Российские нанотехнологии, 2023, T. 18, № 6, стр. 810-816

ВВЕДЕНИЕ

Исследование возможности проникновения наночастиц (НЧ) через гистогематические барьеры иммунопривилегированных органов привлекает внимание исследователей, поскольку, с одной стороны, необходимо знание о возможных токсических эффектах НЧ в органах, имеющих особые охранные барьеры, а с другой стороны, гистогематические барьеры забарьерных органов являются препятствием для проникновения лекарственных препаратов, что затрудняет терапевтическое воздействие.

Головной мозг, глазные яблоки, тимус и семенники относятся к иммунопривилегированным или забарьерным органам, которые при отсутствии повреждения защищены гистогематическими барьерами от проникновения иммунных комплексов, аутоиммунной агрессии и воспаления [1]. Особенности структуры гистогематических барьеров определяются строением органов и различаются своими специфическими чертами в зависимости от их морфологических и физиологических характеристик [2].

Наиболее изученным является гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). К его структурным элементам относятся эндотелий кровеносных капилляров, базальная мембрана, мембраны нейронов и глиальных клеток, протеогликаны межклеточного вещества, сосудистые сплетения, оболочки мозга [1, 2]. Гематоофтальмический барьер рассматривают как совокупность трех гистогематических систем: иридоцилиарной, хориоретинальной и папиллярной [3]. Гематотимусный барьер в корковом веществе представлен эндотелиальными клетками кровеносных капилляров и их базальными мембранами, периваскулярным пространством с единичными лимфоцитами, макрофагами, фибробластами, а также межклеточным веществом с ретикулярными эпителиоцитами, также опирающимися на базальную мембрану [4]. Гематотестикулярный барьер включает в себя эндотелий и базальные мембраны капилляров, оплетающих извитые семенные канальцы; находящиеся в расслоении базальной мембраны перициты; прослойки рыхлой интерстициальной соединительной ткани с макрофагами; оболочки извитого семенного канальца, базальную мембрану эпителиоспермального слоя, плотные контакты между клетками Сертоли [1].

Проницаемость гистогематических барьеров избирательна, имеет видовую и возрастную специфику и зависит от потребностей и состояния организма. Так, барьеры могут становиться проницаемыми при некоторых патологических процессах, например при стрессе, воспалительных процессах [1], при железодефицитной анемии [5], старении [6]. Таким образом, изоляция всех рассмотренных забарьерных органов относительна, так как может быть нарушена при действии внешних и внутренних факторов.

Несмотря на возможные токсические эффекты НЧ, широко проводятся исследования преодоления гистогематических барьеров и доставки лекарственных препаратов в забарьерные органы посредством наноконтейнеров: доставка НЧ в головной мозг для лечения паркинсонизма [7], болезни Альцгеймера [8], туберкулеза [9], глиобластомы [10].

К НЧ, которые были использованы в экспериментах в качестве транспортных средств для направленной доставки биоактивных молекул в забарьерные органы, относятся неорганические и органические полимерные НЧ [7], липосомы [8], дендримеры, мицеллы, пептидные векторы, квантовые точки, различающиеся составом, строением и размерами [11, 12].

Фосфолипидные НЧ с флуоресцентным красителем были эффективны для визуализации опухоли мозга [13]. Показана возможность преодоления гематоофтальмического барьера НЧ, содержащими полиакриловую кислоту, альбумин, поли-ε-капролактон и хитозан, для доставки лекарственных препаратов [14].

Системы доставки лекарственных препаратов, преодолевающие гистогематические барьеры забарьерных органов, должны быть нетоксичны, биоразлагаемы и биосовместимы. В качестве транспортных средств доставки лекарственных препаратов в иммунопривилегированные органы могут быть использованы нанокластерные пористые сферические полиоксометаллаты (ПОМ) кеплератного типа.

Понятие кластера было впервые введено Ф. Коттоном в 60-х гг. прошлого века. Кластерами первоначально именовали металлические частицы, с ограниченным числом атомов металлов, связанных друг с другом ковалентной связью, с возможным присутствием лигандов [15]. Позднее к нанокластерам стали относить и другие объекты, такие как ПОМ соответствующего размера. Нанокластерные ПОМ – соединения переходных металлов (обычно W, Mo, V, Nb), кислорода и стабилизирующих лигандов, размер молекул (ионов) которых составляет несколько нанометров.

Интерес к биохимическим свойствам ПОМ [16–18] связан с образованием ими в водных растворах многозарядных анионов, которые могут транспортироваться электрофоретически [19, 20] в том числе чрескожно. При этом ионы ПОМ способны образовывать ассоциаты (конъюгаты) с биологически активными веществами, также транспортируемые под действием электрического поля [19, 21]. Важным моментом является низкая токсичность [16, 18] ПОМ кеплератного типа ({Mo₇₂Fe₃₀}), кристаллографический радиус которого составляет 2.5 нм, а полная формула выглядит следующим образом: [Mo₇₂Fe₃₀O₂₅₂ (CH₃COO)₁₂ {Mo₂O₇(H₂O)}₂ {H₂Mo₂O₈ (H₂O)} (H₂O)₉₁] ~150H₂O.

Показано, что организм животных способен адаптироваться к воздействию ПОМ в течение 30 сут их воздействия, что также способствует снижению их токсичности.

В более ранних исследованиях было установлено, что при разных способах введения ПОМ в организм увеличивается содержание их неорганических компонентов, в частности молибдена, в крови, однако существенного аккумулирования в течение длительного времени не происходит [16, 18], например, в костях и таких органах, как печень, почки, через которые выводится его избыток. Тем не менее неорганические компоненты ПОМ (молибден, железо) способны избирательно накапливаться в культурах живых клеток [22], где поглощение железа и молибдена зависит от типа клеток и состава ПОМ: {Mo₇₂Fe₃₀} и {Mo₁₃₂} – (NH₄)₄₂[${\text{Mo}}_{{72}}^{{{\text{VI}}}}$ ${\text{Mo}}_{{60}}^{{\text{V}}}$ O₃₇₂(CH₃COO)₃₀(H₂O)₇₂]⋅ 300H₂O⋅10CH₃COONH₄. Имеются основания полагать о возможности стабилизации ПОМ в средах организма, например в кровеносной системе, за счет ассоциации {Mo₇₂Fe₃₀} с белковыми молекулами [21].

Учитывая сказанное выше, представляет интерес изучение уровня содержания неорганических компонентов ПОМ {Mo₇₂Fe₃₀} и в органах, обладающих особыми гистогематическими барьерами. Повышение в них одновременно количества молибдена и железа могло бы косвенно свидетельствовать о проникновении в эти органы ПОМ. Целесообразно включение в круг изучаемых объектов органов с разной возможной степенью васкуляризации. Таким образом, в число изученных в настоящей работе органов исследуемых животных (крыс) входят глазные яблоки, семенники, тимус и головной мозг, масса которых позволяет достоверно провести анализ содержания неорганических компонентов ПОМ.

Патологический процесс может изменить проницаемость гистогематических барьеров. Так, установлены снижение содержания железа в головном мозге и увеличение этого элемента в глазных яблоках животных при экспериментальной железодефицитной анемии [5]. Коррекция дефицита железа в крови введением изомальтозата железа сопровождалась восстановлением уровня железа в головном мозге мышей [23]. Однако при интраназальном введении липосом с ионами железа обнаружено накопление железа в головном мозге и глазных яблоках крыс [24]. Как дефицит, так и избыточное накопление железа в головном мозге могут провоцировать нарушение когнитивных функций [5, 6, 25]. Если проницаемости ГЭБ посвящено достаточно много работ, то проницаемость гистогематических барьеров глазных яблок, семенников и тимуса исследована недостаточно.

Цель исследования – выявить возможность проникновения железо-молибденовых ПОМ в головной мозг, семенники, тимус, глазные яблоки крыс в норме и после моделирования постгеморрагической анемии.

МЕТОДЫ

Полиоксометаллат {Mo₇₂Fe₃₀} впервые был синтезирован в Германии в лаборатории профессора А. Мюллера (университет Билефельда). Структура и состав ПОМ были подробно изучены комплексом методов, включая монокристальную рентгенографию (позволившую представить 3D-модель молекулы ПОМ), динамическое рассеяние света, элементный анализ, ИК-спектроскопию, спектроскопию комбинационного рассеяния света (КРС) и другие. Было показано, что более экспрессные по сравнению с криогенной монокристальной рентгенографией методы идентификации нанокластерных ПОМ (такие как ИК-спектроскопия и КРС) являются достаточно надежными, так как ПОМ обладают уникальными спектрами.

Согласно методике [26, 27] в настоящей работе провели синтез ПОМ. Первоначально из водных растворов выделили твердый ПОМ {Mo₁₃₂} [26]. Из него путем замещения ионов Mo(V) на Fe(III) получили также твердый конечный продукт {Mo₇₂Fe₃₀} [27]. Для введения животным ПОМ растворяли в дистиллированной воде. При синтезе использовали гептамолибдат аммония (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O квалификации “х.ч.”, гидразин сернокислый N₂H₄∙H₂SO₄ квалификации “ч.д.а.”, уксусную кислоту ледяную CH₃COOH “х.ч.”, хлорид железа(III) шестиводный FeCl₃⋅6H₂O Panreac (содержание основного вещества 97–102%), ацетат аммония CH₃COONH₄ квалификации “х.ч.”, соляную кислоту НСl квалификации “ос.ч.” и хлорид натрия NaCl квалификации “ч.д.а.”.

Подтверждение идентичности полученного соединения описанному в литературе было проведено комплексом методов. Регистрацию ИК-спектров порошкового образца ПОМ проводили в режиме нарушенного полного внутреннего отражения на ИК-фурье-спектрометре Nicolet 6700 (Thermo Fisher Scientific, США). Спектры КРС порошкового образца ПОМ были получены (633 нм) с помощью микроскопа Alpha 300 AR (WiTec, Германия), оснащенного He–Ne-лазером. Элементный анализ на легкие элементы проводили на автоматическом элементном анализаторе CHNS РЕ 2400, серия II (Perkin Elmer Instruments, США). Элементный анализ содержания молибдена и железа проводили на атомно-эмиссионном спектрометре с индуктивно-связанной плазмой iCAP-6500 Duo (Thermo Scientific, США), предварительно ПОМ был растворен в дистиллированной воде (концентрация раствора 0.1 г/л). Анализ размера частиц в свежеприготовленном растворе {Mo₇₂Fe₃₀} в дистиллированной воде осуществляли методом динамического рассеяния света (ДРС) на анализаторе ZetaPlus/BI 90 (Brookhaven Instruments, США) (концентрация раствора 1 мг/мл).

Инъекционные водные растворы содержали 1 мг/мл {Mo₇₂Fe₃₀}.

Эксперимент выполнен на 50 крысах-самцах линии Wistar. Содержание животных и все манипуляции соответствовали Директиве Совета ЕС 2010/63/EU. Крысы были разделены на следующие группы: 1 – интактная, 2 – введение ПОМ, 3 – постгеморрагическая анемия (ПГА), 4 – ПГА и введение ПОМ. Группы 2, 3 и 4 были разделены на подгруппы по 5 крыс, находившиеся в эксперименте 1, 7 и 30 сут. В группах 3 и 4 под эфирным наркозом осуществляли кровопотерю, забирая кровь из хвостовой вены в количестве 1.5% от массы тела (м.т.). Крысы групп 2 и 4 получали соответственно 1, 7 и 30 внутримышечных инъекций ПОМ. Однократная доза раствора ПОМ в дистиллированной воде (1 мг/мл) составляла 0.15 мг/100 г м.т. крысы и соответствовала предполагаемой терапевтической дозе НЧ. Количество железа в ПОМ составляет 9%, т.е. 0.0135 мг/100 г м.т. крысы в однократной инъекции. Крысы группы 3 получали 1, 7 и 30 внутримышечных инъекций дистиллированной воды объемом, соответствующим объему раствора ПОМ. Животных выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира.

Образцы органов, предварительно взвешенные на аналитических весах ACCULAB (Sartorius group), помещали в термостойкий химический стакан объемом 50 мл. Растворение органов проводили с использованием смеси концентрированных серной и азотной кислот с нагреванием на кварцевой электроплитке EVS. Первоначально к каждому образцу добавляли по 2 мл азотной концентрированной кислоты квалификации ос.ч. и нагревали, установив на регуляторе плитки температуру 100°С. В ходе растворения на стенках стакана образовывался налет жира, после этого добавляли 2 мл серной концентрированной кислоты ос.ч. и продолжали нагревать при 250°С с сопутствующим выделением бурого газа (диоксид азота) до обугливания пробы в жидкой среде и возникновения в стакане черной окраски среды. Далее добавляли по 0.5 мл перекиси водорода медицинского назначения (36–38%), не содержащей соединений железа и молибдена, до получения прозрачного раствора, который количественно переносили в мерную колбу на 10 или 25 мл и доводили в ней до метки водой, приливая ее маленькими порциями.

Анализ содержания молибдена и железа проводили на атомно-эмиссионном спектрометре с индуктивно-связанной плазмой iCAP-6500 Duo (Thermo Scientific).

Статистический анализ данных проводили с помощью программ Statistica 6.0 (Stаt. Soft.Inc.) и Microsoft Exel 2003. Данные представлены в виде среднего ± ошибка среднего. Оценку статистической значимости различий данных, полученных в сравниваемых выборках, осуществляли с использованием непараметрического критерия (U) Манна–Уитни и Краскела–Уоллиса. При проверке статистических гипотез использовали уровень значимости 5% (Р < 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Синтезированный по методике [27] ПОМ анализировали комплексом методов. В ИК-спектре наблюдали следующие колебания: 1616, 1532, 1406, 970, 859, 780, 625, 670, 570, 439 см^–1; в спектре КРС: 952, 909, 842, 717, 586, 518, 452, 370, 240 см^–1. Совокупность спектров ИК и КРС позволяет получить наиболее полный и уникальный для химического соединения набор колебаний. Полученный для ПОМ набор колебаний соответствует приведенным в [27] данным, подробное описание и расшифровка спектров ИК и КРС представлены в [28, 29]. Результаты элементного анализа соответствуют расчетным значениям: С 1.5 ± 0.2% (1.5); H 2.4 ± 0.5% (2.8), Mo 39.8 ± 0.4% (40.1), Fe 8.6 ± ± 0.5% (8.9), в скобках указаны расчетные данные исходя из формулы соединения. Анализ свежеприготовленного раствора {Mo₇₂Fe₃₀} в дистиллированной воде (концентрация 1 мг/мл, равная вводимой животным) методом ДРС показал узкое распределение частиц по размерам, среднее значение составило 2.7 нм (рис. 1), что согласуется с размерами гидратированных ионов ПОМ (данные [27] по монокристальной рентгенографии 2.5 нм). Соответствие результатов анализа эталонным данным подтвердило получение нанокластерного ПОМ {Mo₇₂Fe₃₀}.

Рис. 1.

Объемное распределение частиц ПОМ по размерам в водном растворе (концентрация 1 мг/мл) по данным исследования методом ДРС. Средний диаметр частиц – 2.7 нм.

Введение ПОМ здоровым животным сопровождалось увеличением содержания железа в тимусе почти в 1.5 раза уже после однократной инъекции и в 2.3 раза после 30 инъекций (табл. 1). Данные о накоплении железа в тимусе после инъекций ПОМ согласуются с данными [17], где было показано увеличение количества тимоцитов, экспрессирующих белки теплового шока, что, возможно, было вызвано изменением гомеостаза в тимусе вследствие проникновения ПОМ.

В головном мозге и глазных яблоках здоровых крыс накопление железа происходило только после 30 инъекций ПОМ, а в семенниках содержание железа не отличалось достоверно от уровня показателя интактных крыс после однократной инъекции и многократных инъекций ПОМ (табл. 1). Различие в поступлении железа из ПОМ в иммунопривилегированные органы может быть связано с разной скоростью кровотока и с разными механизмами прямого и обратного транспорта железа, которые недостаточно исследованы [30, 31].

Дефицит железа в крови крыс был получен путем моделирования ПГА и подтвержден гематологическими анализами и определением содержания железа в крови [32]. После моделирования ПГА уровень железа снижался в тимусе, головном мозге и глазных яблоках через сутки и оставался ниже нормы в глазных яблоках через 7 сут (табл. 1). В то же время ПГА не оказывала влияния на уровень железа в семенниках. К 30-м суткам после моделирования анемии количество железа во всех исследованных органах нормализовалось, что согласуется с ранее полученными данными о самопроизвольной коррекции количества эритроцитов, содержании гемоглобина и железа в крови через 30 сут после моделирования ПГА [32].

Однократное введение ПОМ после моделирования ПГА предотвращало потерю железа на первые сутки в головном мозге, тимусе и глазных яблоках, а 7- и 30-кратное введение ПОМ вызывало избыточное накопление железа в головном мозге через 7 и 30 сут и в глазных яблоках через 30 сут эксперимента (табл. 1). В тимусе инъекции ПОМ на фоне анемии не сопровождались увеличением уровня железа, вероятно, вследствие более эффективного выведения этого элемента. В семенниках уровень железа достоверно не отличался от нормы как при кровопотере, так и при введении ПОМ после кровопотери (табл. 1). Вероятно, гематотестикулярный барьер позволяет поддерживать уровень железа как при дефиците, так и при избытке этого элемента в организме.

В отличие от содержания железа уровень молибдена достоверно увеличивался только в головном мозге здоровых крыс и только после 30 инъекций ПОМ (табл. 2).

Обнаружено снижение уровня молибдена в глазных яблоках крыс на 1-е и 7-е сутки после моделирования ПГА. Вероятно, ПГА может сопровождаться потерей не только железа, но и других микроэлементов, недостаток которых может быть восполнен заимствованием из забарьерных органов. При коррекции ПГА введением ПОМ содержание молибдена превышало норму к 30-м суткам только в глазных яблоках (табл. 2).

Различия в изменении содержания железа и молибдена при однократном и многократном введении ПОМ, при кровопотере, а также кровопотере и введении ПОМ, вероятно, связаны с проникновением в органы не только целых НЧ, но и продуктов их деструкции, а также с различными механизмами прямого и обратного транспорта для железа и молибдена. В головной мозг железо поступает преимущественно при взаимодействии трансферрина с трансферриновыми рецепторами на эндотелии сосудов ГЭБ, а покидает мозг с ликвором, поэтому скорость поступления и выведения железа может быть различной [30]. Известно, что проникновение железа в головной мозг возможно при повышенной концентрации железа в крови [23, 24]. Вероятно, 30-кратная процедура нагрузки железом превышает барьерные возможности ГЭБ у здоровых крыс. В то же время однократное и семикратное введение ПОМ крысам с ПГА способствует коррекции дефицита железа. Возможно, коррекция дефицита железа у крыс на 1-е сутки после кровопотери происходит за счет большей проникающей способности железа в составе ПОМ по сравнению с ионами железа.

Изменения содержания железа в тимусе возможны при достаточно свободном переходе через гематотимусный барьер. Согласно данным о содержании железа в тимусе крыс при ПГА и введении ПОМ также можно заключить, что нет необходимости в 30-кратном введении ПОМ.

Устойчивость гематотестикулярного барьера к проникновению ПОМ и отдельных компонентов ПОМ, а также к потере железа при ПГА может быть связана с обеспечением постоянных условий, необходимых для сперматогенеза. Избыточное количество ионов с переменной валентностью, таких как железо и молибден, в семенниках может способствовать усилению свободнорадикального окисления, а развитие оксидативного стресса опасно усилением спонтанных мутаций. Дефицит железа также нежелателен, поскольку железо в качестве кофактора входит в состав каталазы, пероксидазы, цитохромов, участвующих в реакциях антиоксидантной защиты и энергетического обмена.

При терапевтическом применении ПОМ для коррекции кровопотери необходим контроль содержания железа и эритроцитарных показателей крови, чтобы не вызвать избыточного накопления железа в забарьерных органах.

Отметим, что имеются дополнительно моменты в виде предварительных результатов, указывающих на то, что в некоторых случаях гистогематические барьеры являются более проницаемыми для ионов ПОМ по сравнению с железом в более простых формах. Так, содержание железа в глазных яблоках было ниже при введении животным с ПГА вместо раствора ПОМ продуктов его деструкции, полученных после подщелачивания раствора, {Mo₇₂Fe₃₀} через 1, 7 и 30 сут: 19.5 ± 3.9, 17.4 ± 4.7, 35.0 ± 3.1 соответственно. Данный аспект представляет интерес для дальнейших исследований с целью установления возможных преимуществ адресной доставки лекарственных препаратов, конъюгированных с ПОМ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наиболее устойчивым к проникновению компонентов железо-молибденовых ПОМ является гематотестикулярный барьер, меньшей степенью устойчивости обладают гематоэнцефалический и гематоофтальмический барьеры (накопление железа после 30 введений ПОМ), наименее устойчив гематотимусный барьер.

В ранние сроки (1-е–7-е сутки) ПГА происходит заимствование железа из иммунопривилегированных органов: головного мозга, глазных яблок, тимуса.

Устойчивость ГЭБ снижается при моделировании постгеморрагической анемии после семи инъекций ПОМ.

Различие в проникновении железа и молибдена в забарьерные органы здоровых и анемичных животных позволяет сделать предположение, что значительная часть ПОМ распадается на отдельные компоненты до поступления в органы.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке в рамках Государственного задания Министерства науки и высшего образования РФ (проект № 123031300049-8).