимого влияния QD3 и QD4 на жизнеспособность клеток не выявлено. При применении исследуемых препаратов вариации по жизнеспособности клеток в сериях составляли ~1–2%, рис. 3а.

Рис. 3.

Жизнеспособность клеток (а) и интенсивность связывания НЧ с клетками (б) U-937 в присутствии динасора (Dyn, 80 мкМ), Ryngo 1-23 (Ryngo, 80 мкМ), SML1046 (SML, 3 мкМ) или брефельдина А (Br, 10 мкМ) при 24-часовом культивировании; *р < 0.05 при сравнении с серией “Без QD”, **р < 0.05 при сравнении с серией “QD3”, ***р < 0.05 при сравнении с серией “QD4”.

Показано в 1.3 раза более интенсивное связывание QD3 с клетками по сравнению с QD4. Динасор снижал связывание обоих типов НЧ с клетками в 1.8 раза. SML 1046 не оказывал влияния на поглощение НЧ и не изменял эффект динасора (рис. 3б). Ryngo 1-23 снижал поглощение QD3 в 1.1 раза и не влиял на поглощение QD4, несколько ослабляя эффект динасора – сочетание Ryngo 1-23 с динасором подавляло связывание QD3 с клетками в 1.5 раза, QD4 – в 1.4 раза. Брефельдин А слабо влиял на маркировку клеток U-937 наночастицами.

Флуоресцентная микроскопия показала, что НЧ не образовывали агломератов снаружи клеток. При анализе образцов флуоресцентные гранулы были четко видны в разных оптических сечениях клетки при вращении микровинта. Не выявлено яркого свечения по границе клеток, которое могло бы наблюдаться при оседании НЧ на мембране. Все это свидетельствует в пользу того, что НЧ большей частью присутствовали в цитоплазме клеток и выявлялись в виде гранул (возможно, накапливаясь в эндосомах). Репрезентативные фото показаны на рис. 4, 5.

Рис. 4.

Клетки Hela, инкубированные 24 ч с QD3 без добавления (а) и с добавлением (б) Ryngo 1-23 (80 мкМ), флуоресцентная микроскопия (слева – флуоресценция, справа – белое поле).

Рис. 5.

Клетки Hela, инкубированные 24 ч с QD4 без добавления (а) и с добавлением (б) Ryngo 1-23 (80 мкМ), флуоресцентная микроскопия (слева – флуоресценция, справа – белое поле).

Согласно описанным выше результатам Ryngo 1-23 усиливает поглощение НЧ нефагоцитирующими клетками – глиомы С6 (происходящими из глии и имеющими морфологию фибробластов) и Hela (происходящими из эпителия и имеющими соответствующую морфологию), но не клетками U-937 (полученными из плеврального выпота больного гистиоцитарной лимфомой и имеющими морфологию моноцитов и способность к фагоцитозу).

Дополнительно исследовали влияние Ryngo 1-23 на поглощение QD3 или QD4 клетками АКЭ (карцинома молочной железы, мышь) с морфологией эпителиальных клеток, а также клетками KG-1 (острая миелогенная лейкемия, человек) или THP-1 (острая моноцитарная лейкемия, человек), представляющими собой клеточные типы макрофагов и моноцитов. Выявлено, что Ryngo 1-23 в 3 раза усиливает поглощение QD3 клетками АКЭ (рис. 6а, 7) и только на 16% – клетками KG-1 (рис. 6а). Сходные данные получены в экспериментах с QD4, где Ryngo 1-23 на треть усиливал поглощение НЧ клетками АКЭ, но не влиял на поглощение НЧ клетками KG-1, рис. 6б. Усиления поглощения QD4 клетками THP-1 в присутствии Ryngo 1-23 также не выявлено (данные не показаны). Это свидетельство в пользу того, что Ryngo 1-23 значительно усиливает поглощение НЧ нефагоцитирующими клетками, но не оказывает подобного эффекта на клетки моноцитарного ряда, которым присущ фагоцитоз.Рис.7

Рис. 6.

Влияние Ryngo 1-23 на поглощение QD3 (а) и QD4 (б) клетками KG-1 и асцитной карциномы Эрлиха (EAC) при 24-часовом культивировании; *р < 0.05 при сравнении с клетками без НЧ.

Рис. 7.

Клетки асцитной карциномы Эрлиха, инкубированные 24 ч с QD3 без добавления (а) и с добавлением (б) Ryngo 1-23 (80 мкМ), флуоресцентная микроскопия (слева – флуоресценция, справа – белое поле).

Эффект Ryngo 1-23 зависит от дозы – Ryngo 1-23 в дозе 80 мкМ повышает поглощение QD3 и QD4 клетками глиомы С6 в 3.1 и 3.4 раза соответственно. Снижение концентрации Ryngo 1-23 в 4 раза практически не повлияло на эффект препарата – Ryngo 1-23 повышал связывание с клетками QD3 и QD4 в 2.9 и 3.3 раза соответственно. При дозах 10 и 5 мкМ эффект Ryngo 1-23 снижался – связывание с QD3 повышалось в 2.2 и 1.5 раза, с QD4 – в 2.4 и 1.6 раза, рис. 8а.

Рис. 8.

Влияние Ryngo 1-23 (Ryngo) в различных дозах на связывание НЧ с клетками глиомы С6 (а) и Hela (б) при 24-часовом культивировании; *р < 0.05 при сравнении с серией “QD3”; **р < 0.05 при сравнении с серией “QD4”.

В экспериментах с клетками Hela Ryngo 1-23 в дозе 80 мкМ повышал поглощение QD3 и QD4 в 2.5 и 3.2 раза соответственно. При снижении дозы эффект снижался – при 20 мкМ наблюдалось повышение связывания в 1.8 и 2.2 раза, при дозах 10 и 5 мкМ Ryngo 1-23 связывание с QD3 повышалось в 1.3 и 1.1 раза, с QD4 – в 1.5 и 1.4 раза, рис. 8б.

Эффект Ryngo 1-23 на поглощение НЧ зависит от времени культивирования. Эксперимент на клетках глиомы С6 показал, что эффект Ryngo 1-23 развивается постепенно. Влияние Ryngo 1-23 на поглощение НЧ заметно уже через 1 ч, когда Ryngo 1-23 повышал накопление НЧ в клетках в 1.6 раза. Через 2–5 ч эффект усиливался, и наблюдалось усиление поглощения в 2.3–3.0 раза (рис. 9). Эффект сохранялся через 24 ч, превышение составляло 2.1 раза.

Рис. 9.

Влияние Ryngo 1-23 (Ryngo, 10 мкМ) на связывание НЧ с клетками глиомы С6 при различном времени культивирования; *р < 0.05 при сравнении с клетками, не обработанными Ryngo 1-23.

Окситетрациклин снижает поглощение НЧ и отменяет эффект Ryngo 1-23. На модели клеток глиомы С6 показано, что окситетрациклин снижает поглощение НЧ как в отсутствие, так и в присутствии Ryngo 1-23, рис. 10. Образования конгломератов НЧ при микроскопии не выявлено.

Рис. 10.

Влияние окситетрациклина гидрохлорида (ОТ, 500 мкМ) и Ryngo 1-23 (Ryngo, 10 мкМ) на связывание НЧ с клетками глиомы С6 при 24-часовом культивировании; *р < 0.05 при сравнении с серией “Контроль”; **р < 0.05 при сравнении с серией “QD4”.

ОБСУЖДЕНИЕ

В проведенных опытах исследовали флуоресцентные полупроводниковые НЧ (квантовые точки) QD3 и QD4, инкапсулированные амфифильным полимером. В оболочке наночастиц QD3 и QD4 присутствовали положительно заряженные четвертичные аммонийные группы и отрицательно заряженные группы (в QD3 – карбоксильные, в QD4 – сульфонатные). Соотношение положительных и отрицательных групп в полимерной оболочке обеспечивало ζ-потенциал НЧ в фосфатном буфере +4.5 (QD3) и +5.2 мВ (QD4). В среде DMEM с феноловым красным и 10% ЭТС QD3 и QD4 уже через 1 ч приобретали отрицательный ζ-потенциал, практически не изменяющийся в течение следующего часа и составляющий –9.4 и –9.3 мВ.

Оба типа НЧ связывались с различными типами клеток, причем QD3 (c карбоксильными группами) интенсивнее примерно в 1.2–1.3 раза, чем QD4 (c сульфонатными группами). Фотографии флуоресцентной микроскопии показывают, что НЧ не образуют агломератов снаружи клеток, они проникали внутрь и наблюдались в виде гранул. Для более точного представления о распределении НЧ на мембране и внутри клетки требуются дальнейшие исследования.

Полученные данные показали, что ингибитор динамина динасор сильно подавлял поглощение клетками U-937, в то же время слабо снижая или не влияя на связывание НЧ обоих типов с клетками глиомы С6 и Hela. Следовательно, в первом случае динамин необходим для поглощения НЧ, а во втором – играет незначительную роль в поглощении.

SML1046 (ингибитор GSK3β – негативного регулятора динамина 1) слабо повышал (глиома С6) или не влиял (Hela и U-937) на поглощение НЧ. Отсутствие усиления поглощения НЧ клетками U-937 при ингибировании GSK3β может свидетельствовать о том, что активность динамина 1 не играет роли в процессе поглощения или что его экспрессия в этих клетках слишком низка. Поскольку при ингибировании GSK3β несколько усиливалось поглощение НЧ клетками глиомы С6, вероятно, в этих клетках динамин 1 при его активации может вносить вклад в эндоцитоз.

Наибольший эффект на поглощение НЧ клетками глиомы С6 и Hela оказал препарат Ryngo 1-23. При исследовании кинетики процесса наблюдалось двухчасовое развитие действия Ryngo 1-23. Однако Ryngo 1-23 не оказывал такого влияния на поглощение НЧ клетками с фенотипом моноцитов и макрофагов: U-937, KG-1 и THP-1.

Таким образом, выявлено, что препараты динасор и Ryngo 1-23, структурно сходные (динасор напоминает мономерную форму Ryngo 1-23) [37], оказали различный эффект на поглощение НЧ. Оба препарата влияют на динамин, играющий существенную роль в процессах эндоцитоза. Динамин существует в трех основных состояниях: базальном, кольцевом и спиральном, ГТФaзная активность которых ступенчато возрастает при переходе в каждое последующее состояние. В своем “базальном” состоянии динамин находится в равновесии между мономерами, димерами и гомотетрамерами [38]. Димеры или тетрамеры динамина могут в дальнейшем самоорганизовываться в структуры более высокого порядка, напоминающие “кольца”, которые имеют внешний диаметр ~50 нм и внутреннее отверстие ~30 нм [39]. Образование кольца примерно в 10 раз стимулирует ГТФазную активность динамина [37]. Увеличение скорости гидролиза ГТФ происходит из-за активации внутримолекулярного домена активации ГТФaзы внутри динамина, который становится активным только тогда, когда тетрамеры динамина объединяются [40].

Для объяснения эффектов динасора и Ryngo 1-23 на эндоцитоз следует рассмотреть влияние их на самоорганизацию динамина и его ГТФазную активность.

Согласно ряду источников характерной чертой динасора является неконкурентное ингибирование гидролиза ГТФ без влияния на самосборку динамина. Динасор ингибирует ГТФазную активность динамина после его рекрутирования на плазматические мембраны [13, 22, 23, 41], что приводит к ингибированию отделения эндоцитических пузырьков от плазматической мембраны и незавершенному эндоцитозу [23].

Показано, что Ryngo 1-23 (также называемый Bis-T-23) является мощным ингибитором стимулированной фосфолипидами ГТФазной активности динамина 1 [42]. В дальнейшем при исследовании свойств Ryngo 1-23 было обнаружено, что он усиливает ГТФазную активность, олигомеризацию динамина, образование колец, частичных колец [24], блокирует динаминовые петли до негибкого и однородного диаметра, замедляет разборку динаминового кольца или спирали [37]. Полагают, что ингибирующий эффект Ryngo 1-23 на динамин может объясняться конкуренцией между образованием динаминовых колец при его воздействии (что приводит к ~5-кратному увеличению ГТФазной активности) и формированием динаминовых спиралей при фосфолипидной стимуляции (что приводит к ~50-кратному увеличению ГТФазной активности). Следовательно, в последнем случае преобладающее образование динаминовых колец уменьшало бы общую наблюдаемую активацию динамина [17]. На астроцитах крысы продемонстрировано, что Ryngo 1-23 является активатором эндоцитоза и способствует интернализации везикул [25].

Таким образом, динасор и Ryngo 1-23 оказывают различное влияние на функции динамина в клетках. Динасор в клетках ингибирует ГТФазную активность динамина и эндоцитоз, а Ryngo 1-23 стабилизирует кольцевые структуры динамина, активирует ГТФазную активность и усиливает эндоцитоз.

Исходя из изложенного выше, в усилении поглощения НЧ при действии Ryngo 1-23, вероятно, основную роль играла способность этого агента стабилизировать кольцевые структуры динамина. Так как динасор, ингибирующий ГТФазную активность динамина, не отменял, а в опытах на клетках Hela даже усиливал накопление НЧ в клетках, можно предполагать, что ГТФазная активность динамина не играет тут решающей роли.

На модели клеток Cos-1 (фибробласты почки обезьяны) [24] и подоцитов [24, 43] показана стимуляция актин-зависимой олигомеризации динамина с помощью Ryngo 1-23. Окситетрациклин, разрушающий филаменты актина и стабилизирующий их мономерную форму [44], в проведенных экспериментах способствовал снижению поглощения НЧ клетками как обработанными, так и не обработанными Ryngo 1-23. По-видимому, действие Ryngo 1-23 на клеточное поглощение НЧ связано с полимеризацией актина и актин-зависимой олигомеризацией динамина, описанной в [24, 43]. Вместе с тем окситетрациклин и Ryngo 1-23 не являются высокоспецифичными соединениями, взаимодействующими только с одной молекулярной мишенью, поэтому нельзя исключить, что они оказывают противоположные эффекты на клеточное поглощение через различные пути.

Из представленных данных следует, что механизмы поглощения НЧ являются различными в разных типах клеток. Для нефагоцитирующих клеток глиомы С6, Hela, АКЭ эти механизмы зависят от сборки динамина в кольцевые структуры, что активируется Ryngo 1-23, а динасор, ингибирующий ГТФазную активность, но не сборку динамина, практически не влияет на поглощение. В способных к фагоцитозу клетках моноцитарно-макрофагального происхождения (U-937, KG-1, THP-1) в процессах эндоцитоза играет роль активность динамина как ГТФазы.

Отметим, что динасор оказывает и динамин-независимые эффекты, которые могут быть важны для эндоцитоза в клетках моноцитарного ряда. Так, на клетках с тройным нокаутом динамина была показана способность динасора к ингибированию эндоцитоза и изменению формы клеток вследствие влияния на актин [45, 46]. В клетках Hela и макрофагах динасор динамин-независимым образом снижал лабильный пул холестерина плазматической мембраны и разрыхлял липидные рафты [47].

Снижение накопления НЧ в клетках под действием брефельдина А указывает на то, что в эндоцитозе НЧ участвует Arf 1. Наиболее выраженный ингибирующий эффект брефельдина А выявлен на клетках глиомы С6 и Hela. Arf 1 контролирует формирование как клатринового, так и неклатринового покрытия [1, 48] и участвует в осуществлении клатрин-динамин-независимого CLIC/GEEC-эндоцитоза. Известно, что клатрин-зависимый эндоцитоз происходит с участием динамина [4, 7]. В проведенных опытах с клетками глиомы С6 и Hela при ингибировании динамина значительного подавления эндоцитоза не наблюдали. По-видимому, в поглощении НЧ в данном случае играет роль не клатриновый путь, а динамин-клатрин-независимый CLIC/GEEC-эндоцитоз.

Химические модуляторы процессов поглощения могут использоваться для усиления селективности взаимодействия НЧ с определенными типами клеток. Так, Ryngo 1-23 способствует поглощению НЧ нефагоцитирующими клетками, слабо влияя на их поглощение фагоцитами, а динасор препятствует поглощению НЧ клетками фагоцитарного типа, практически не влияя на нефагоцитирующие клетки. Так как одной из проблем при создании высокоспецифичных наноформ лекарств является неспецифической захват НЧ фагоцитами [49–51], представленные в работе результаты не только вносят вклад в понимание механизмов эндоцитоза, но и могут иметь практическое значение.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показано, что в поглощении клетками НЧ, инкапсулированных амфифильным полимером, участвуют динамин-зависимые и Arf 1-зависимые механизмы. Эффект препаратов, влияющих на активность участвующих в эндоцитозе молекул, зависит от типа клеток. Ryngo 1-23, стабилизирующий кольцевые структуры динамина и активирующий его ГТФазную активность, значительно усиливает накопление НЧ в нефагоцитирующих клетках, таких как С6, Hela, АКЭ, но не в клетках моноцитарно-макрофагального фенотипа. Ингибитор динамина – динасор – подавляет поглощение НЧ фагоцитирующими клетками U-937. Таким образом, регуляторы активности динамина могут обеспечивать селективное усиление поглощения НЧ нефагоцитирующими клетками. Ингибитор Arf 1 – брефельдин А – снижает поглощение НЧ клетками глиомы С6 и Hela.

Результаты свидетельствуют о том, что химические модуляторы процессов эндоцитоза могут использоваться для регуляции интенсивности поглощения НЧ и усиления селективности их взаимодействия с определенными типами клеток.

Работа выполнена при поддержке ГПНИ “Химические процессы, реагенты и технологии, биорегуляторы и биооргхимия”, задание 2.1.04 НИР 1.