Нейрохимия, 2020, T. 37, № 1, стр. 460-53

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время более чем у 350 млн чел. по всему миру диагностировано депрессивное расстройство [1], что делает изучение механизмов его формирования актуальной проблемой современности [2]. Для изучения механизмов развития депрессии используют разнообразные модели депрессивноподобного состояния экспериментальных животных, основанные, как правило, на непосредственном физическом воздействии на животное [3]. В данной работе использовали модель хронического воздействия ультразвуковых частот [4, 5]. Ее стрессовое влияние основывается на противоположной эмоциональной и мотивационной нагрузке, которую несут подающиеся случайным образом ультразвуковые частоты, одни из которых (20–25 кГц) ассоциированы с отрицательным эмоциональным состоянием грызунов, а другие (40–45 кГц) – с положительным [6, 7]. Преимущество этой модели перед другими заключается в том, что она приводит к развитию состояния информационной неопределенности, наиболее приближенного к причинам стресса у человека [8].

Существуют различные теории патогенеза депрессивного расстройства, наиболее известной из которых является теория дисбаланса моноаминергических систем мозга [9], однако точные причины развития клинической депрессии до сих пор неясны. При этом в последнее время все чаще внимание исследователей привлекает роль ГАМКергической системы в патогенезе депрессивного расстройства. В частности, отмечается важная роль ионотропного ГАМК_А-рецептора, отвечающего за быструю ингибиторную трансмиссию [10, 11]. Так, было установлено, что нарушение функционирования ряда субъединиц данного рецептора, в том числе α1–4, β1–2 и γ1-субъединиц, предположительно ассоциировано с депрессивными нарушениями [12, 13]. Наиболее интересными для исследования структурами головного мозга представляются гиппокамп, префронтальная кора, средний мозг и миндалина, поскольку изменение их функционирования наиболее часто ассоциировано с развитием депрессивного расстройства [14–16]. Учитывая сказанное выше, целью работы стала проверка нашего предположения об изменении относительной экспрессии генов, кодирующих субъединицы α1, α2, α3 и β2 ГАМК_А-рецепторов в гиппокампе, префронтальной коре, среднем мозге и миндалине крыс с депрессивноподобным состоянием, индуцированным хроническим ультразвуковым воздействием.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на самцах крыс линии Sprague–Dawley из питомника лабораторных животных “Пущино”. В начале эксперимента возраст животных составлял 2.5–3 мес. На протяжении всего опыта животные содержались в индивидуальных поликарбонатных клетках размером 30 × 20 × 15см при постоянной температуре 23°С, контролируемом прямом освещении в режиме 12 : 12 ч и свободным доступом к воде и пище. Содержание крыс и все экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с международными правилами обращения с животными (Директива 2010/63 Европейского сообщества от 22 сентября 2010 г.). Было задействовано 3 опытные группы животных и группа контроля (по 10 особей в каждой группе). Опытные группы подвергались воздействию ультразвуковых волн частотой 20–45 кГц, подающихся случайным образом в течение 1, 2 и 3 нед.

Ультразвуковое воздействие производили с помощью УЗ-генератора (Weitech, Wavre, Belgium). Диапазон излучаемых частот составлял 20–45 кГц; уровень звукового давления на расстоянии 1.5 м равнялся 80 дБ.

Через сутки после окончания ультразвуковой экспозиции проводили поведенческое тестирование. Все тесты проводили в дневное время с 10 до 13 ч. Поведение животных во всех тестах регистрировали с помощью цифровой видеокамеры и анализировали, используя компьютерную программу RealTimer (“Открытая наука”, Россия). Использовались следующие поведенческие тесты:

Тест на предпочтение раствора сахарозы. В течение 24 ч крысам одновременно был предоставлен доступ к выбору между двумя идентичными поилками, одна из них содержала 1%-ый раствор сахарозы, а другая — обычную воду. Расположение поилок менялось через 12 ч, чтобы исключить эффект предпочтения места. Предпочтение раствора сахарозы вычисляли по следующей формуле: Предпочтение = (масса потребленного раствора сахарозы/суммарная масса потребленной жидкости) × 100%. Потребление воды и раствора сахарозы было оценено путем взвешивания поилок до и после окончания эксперимента.

Тест “Социального взаимодействия”. В домашнюю клетку тестируемого животного на 10 мин помещали ювенильного самца крыс линии Sprague–Dawley (возрастом 4–5 нед.). Регистрировали суммарное время социальных (обнюхивание партнера, груминг и следование) контактов между экспериментальными животными.

Модифицированный тест “Принудительного плавания”. Крысу помещали в стеклянный цилиндр высотой 45 см и диаметром 20 см, на 30 см заполненный водой, температура которой составляла 24°С. После 2 мин адаптации в течение 6 мин регистрировали суммарную длительность иммобильности (отсутствия активных движений). Воду меняли после каждого животного.

Через сутки после окончания тестирования животных глубоко наркотизировали (5% р-р кетамина, 200 мг/кг, внутрибрюшинно), затем проводили декапитацию, извлекали головной мозг и на холодной подложке выделяли гиппокамп, префронтальную кору, средний мозг и миндалину. Структуры помещали в раствор RNAlater (Qiagen, Германия) и хранили при 4°С до выделения тотальной РНК. Выделение тотальной РНК из ткани проводили с помощью TRI REAGENT (MRC, США) по протоколу производителя. Концентрацию тотальной РНК в полученных образцах измеряли с помощью спектрофотометра NanovuePlus (GE Healthcare, США). Обратную транскрипцию проводили с помощью набора производства компании “ЕВРОГЕН” (Россия), используя амплификатор Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific, США). При обратной транскрипции использовали 1000 нг тотальной РНК. ПЦР в реальном времени проводили при помощи амплификатора StepOnePlus (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, США). Для исследования были выбраны гены GABRA1, GABRA2, GABRA3 и GABRB2, а в качестве референсного гена − ген GAPDH. Референсный ген был выбран на основе предыдущих публикаций, посвященных исследованию генной экспрессии мозга экспериментальных животных, подвергающихся хроническому ультразвуковому воздействию [4, 17], где была продемонстрирована низкая вариабельность данного гена в лимбических структурах мозга. Последовательности праймеров, представленные в табл. 1, были получены с использованием программы BeaconDesigner 7 (Premier Biosoft International, США) и синтезированы в компании “Евроген” (Россия). Перед постановкой ПЦР в реальном времени кДНК разводили в 5 раз до концентрации 200 нг/мкл. Для каждого праймера измерялась эффективность ПЦР, составившая 95–98%. ПЦР в реальном времени проводили с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, США) при следующих условиях: первичная денатурации при температуре 95°С в течение 4 минут, денатурация – при температуре 95°С в течение 20 с, отжиг и элонгация – при температуре 62°С в течение 1 мин 30 с. Все реакции повторялись в течение 40 циклов. Реакцию осуществляли в объеме 10 мкл, используя 1 мкл исследуемой кДНК. При каждом исследовании реакцию ставили в трех повторах. Эксперимент проводили в двух повторах. Относительный уровень экспрессии целевых генов рассчитывали по формуле 2^–ΔΔСt ± 2^±SEM [18]. Значение порогового цикла (Ct) соответствует относительному количеству целевой РНК. Уровень экспрессии генов опытных групп сравнивался с уровнем их экспрессии группы контроля.

Данные по измерению показателей относительной экспрессии генов выражали как Mean ± SEM. Предварительно был проведен тест Колмогорова–Смирнова, результаты которого не отрицали нормальность распределения данных. Для статистической обработки данных использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с последующим post hoc анализом Fisher’s LSD test. Статистически значимыми считались различия при p < 0.05. Для статистического анализа использовалась программа GraphPadPrism 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Поведенческое тестирование. Только две и более недель хронического ультразвукового воздействия привели к статистически значимому снижению предпочтения сахарозы (F_3,36 = 4.02, p < 0.05, one-way ANOVA, рис. 1) и увеличению длительности иммобильности в тесте “Принудительного плавания” (F_3,36 = 3.35, p < 0.05, one-way ANOVA, рис. 2). При этом снижение продолжительности социальных контактов в тесте “социального взаимодействия” было зарегистрировано уже через одну неделю ультразвукового воздействия (F_3.36 = 6.99, p < 0.05, one-way ANOVA, рис. 3).

Рис. 1.

Предпочтение крысами сахарозы было снижено по сравнению с контрольной группой через 2 нед. и 3 нед. (p < 0.05, post hoc Fisher’s LSD test) хронического ультразвукового воздействия.

Рис. 2.

Длительность иммобильности была увеличена по сравнению с контрольной группой через 2 нед. и 3 нед. (p < 0.05, post hoc Fisher’s LSD test) хронического ультразвукового воздействия.

Рис. 3.

Длительность социального взаимодействия крыс с ювенильными самцами была снижена по сравнению с контрольной группой через 1 нед., 2 нед. и 3 нед. (p < 0.05, post hoc Fisher’s LSD test) хронического ультразвукового воздействия.

Исследование относительной генной экспрессии. В нашем исследовании ультразвуковое воздействие вызвало существенное снижение экспрессии гена GABRA1, кодирующего субъединицу α1 ГАМК_А-рецепторов. При этом сроки и выраженность развития статистически значимого снижения экспрессии данного гена были различны в разных структурах. Так, в гиппокампе и префронтальной коре снижение экспрессии наблюдалось уже после 1 недели ультразвукового воздействия и сохранялось во всех экспериментальных группах, т.е. на всех рассмотренных сроках ультразвукового воздействия. В отличие от этого, в среднем мозге и миндалине снижение экспрессии гена GABRA1 наблюдалось только после 2 нед. стрессового воздействия (табл. 2).

Влияние ультразвукового воздействия на относительную экспрессию гена GABRA2, кодирующего субъединицу α2 ГАМК_А-рецептора, оказалось выраженным слабее по сравнению с его влиянием на относительную экспрессию гена GABRA1 (табл. 3). Так, в гиппокампе, в отличие от гена GABRA1, ни один из рассматриваемых сроков ультразвукового воздействия не привел к изменению экспрессии гена GABRA2. При этом в префронтальной коре также наблюдалось снижение экспрессии гена GABRA2 уже после одной недели ультразвукового стресса.

Другое отличие заключалось в том, что в среднем мозге и миндалине снижение экспрессии гена GABRA2 проявилось только после 3 нед. хронического ультразвукового воздействия.

Аналогично уровню экспрессии гена GABRA1 и в отличие от уровня экспрессии гена GABRA2, экспрессия гена GABRA3, кодирующего субъединицу α3 ГАМК_А-рецепторов, снизилась в гиппокампе и префронтальной коре после 1 нед. ультразвукового воздействия (табл. 4). Снижение экспрессии гена GABRA3 также наблюдалось в среднем мозге, но только после 3 нед. ультразвукового воздействия. При этом в миндалине, в отличие от результатов, полученных при изучении экспрессии генов GABRA1 и GABRA2, не наблюдалось статистически значимого изменения экспрессии гена GABRA3 ни на одном из сроков ультразвукового воздействия.

В целом, изменения экспрессии гена GABRA3 оказались менее выраженными, чем изменения экспрессии гена GABRA1, но более выраженными, чем изменения экспрессии гена GABRA2.

В отличие от активности всех рассмотренных ранее генов, кодирующих субъединицы α1, α2 и α3, активность гена GABRB2, кодирующего субъединицу β2 ГАМК_А-рецепторов, оказалась не ассоциирована с развитием депрессивноподобного состояния в данной модели, поскольку уровень его относительной экспрессии не изменился ни в одной структуре и ни на одном из рассмотренных сроков ультразвукового воздействия (табл. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Роль ГАМКергической системы в патогенезе депрессивного расстройства остается менее изученной по сравнению с системами моноаминовых нейромедиаторов. Однако ряд исследований указывает на ее взаимосвязь с развитием как клинической депрессии человека, так и депрессивноподобного состояния экспериментальных животных. В частности, имеются подтверждения роли различных субъединиц ГАМК_А-рецепторов в развитии депрессивноподобного состояния грызунов, однако в основном соответствующие исследования проводились на мышах и крысах, нокаутных по гену, кодирующему какую-либо субъединицу данного рецептора [19, 20]. Таким образом, наблюдается недостаток изучения роли данных субъединиц у животных со стресс-индуцированным депрессивноподобным состоянием. В связи с этим, представляют интерес полученные нами данные с использованием новой модели депрессивноподобного состояния.

Тест вынужденного плавания долгое время рассматривался как модель “поведенческого отчаяния” – еще одного характерного симптома депрессивноподобного состояния [21]. Увеличение времени иммобильности (отсутствия активных попыток выбраться из наполненного водой цилиндра) в данном тесте рассматривается как пассивная стратегия борьбы со стрессовой ситуацией и наблюдается при развитии депрессивноподобного состояния [22]. Однако в настоящее время рядом исследователей оспаривается трактовка этой процедуры как теста на определение депрессивноподобного состояния грызунов [23], поэтому в настоящей работе также был проведены другие поведенческие тесты, в том числе тест на развитие ангедонии, считающийся наиболее достоверным методом определения депрессивноподобного состояния у грызунов. Так, наличие ангедонии означает снижение способности получать удовольствие [24]. У грызунов данное состояние выражается в том числе в снижении предпочтения к раствору сахара, поскольку в норме грызуны предпочитают потреблять подслащенный раствор, в то время как при наличии депрессивноподобного состояния это предпочтение снижается или отсутствует [25]. В данной работе изменения поведения были зарегистрированы в обоих тестах и только спустя 2 нед. ультразвукового воздействия. При этом уже после 1 нед. ультразвукового воздействия было обнаружено нарушение социального поведения самцов крыс, выражающееся в снижении длительности социальных контактов.

Интересно, что снижение относительной генной экспрессии субъединиц ГАМК_А-рецептора также было зарегистрировано уже после 1 нед. ультразвукового воздействия. При этом наиболее чувствительной к стрессовому воздействию в данной модели оказалась субъединица α1 ГАМК_А-рецептора, поскольку снижение относительной экспрессии кодирующего ее гена GABRA1 наблюдалось во всех изучаемых структурах мозга.

В отличие от гена GABRA1, уровень относительной экспрессии генов GABRA2 и GABRA3 снижался не во всех исследуемых структурах. Так, снижение экспрессии гена GABRA2, кодирующего α2-субъединицу, произошло только в среднем мозге и миндалине, а снижение экспрессии гена GABRA3, кодирующего α3-субъединицу, только в среднем мозге и префронтальной коре. Таким образом, в целом в данной работе наблюдалось стресс-индуцированное снижение количественных компонентов ГАМКергической системы, однако её реакция в ответ на ультразвуковое воздействие в разных структурах мозга оказалась неодинаковой.

Кроме того, исследование динамики снижения относительной экспрессии генов, кодирующих субъединицы ГАМК_А-рецепторов, в ответ на ультразвуковое воздействие позволило установить различные временные интервалы, в которые происходят эти изменения. Так, снижение экспрессии гена GABRA1 наблюдалось уже после 1 нед. хронического ультразвукового воздействия, в то время как снижение экспрессии гена GABRA2 развивалось только после 3 нед. аналогичного воздействия. Таким образом, продолжительность стрессового воздействия может различным образом влиять на функционирование ГАМКергической системы.

Полученные нами данные могут способствовать объяснению некоторых противоречий, полученных ранее другими авторами. Так, в исследовании, посвященном влиянию на функционирование ГАМКергической системы крыс стресса, вызванного вынужденным плаванием, говорится о снижении экспрессии генов, кодирующих различные субъединицы ГАМК_А-рецепторов, в том числе субъединицы α1 и α2 [26]. При этом в другом исследовании не было выявлено изменения экспрессии генов, кодирующих α1- и α2-субъединицы ГАМК_А-рецептора в мозге крыс, подвергнутых процедуре хронического непредсказуемого стресса [27]. Вероятно, подобные отличия в полученных результатах могут быть связаны со сложной зависимостью развития нарушений функционирования различных компонентов ГАМКергической системы, для выяснения которой требуется продолжать исследования в этом направлении.

Таким образом, в нашей работе наблюдалась тенденция к стресс-индуцированному снижению экспрессии генов, кодирующих субъединицы α1, α2 и α3 ГАМКергических рецепторов, подобно тому, как это было отмечено в клинических исследованиях [12, 28]. Данный эффект был обнаружен нами во всех выбранных для исследования структурах мозга и проявился одновременно с поведенческими чертами депрессивноподобного состояния. Однако при этом наблюдалась различная вовлеченность структур в реакции на стрессовое воздействие. Полученные данные могут оказаться важными при сравнении моделей депрессивноподобного состояния, различающихся по длительности стрессового воздействия, и для исследования зависимости развивающихся молекулярных изменений от продолжительности действия стресса в целом.

ВЫВОДЫ

1) Ультразвуковое воздействие, вызывающее развитие депрессивноподобного состояния у крыс, приводит к снижению функции ГАМКергической системы, выраженному в снижении уровня относительной экспрессии генов GABRA1, GABRA2, GABRA3. В уровне экспрессии гена GABRB2 изменений обнаружено не было. 2) Наличие и выраженность изменений, индуцированных воздействием ультразвука переменных частот, зависит от продолжительности стрессового воздействия и структуры мозга.