Российские нанотехнологии, 2024, T. 19, № 3, стр. 396-404

ВВЕДЕНИЕ

Глиобластомы – это наиболее частые и агрессивные первичные опухоли головного мозга IV (наивысшей) степени, плохо поддающиеся лечению [1, 2]. По классификации WHO (World Health Organization) 2021 г. они относятся к взрослому типу диффузных глиом с не мутировавшими генами IDH [3]. Глиобластомы не имеют четких границ и глубоко проникают в соседние ткани. Полностью удалить их хирургическим путем практически невозможно, поэтому для лечения используют комплексные подходы, совмещающие в себе хирургию, радиотерапию и химиотерапию алкилирующими агентами [4]. Однако, несмотря на агрессивное лечение, рецидивы опухоли возникают в 80% случаев, более того, часто развивается устойчивость к терапии, что делает эти опухоли де-факто неизлечимыми [5].

Глиобластомы обладают высокой степенью гетерогенности. Они могут значительно различаться у разных пациентов, более того, сами составляющие опухоль клеточные популяции не однородны и могут иметь значительные различия по морфологии, фенотипу и генетическим особенностям [6]. Получение клеточных линий из опухолевых биоптатов позволяет детально изучать фенотипические, биохимические и генетические особенности различных глиобластом, выявлять молекулярные маркеры, на основе которых в дальнейшем можно будет подбирать более конкретные, возможно даже индивидуальные схемы терапии опухолей головного мозга.

Одним из наиболее важных молекулярных маркеров для глиом, позволяющих определить прогноз заболевания и выбрать стратегию лечения, является статус изоцитратдегидрогеназ IDH1 и IDH2 [7, 8]. Изоцитратдегидрогеназа – это фермент, катализирующий реакцию превращения изолимонной кислоты в α-кетоглутаровую внутри цикла трикарбоновых кислот. IDH вовлечена во многие метаболические процессы, например передачу сигналов, синтез липидов, окислительный стресс и окислительное дыхание. Мутации в генах IDH1 и IDH2 найдены в 70–80% диффузионных астроцитом II–III степени злокачественности, олигодендроглиомах и вторичных глиобластомах, но почти не встречаются в первичных глиобластомах [9].

Еще одним маркером, определяющим характер развития глиом и их ответ на терапию, является статус транскрипционного фактора p53 [8]. Белок р53 – это основной “страж генома”, который активируется в ответ на гипоксию, оксидативный стресс, гипо- и гипертермию, повреждения ДНК (в том числе возникающие в ходе радиотерапии), уменьшение пула нуклеотидов, активацию онкогенов и вызывает апоптоз, остановку клеточного цикла, подавление неоангиогенеза. Наибольшее количество мутаций, приводящих к дисфункциям белка р53, находится в “цинковом пальце” – ДНК-связывающем домене, кодируемом экзонами с четвертого по восьмой. Большинство мутаций сосредоточено между аминокислотами 125–300, основная часть которых приводит к замене одной аминокислоты на другую, что в свою очередь вызывает изменение в структуре белка и ограничивает его функциональность [10, 11]. Как онкосупрессор р53 хорошо изучен и в глиомах [9]. Показано, что в глиобластомах мутации TP53 наблюдаются значительно реже, чем в глиомах IV степени других типов [12]. Однако в 78% случаев глиобластом присутствуют нарушения если не в самом белке р53, то в путях его регуляции [13].

Белок р73 является гомологом р53 и регулирует экспрессию ряда общих с ним генов-мишеней, однако мутации в гене р73 встречаются редко (1% случаев) [14]. Во многих опухолях наблюдается даже суперэкспрессия белка р73 [15]. С гена р73 могут экспрессироваться как полноразмерные (онкосупрессорные), так и укороченные (онкогенные) изоформы [16]. Показано, что укороченные изоформы могут подавлять транскрипционную активность как ТАp73 с полным транс-активирующим доменом, так и p53, образуя с ними гетеротетрамеры и конкурируя за сайты связывания с ДНК. Таким образом, судьба клетки зависит от соотношения количеств этих изоформ. [17]. Белок р73 может играть важную роль в дифференциации глиобластом [18]. Показано, что существует корреляция между уровнями РНК изоформы TAp73 и ΔNp73, злокачественностью опухоли и выживаемостью пациентов [19]. Таким образом, p73 можно рассматривать как потенциальный биомаркер степени злокачественности глиобластомы.

Современным подходом к лечению глиобластом является иммунотерапия, направленная на блокирование синтетическими антителами факторов роста и их рецепторов. Глиомы являются одними из наиболее васкуляризированных и отечных опухолей, поскольку они экспрессируют высокие уровни факторов роста эндотелия сосудов (VEGF) [20]. Анти-ангиогенная терапия давно применяется при лечении глиом. Так, бевацизумаб (торговое наименование Авастин), гуманизированное моноклональное антитело против VEGF, продемонстрировал терапевтический эффект у многих пациентов с глиобластомами при использовании отдельно или в сочетании с другими видами терапии [21]. Рецептор-1 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR-1) представляет собой тирозинкиназный рецептор, который связывается с лигандами семейства VEGF [22]. Помимо экспрессии в опухолевом эндотелии, VEGFR-1 обнаруживается на поверхности самих опухолевых клеток и клетках опухолевого микроокружения. Блокирование VEGFR-1 приводит к подавлению пролиферации и усилению апоптоза опухолевых клеток, уменьшению васкуляризации опухолевого узла, подавлению инвазии и метастазирования опухоли [23]. При этом в неопухолевых клетках VEGFR-1 задействован в ангиогенезе опосредованно и его блокирование антителами не токсично для организма больного [24].

В данном исследовании провели генетическую характеристику новых клеточных линий глиобластом, а также оценку их чувствительности к радиотерапии и иммунотерапии моноклональными антителами, связывающими фактор роста VEGF-А и его рецептор VEGFR-1.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культуры клеток. Клеточная линия A172 (глиобластома) была получена из коллекции Института цитологии РАН (Россия), клеточные линии глиобластом Gl–R, Gl–Tr, Gl–L, Gl–Sh, Gl–C, Gl–F получены в лаборатории Клеточной биологии (НИЦ “Курчатовский институт” – ПИЯФ, Россия) из опухолевой ткани пациентов. Клетки культивировали в полной среде DMEM-F12 (Биолот, Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HiMedia, Индия) и 0.5% гентамицина при 37°С в атмосфере 5%-ного СО₂. Количество клеток подсчитывали с помощью автоматического счетчика клеток LUNA-II™ (Logos Biosystems, Korea).

Выделение ДНК, ПЦР и секвенирование. Выделение ДНК из осадка 1 млн клеток проводили набором KR-012 (Omnix, Россия) согласно инструкции фирмы-производителя. Концентрацию ДНК в образцах измеряли с помощью спектрофотометра NanoDrop One (Thermo FS, США). Амлификацию фрагментов ДНК генов IDH-1, IDH-2, KRAS и TP53 проводили с помощью ПЦР. Реакционная смесь (60 мкл) содержала однократный Turbo-буфер для Taq-HS-полимеразы, 2.5 ед. Taq-HS-полимеразы (Евроген, Россия), 250 мкМ каждого dNTP, 300 нМ прямого и обратного праймера (3'–5' IDH-1: f-gag aat cgt gat gcc acc aa, r-ttg gaa att tct ggg cca tga, IDH-2: f-tct ggc tgt gtt gtt gct tg, r‑aga gac aag agg atg gct ag, KRAS: f-ggt cct gca cca gta ata tgc, r-tac gat aca cgt ctg cag tca ac, р53, третий–четвертый экзоны: f-cag ccc cct agc aga gac ct, r-ggt gaa gag gaa tcc caa agt tcc, пятый–шестой экзоны: f-tct cct tcc tct tcc tac agt act cc r-gga ggg cca ctg aca acc acc ctt, седьмой–восьмой экзоны: f-gcc tca tct tgg gcc tgt gtt atc tc, r-tgg tct ctc cac cgc ttc ttg t) и 0.2 мкг ДНК. Реакцию проводили на амплификаторе Т100 Thermal Cycler (BioRad, США): 5 мин, 95°С (активация полимеразы), 35 циклов: денатурация ДНК (95°С, 30 с), отжиг праймеров (60°С, 25 с), элонгация (72°С, 45 с). Визуализацию полученных фрагментов проводили с помощью электрофореза в 6%-ном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. Полученный фрагмент ДНК очищали от низкомолекулярных фрагментов и остатков фермента с помощью набора Cleanup Standard (BC022S, Евроген, Россия) согласно инструкции производителя. Секвенирование по Сенгеру проводили на генетическом анализаторе “Нанофор 05” (ИАП РАН, Россия). Результаты анализировали с помощью программы SnapGene Viewer.

Выделение тотальной РНК и ОТ-ПЦР в реальном времени. Тотальную РНК выделяли, используя реагент ЛИРА (LRU-100-50, Biolabmix, Россия) согласно инструкции производителя. Концентрацию тотальной РНК в образцах измеряли с помощью спектрофотометра NanoDrop One (Thermo FS, США). Тотальную РНК обрабатывали ДНКазой I (Thermo FS, США) при 37°C, 40 мин для деградации геномной ДНК. Экспрессию генов ТP73, VEGF-A и VEGFR-1 оценивали с помощью ОТ-ПЦР. Для реакции использовали набор Genta Single-tube RT-PCR-мастер-микс (RT-M-003, GenTerra, Россия). Реакционная смесь (25 мкл) содержала однократную мастер-микс, 375 нМ прямого, обратного праймера и зонда ([25], 3'–5' VEGF-A f-gag gca gct tga gtt aaa c, r-ttc tgt cga tgg tga tgg tg, p-FAM-tgc aga tgt gac aag ccg agg c-BHQ1, VEGFR-1 f-tca gca cat tcc cta gtg ag, r-cac agg tgg ttt gcg tat gt, p-FAM-tac tgg ctc ctg gca gcg gct-BHQ1, actin f-atg cag aag gag atc act gc, r‑ata ctc ctg ctt gct gat cc, p-FAM-atc att gct cct cct gag cgc aa-BHQ1) и 0.5 мкг РНК. Реакцию проводили на амплификаторе CFX96 Touch™ (BioRad, США): 30 мин, 50°С (обратная транскрипция), 15 мин, 95°С (активация полимеразы) и 45 циклов: денатурация фрагмента ДНК (95°С, 15 с), отжиг праймеров и зонда (58°С, 30 с), элонгация (72°С, 60 с). Относительную экспрессию генов-мишеней определяли по значениям пороговых циклов и нормировали на экспрессию гена актина.

Облучение клеток и оценка жизнеспособности. Клетки всех линий глиом облучали градуированными дозами 1–8 Гр рентгеновского излучения с энергией 35 КэВ или γ-излучением с энергией 1.2 МэВ с использованием ⁶⁰Co-источника γ-лучей “Исследователь” (НИЦ “Курчатовский институт” – ПИЯФ, Россия), а их жизнеспособность оценивали с помощью AlamarBlue (резазурин) теста [1].

Проточная цитометрия. Клетки линий А172 и Gl–Tr фиксировали 4%-ным формальдегидом. Часть клеток дополнительно обрабатывали 0.5%-ным раствором тритона для пермеабилизации мембраны. Инкубировали с первичными антителами клонов 4С1 и 3В12 к VEGFR-1 (monoclon-mouse, 0.1 мкг/мл) 12 ч, 4°С. Окрашивали вторичными антителами anti-mouse-Alexa488 (17с01220, Hansa BioMedLife Science, Эстония, 1 нг/мл) в течение 1 ч при 4°С и визуализировали на проточном цитометре CytoFlex (Beckman Coulter) при длине волны лазера 480 нм, накапливая минимум 20  000 событий.

Оценка жизнеспособности клеток в режиме реального времени. Культуры клеток А172 и Gl–Tr высаживали в Е-плашки в концентрации 2 × 10⁴ клеток/лунку и помещали в прибор xCELLigence Real-Time Cell Analysis (37°C, СО₂). Через 24 ч среду заменяли на новую с моноклональными антителами к рецепторам VEGFR-1 (клоны 4С1, 3В12), препаратом Авастин в концентрации 1 мг/мл или их комбинацией в концентрации по 0.5 мг/мл каждого. За ростом клеток наблюдали в течение 10 дней.

Статистический анализ. Эксперименты по анализу экспрессии, а также пролиферации клеток проводили минимум в трех повторах. Визуализация и анализ данных были осуществлены при помощи программного обеспечения GraphPad Prism. Обработка данных проточной цитометрии и их визуализация осуществлены при помощи плагина со свободным доступом Floreada.io. Результаты на гистограммах представлены как среднее ± SD. Данные сравнивали при помощи однофакторного дисперсионного анализа ANOVA c использованием теста Тьюки для поправок на множественные сравнения. Различия считали статистически значимыми при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Гетерогенность глиобластом является одной из их особенностей. Популяции клеток, составляющих опухоль, могут различаться как у разных пациентов, так и внутри одного образования, поэтому для поиска прогностических молекулярных маркеров и разработки терапевтических схем целесообразно использовать сразу несколько различающихся между собой клеточных линий. Работы по получению и характеристике новых клеточных линий глиобластом ведутся с середины XX века и до сих пор не теряют своей актуальности в связи с неэффективностью противоопухолевой терапии и низкой выживаемостью пациентов [6]. Наиболее перспективной стратегией проведения исследований является использование культивируемых клеточных линий, полученных из биоптатов пациентов, и их сравнение с существующими стандартными линиями глиом. На рис. 1 представлены фотографии глиобластом Gl–R, Gl–Tr, Gl–L, Gl–Sh, Gl–C, Gl–F, полученных из опухолевого материала пациентов. Клеточные культуры различаются по размеру и форме клеток и особенностям роста, что делает их потенциально интересными моделями для тестирования схем противоопухолевой терапии.

Рис. 1.

Микрофотографии глиобластом. Микрофотографии клеток линий Gl–R, Gl–Tr, Gl–L, Gl–Sh, Gl–C, Gl–F получены с помощью микроскопа Life Technologies Evos (Thermo FS, UK) при увеличении ×20.

Мутации в генах изоцитратдегидрогеназы. Наличие мутаций в генах изоцитратдегидрогеназы является важным прогностическим маркером. Глиомы с мутировавшими генами IDH1 и IDH2 лучше отвечают на терапию и имеют более благоприятный прогноз лечения [26]. В глиобластомах гены IDH1 и IDH2 изменены крайне редко. Наиболее частыми мутациями в IDH являются замены консервативных аргининов в положениях R100, R109, R119, R132 для 1 типа IDH и R140, R149, R159, R172 для 2 типа на гистидины, что приводит к появлению дополнительной функции фермента, посредством которой он преобразует α-кетоглутарат (α-KG), нормальный продукт, в D-2-гидроксиглутарат (D-2HG). Как это способствует онкогенезу, в настоящее время не понятно, но, вероятно, связано с воздействием D-2HG на деметилазы ДНК, что способствует метилированию ДНК и гистонов [8, 27]. Выбранные праймеры полностью охватывали области генов IDH1 и IDH2, содержащих “горячие точки”, но ни в одной из исследованных глиобластом не было выявлено замен в консервативных аргининах. Следовательно, Gl–R, Gl–Tr, Gl–L, Gl–Sh, Gl–C, Gl–F являются глиобластомами “дикого” типа по IDH, относятся к глиомам с плохим прогнозом лечения и являются хорошей моделью для подбора и тестирования схем противоопухолевой терапии.

Мутации в гене TP53. Мутации в IDH часто сопряжены с мутациями в р53 или с ко-делецией в хромосомах 1p/19q. В глиобластомах мутации в гене TP53 встречаются в только 20–30% случаев, в глиомах IV степени с мутировавшим геном IDH – в 60–70% случаев. Подавляющее количество описанных мутаций в гене TP53 сосредоточено между 125 и 300 кодонами. Выбранные праймеры располагались в интронах и охватывали все “горячие области”.

В Gl–Tr и Gl–L была обнаружена патогенная мутация rs11540654 в позиции 110-й аминокислоты c.329G > C (p.Arg110Pro). Эта мутация мало описана в литературе. Она встречается при синдроме Ли–Фраумени [28]. Замена аргинина на пролин может приводить к конформационным изменениям в активном центре белка. Аргинин несет два основных центра: аминогруппу в α-положении, способную образовывать множественные водородные и ионные связи, и гуанидиновую в δ-положении. В молекуле пролина атом азота не связан с атомом водорода и не может быть донором водорода при формировании водородной связи. Кроме того, пролин сильно изгибает пептидную цепь. Таким образом, замена Arg на Pro в ДНК-связывающем домене белка р53 может сильно влиять на его функции.

Полиморфизм rs1042522 в четвертом экзоне в позиции 72-й аминокислоты c.215C > G (p.Pro72Arg) относится к доброкачественным изменениям, широко описанным в литературе [29, 30]. Считается, что выбор аминокислоты в данной позиции происходит под действием “естественного отбора” в зависимости от широты и количества УФ-излучения. У европейцев состав данного полиморфизма 60, 30 и 10% для Arg/Arg, Arg/Pro и Pro/Pro соответственно. В исследуемых глиобластомах полиморфизм Pro/Pro наблюдался в Gl–R, Gl–Tr и Gl–L, полиморфизм Arg/Arg – в Gl–Sh, полиморфизм Arg/Pro – в Gl–C и Gl–F.

Делеция rs59758982 в 16 пар оснований в третьем интроне, которая классифицируется как полиморфизм и относится к доброкачественным изменениям, не влияющим на функции белка р53, была обнаружена у всех шести исследуемых глиобластом.

Полиморфизмы rs12951053 и rs12947788 (14181C > T, 14201T > G) являются сцепленными, находятся в седьмом интроне и могут способствовать образованию дефектного белка р53 [31]. В исследуемых глиобластомах полиморфизмы наблюдались в Gl–R, Gl–Tr, Gl–L в гомозиготном варианте и в Gl–C, Gl–F в гетерозиготном варианте.

Таким образом, исследуемые глиобластомы различаются по полиморфизмам в гене ТР53, кроме того, две из них имеют патогенную мутацию, что делает перспективным их совместное использование для исследования новых стратегий в радио- и химиотерапии.

Экспрессия изоформ белка р73. Во многих опухолях, в том числе глиобластомах, наблюдаются сверхэкспрессия полноразмерной (онкосупрессорной) изоформы ТА белка р73 и появление его укороченных (онкогенных) изоформ, что способствует прогрессии опухоли, опосредуя ангиогенез и повышая выживаемость опухолевых клеток, и является неблагоприятным прогнозом для терапии. Изоформы белка р73 могут различаться по N- и C-концу [32] (табл. 1). Среди укороченных по N-концу изоформ наиболее значимую роль в развитии опухоли играют Δеx2p73, Δеx2/3p73, ΔN'p73 и ΔNр73 [25]. Анализ N-концевых изоформ выявил (рис. 2а) экспрессию полноразмерной изоформы ТАр73 в глиобластомах Gl–R, Gl–Tr, Gl–Sh, Gl–C, Gl–F и появление укороченных изоформ во всех шести клеточных линиях, причем в Gl–L, Gl–Tr, Gl–Sh, Gl–C наблюдалась экспрессия всех четырех проанализированных изоформ, а в Gl–R и Gl–F отсутствовала экспрессия изоформы Δex2/3р73.

Рис. 2.

Уровень экспрессии изоформ гена ТР73 в клеточных линиях глиобластом и их чувствительность к радиотерапии: а – относительный уровень экспрессии РНК N-концевых изоформ гена ТР73, б – наличие С-концевых изоформ гена ТР73; выживаемость линий глиобластом (данные резазурин-теста) после облучения γ-радиацией (в) или рентгеном (г) в диапазоне доз 0–6 Гр.

В Gl–R, Gl–Tr, Gl–C экспрессия р73 была значительно выше, чем к культуре А172. В культурах и Gl–Sh суммарная экспрессия РНК укороченных изоформ выше, чем экспрессия полноразмерной изоформы ТАр73 (отношение экспрессии ТАр73 к сумме экспрессий укороченных изоформ 0.5). В Gl–L полностью отсутствовала экспрессия полноразмерной изоформы ТАр73. В Gl–F отношение экспрессии полноразмерной изоформы к укороченным равно единице. Для Gl–R, Gl–Tr, Gl–C и А172 экспрессия РНК полноразмерной изоформы была выше экспрессии укороченных в 3.6, 1.5, 2 и 1.3 раза соответственно.

Анализ С-концевых изоформ белка р73 показал, что во всех исследуемых глиобластомах были обнаружены полноразмерная α и укороченные β, γ, ε и δ (рис. 2б). В линии Gl–Tr дополнительно наблюдалась изоформа ζ.

В настоящее время радиотерапия является одним из основных способов лечения опухолей головного мозга, однако многие глиобластомы обладают довольно высокой радиорезистентностью, а повышение дозы радиации губительно и для здоровых клеток мозга. Одними из причин резистентности к облучению могут быть повышенная экспрессия белка р73 и появление его онкогенных изоформ в глиобластомах [33]. Накопление разрывов в ДНК в ответ на облучение должно приводить к активации белков семейства р53 и запуску апоптоза. Транскрипционные факторы р53 и р73 функционируют как тетрамеры. Укороченные по N-концу изоформы белка р73 могут встраиваться в тетрамеры как р73, так и р53 и препятствовать их нормальной работе [34]. Кроме того, дефектные белки конкурируют за сайты связывания с полноценными транскрипционными факторами и препятствуют запуску экспрессии РНК генов-мишеней, отвечающих за развитие апоптоза. Более того, изоформа ΔNр73 способна присоединяться непосредственно к месту повреждения ДНК, взаимодействовать с сенсорным белком 53ВР1, определяющим наличие разрыва, и ингибировать активацию АТМ, фосфорилирование белка р53 и запуск апоптоза [26]. Различные соотношения количеств онкогенных и онкосупрессоронй изоформ р73 могут приводить к тому, что глиобластомы будут по-разному отвечать на различные дозы и виды облучения. В исследуемых клеточных линиях ген р73 высокоэкспрессирован, а укороченные по N-концу изоформы присутствуют в разных количествах, что делает совместное использование Gl–R, Gl–Tr, Gl–Sh, Gl–L, Gl–C и Gl–F перспективной моделью для исследования радиорезистентности.

Чувствительность линий глиобластом к γ-облучению. Из исследуемых глиобластом наиболее чувствительной к γ-радиации оказалась Gl–C (рис. 2в). Самой устойчивой была Gl–F. Интересно, что у этих глиобластом полностью совпадает р-53-статус (нет патогенных мутаций, а все обнаруженные полиморфизмы встречаются в гетерозиготном состоянии), при этом соотношение экспрессии РНК полноразмерной и укороченных изоформ р73 для Gl–C – 2.0, а для Gl–F – 1.0. Gl–R, Gl–Tr, Gl–Sh и Gl–L были устойчивее к γ-радиации, чем культура А172. При этом Gl–Sh с не мутировавшим р53, но с соотношением изоформ белка р73 0.5 вела себя так же, как и Gl–Tr с белком р53, несущим патогенную мутацию, и соотношением изоформ р73 1.5. Gl–L должна была оказаться наиболее устойчивой к радиотерапии, однако при дозах 2 и 4 Гр она отвечала на γ-радиацию сильнее Gl–Tr, Gl–Sh, но при 6 Гр в ней сохранялось больше жизнеспособных клеток. В Gl–R соотношение изоформ р73 было заметно сдвинуто в сторону ТАр73, в белке р53 отсутствовали мутации, но клеточная линия оказалась устойчивой к γ-излучению. Вероятно, механизм резистентности здесь формируется из-за повреждений каких-либо других молекулярных путей.

Чувствительность к облучению рентгеном. Из исследуемых глиобластом наиболее чувствительной к рентгену также была Gl–C (рис. 2г). Остальные глиобластомы показали примерно одинаковую чувствительность к дозам 1–3 Гр. При дозе 4 Гр Gl–F оказалась менее чувствительной к облучению, чем остальные. При дозе 6 Гр Gl–Sh, Gl–F (ТАр73/укороченные изоформы ≤1), Gl–L (патогенная мутация в белке р53 и отсутствие ТАр73) оказались более устойчивыми к рентгеновскому облучению, чем А172, Gl–R и Gl–Tr.

Таким образом, исследуемые глиобластомы имеют разный р53- и р73-статус, по-разному отвечают на радиотерапию γ- и рентгеновским облучением и могут быть использованы как модели для подбора доз облучения и тестирования сенсибилизирующих агентов.

Мутации в гене KRAS. Перспективным направлением для лечения глиобластом является иммунотерапия. В 57% глиобластом наблюдаются амплификация гена рецептора эпидермального фактора роста (EGF) [35, 36] и увеличение уровней его экспрессии на мембране клетки. Использование антител как против самого рецептора, так и против EGF могло бы стать перспективной терапевтической схемой лечения глиобластом. Белок KRAS (член семейства RAS-белков) активируется при присоединении EGF к рецептору и дезактивируется после расщепления связанной с ним молекулы GTP, прерывая прохождение сигнала. Замена в 12 и 13 кодонах гена KRAS, кодирующих глицин, единственную аминокислоту без боковых радикалов на любую аминокислоту приводит к нарушению пространственной конфирмации белка и препятствует его инактивации. В результате каскад EGF остается активным не зависимо от статуса рецептора и это делает невозможным проведение иммунотерапии, связанной с EGF и EGFR. Выбранные праймеры охватывали области 12–13 кодонов. Ни в одной из исследованных глиобластом не было выявлено замен в 12-м и 13-м глицинах. Таким образом, Gl–R, Gl–Tr, Gl–L, Gl–Sh, Gl–C, Gl–F могут быть использованы как модели для исследования и оптимизации иммунотерапии, связанной с EGF и его рецептором.

Экспрессия РНК генов VEGF-А и VEGFR-1 и белка VEGFR-1. Другой мишенью для иммунотерапии глиобластом являются фактор роста эндотелия сосудов и его рецептор 1 типа. В [6] было отмечено, что в глиобластомах Gl–R и Gl–Tr присутствует высокая активность ростовых факторов TGFβ1, VEGF и FGF2(b). В настоящей работе оценили экспрессию РНК генов VEGF-А и VEGFR-1 во всех исследуемых глиобластомах и обнаружили, что ее уровень выше, чем в клеточной линии А172 (рис. 3а). Для Gl–Tr и Gl–C экспрессии РНК фактора и рецептора превышали соответствующие значения для А172 в 2–5 раз. В Gl–Sh и Gl–F экспрессия РНК рецептора была выше в 2.6 и 13.2 раза, при этом значительно возрастала и экспрессия РНК VEGF-A в 11.1 и 44.2 раза соответственно. В Gl–L заметно возрастали уровни экспрессии РНК как рецептора (в 20.8 раза), так и фактора (в 352.4 раза). В Gl–R, наоборот, значительно возрастала экспрессия РНК гена VEGFR-1 (в 178.5 раза) при повышении экспрессии РНК фактора в 4.3 раза относительно А172.

Рис. 3.

Иммунотерапия глиобластом. Уровень экспрессии мРНК VEGF-A и VEGFR-1 в клетках линий А172, Gl–R, Gl–Tr, Gl–L, Gl–Sh, Gl–C, Gl–F по данным ОТ-ПЦР в реальном времени (а). Иммунофлюоресцентный анализ экспрессии общего белка VEGFR-1 и его рецепторной формы, находящейся на мембране клеток линий А172 и Gl–Tr. Данные проточной цитометрии по визуализации VEGFR-1 моноклональными антителами 4С1 и 3B12 (б). Выживаемость клеток линий А172 и Gl–Tr при инкубации в присутствии моноклональных антител к VEGFR-1 человека 4С1 или 3В12, препарата Авастин, связывающего VЕGF-A и их комбинации (в).

Интересно, что в не опухолевых клетках, таких как HEK-293 и DF-2, экспрессия РНК гена VEGFR-1 выше, чем экспрессия РНК самого фактора. В исследованных глиобластомах только в Gl–R наблюдалось такое же соотношение, в остальных пяти опухолевых культурах экспрессия фактора VEGF-A значительно превышала экспрессию его рецептора. Таким образом, исследуемые глиобластомы различаются по уровням экспрессии РНК генов VEGF-А и VEGFR-1 и их соотношений между собой.

С помощью цитометрических измерений для глиобластом А172 и Gl–Tr оценили уровни экспрессии белка VEGFR-1 и соотношение его рецепторной и растворимой форм (рис. 3б). В Gl–Tr экспрессия общего белка и рецепторной формы VEGFR-1 была выше, чем в А172. При этом в Gl–Tr в рецепторной форме на мембране клетки находились 42 и 54% белка VEGFR-1 (при окрашивании антителами к VEGFR-1 клонов 3В12 и 4С1 соответственно), а в А172 66 и 71% соответственно.

Иммунотерапия. Тестирование иммунотерапевтической схемы лечения с использованием антител клонов 4С1 и 3В12 к рецептору VEGFR-1 проводили на культурах А172 и Gl–Tr с помощью оценки клеточного роста в реальном времени на приборе xCELLigenсe (рис. 3в). Клеточная линия А172 оказалась не чувствительной к иммунотерапии авастином и моноклональными антителами к VEGFR-1. Напротив, выживаемость Gl–Tr снизилась на 50% при обработке клеток авастином. При использовании антител к VEGFR-1 клона 3В12 выживаемость клеток снизилась до 10%, а при использовании антител клона 4С1 упала ниже 5%. Совместное применение авастина и антител к VEGFR-1 клона 4С1 привело к полному подавлению роста клеток глиобластомы Gl–Tr. Таким образом, Gl–Tr может быть использована как модель тестирования схем иммунологической терапии, направленной на блокирование фактора роста эндотелия сосудов и его рецептора 1 типа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Описанные культуры глиобластом Gl–R, Gl–Tr, Gl–L, Gl–Sh, Gl–C, Gl–F являются стабильно культивируемыми клеточными линиями, отличающимися друг от друга размерами и формой клеток, р53- и р73-статусами, а также уровнями экспрессии РНК генов фактора роста эндотелия сосудов и его рецептора 1 типа. Все это делает описанные клеточные линии перспективными моделями для исследования формирования устойчивости глиобластом к радиотерапии и для тестирования новых сенсибилизирующих агентов. Кроме того, описанные линии глиобластом могут быть использованы как модели для тестирования синтетических антител против VEGFR-1 и разработки схем иммунотерапии, направленной на блокирование VEGF и его рецептора.

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (проект № 075-15-2021-1360) и в рамках государственного задания (регистрационный номер № 121060200125-2).