Нейрохимия, 2020, T. 37, № 1, стр. 800-87

ВВЕДЕНИЕ

Повреждение тканей, хроническое воспаление и ряд других патологий центральной и периферической нервной системы приводит к нарушению ноцицептивной пластичности нейронов с развитием нейропатической боли [1]. Важными проявлениями нейрогенной боли является спонтанная боль, аллодиния и гипералгезия [2]. Так, например, повреждение периферических нервов индуцирует воспаление, сенсибилизацию и активацию первичных сенсорных нейронов, а также увеличивает активность ноцицептивных нейронов второго порядка в спинном мозге. Кроме того, повреждение периферического нерва приводит к активации глиальных клеток спинного мозга, включая астро- и микроглию [3]. После активации глиальные клетки продуцируют ряд провоспалительных цитокинов (интерлейкин (ИЛ)-1β, ИЛ-6, TNF-α) которые активируют и сенсибилизируют чувствительные нейроны в спинном мозге, усиливая ноцицептивную нейротрансмиссию. Эти сложные нейро-глиальные взаимодействия приводят к повышению чувствительности ноцицептивных нейронов спинного мозга (центральная сенсибилизация), снижению порога активации ноцицептивных нейронов (периферическая сенсибилизация) и вызывают спонтанное возбуждение ноцицепторов [4, 5].

Существующий арсенал анальгетиков и препаратов с нейропротекторными свойствами для лечения нейропатической боли обладает рядом недостатков, связанных с низкой эффективностью, высоким риском развития побочных эффектов и неселективностью в отношении патофизиологии болевого процесса, что требует формирования сложных многокомпонентных динамических схем для обеспечения выздоровления пациента [6]. Для комплексной терапии данного патологического состояния значительный интерес представляют вещества из группы полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), демонстрирующие противовоспалительную и антиоксидантную активность [7]. Среди омега-3 ПНЖК выраженные нейротропные эффекты имеет докозагексаеновая кислота (ДГК, 22:6 n-3), которая является одним из важнейших структурных липидов нервной ткани [8, 9]. Результаты, полученные в наших предыдущих экспериментах, демонстрируют, что применение ДГК снижает интенсивность и продолжительность развития нейрогенной боли, приводит к более ранней стабилизации распределения веса, предотвращает развитие холодовой аллодинии и дистрофических изменений в ткани денервированной конечности. А также ингибирует активацию микроглии и синтез проапоптотического белка р53 в спинномозговых ганглиях [10, 11].

В настоящем исследовании мы предположили, что анальгетическая и нейропротекторная активность ДГК реализуется за счет модуляции нейрональной и глиальной активности в центральной и периферической нервной системе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика экспериментального материала. Исследование выполнено на 2–3 месячных самцах крыс линии Вистар (240 ± 20 г), животные размещались парами и имели свободный доступ к пище и воде, содержались при постоянной температуре (23 ± 2°C) и влажности (55 ± 15%) с 12-часовым циклом “день/ночь”. Все экспериментальные манипуляции с животными одобрены комиссией по биомедицинской этике Национального научного центра морской биологии им. А.В. Жирмунского ДВО РАН.

Повреждение седалищного нерва для моделирования нейропатического болевого синдрома проводили, как описано Дж. Беннетом и У. Xью [12], путем наложения трех тугих шелковых лигатур (с интервалом приблизительно 2 мм) на седалищный нерв правой задней лапы крысы. Развитие нейропатического болевого синдрома сопровождается появлением ряда патологических симптомов, поддающихся количественной оценке [13]. В предыдущем исследовании при использовании тестера инвалидности и теста холодной пластины установлена динамика основных болевых феноменов, развивающихся у модельных животных (холодовая аллодиния и моторный дефицит) [10]. Поэтому оценка нейрохимических перестроек в дистальном сегменте поврежденного седалищного нерва и поверхностных пластинах спинного мозга проводилась в те сроки, которые соответствовали инициации нейропатического болевого синдрома (7 дней после операции) и его становлению (28 дней после операции). Животные были разделены на три группы (n = 35): “контроль” (n = 7) – интактные крысы, “боль” (n = 14) – крысы с повреждением седалищного нерва и “боль + + ДГК” (n = 14) – крысы с повреждением седалищного нерва получающие ДГК в дозе 4.5 мг/кг подкожно в течение 2 нед. после операции в объеме 150 мкл (1 раз в сут, ежедневно). Запатентованный препарат ДГК полученный из пищеварительной железы Berryteuthis magister, был предоставлен для исследования, сотрудниками лаборатории фармакологии ННЦМБ ДВО РАН.

Животных анестезировали путем внутрибрюшинного введения смеси, содержащей Золетил 100 (Virbac) + Рометар (Bioveta) в соотношении 1 : 4 (из расчета 10 мг/кг), затем перфузировали 4% раствором параформальдегида, приготовленном на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2) и извлекали материал.

Гистологические методы исследования. Для общеморфологического анализа использовали парафиновые срезы дистального сегмента седалищного нерва толщиной 10 мкм, залитые в парафин по стандартной методике. После депарафинирования срезы окрашивали гематоксилином 15 мин (BioOptica, Италия), промывали проточной водой 20 мин, последовательно опускали в раствор эозина (BioOptica, Италия) и три порции спиртов, обрабатывали ксилолом в течение 10 мин и заключали в монтирующую среду (Dako, CS705, США).

Иммуногистохимические методы исследования. Для оценки морфо-химического состояния дистального сегмента поврежденного седалищного нерва, медиаторного профиля нервных волокон и активности астроглии спинного мозга использовали метод иммунопероксидазной реакции выявления ОБМ (основной белок миелина), субстанция Р (медиатор афферентных нервных волокон) и GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок, маркер астроглии). Использованный в работе иммуногистохимический метод состоит из следующих этапов: фиксация кусочков ткани (4% параформальдегид, приготовленный на 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.2) в течение 12 ч и их последующая промывка; заливка седалищного нерва в парафин по стандартной методике и заключение поясничного сегмента спинного мозга в криопротекторную среду (NEG 50, Thermo Scientific, США); получение серийных парафиновых (10 мкм) и криостатных (50 мкм) срезов; прединкубация в растворах, блокирующих эндогенную пероксидазную активность и неспецифическое связывание антител; обработка срезов в растворе первичных антител (4°C, 24 ч); обработка вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре и постановка иммунопероксидазной реакции. В качестве отрицательного контроля использовали препараты без первичных антител. В работе использованы первичные поликлональные кроличьи антитела против ОБМ (Thermo Scientific, RB-1460-A, США, 1 : 200) и моноклональные мышиные антитела против субстанции P (Abcam, ab14184, США, 1 : 2000), GFAP (Vector Laboratories, G805, США, 1 : 500). Вторичные антитела, меченные пероксидазой хрена (Vector Laboratories, PI-1000 (anti-rabbit), PI-2000 (anti-mouse), 1 : 200), использовались в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Для проведения иммунопероксидазной реакции использовали хромоген (Thermo Scientific, TL-060-QHD, США). После окрашивания срезы тщательно отмывали в дистиллированной воде или 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2), обезвоживали и заключали в монтирующую среду (Dako, CS705, США). Полученные препараты просматривали в световом микроскопе Axio Imager Z2 (Carl Zeiss, Германия) и фотографировали при помощи цифрового фотоаппарата AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия). После фотографирования все фотографии сохранялись в формате TIF и имели размер 1088 × × 813 пикселей.

Количественная обработка данных. Оценку площади иммуногистохимического окрашивания основного белка миелина в дистальном сегменте поврежденного седалищного нерва, а также субстанция Р-позитивных нервных волокон и GFAP-позитивной астроглии поверхностных пластин задних рогов спинного мозга (ипсилатеральная сторона) проводили в каждом пятом серийном срезе с использованием пакета программ ImageJ 1.41 (NIH, США). С помощью плагина IHC Toolbox создавали статистическую модель обнаружения цвета, основанную на визуально выбранных цветных пикселях, выделение цвета используется для выбора и резервирования положительных цветовых пикселей, в то время как пиксели цвета фона исключаются. Все полученные микрофотографии обрабатывали путем вычитания фона с использованием данной статистической модели определения цвета, затем проводилась автоматическая бинаризация и измерение площади окрашивания исследуемых маркеров (данные выражались в процентах относительно общей площади исследуемой области).

Оценку достоверности различий данных полученных с помощью иммуногистохимических методов исследования проводили с использованием Two-way Anova (Bonferroni post test). Все данные были проверены на нормальность распределений с использованием теста Колмогорова–Смирнова. Данные выражали как среднее ± SEM, p < 0.05 было принято как статистически значимое. Все статистические тесты выполнялись с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 4.00.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Морфологическая характеристика седалищного нерва в норме и при нейротравме. Морфологическое состояние седалищного нерва интактных животных без видимых патологий (рис. 1а). Тогда как повреждение периферического нерва вызывает местное воспаление, которое приводит к отеку, повреждению и дезорганизации нервных волокон. В дистальном сегменте отмечалось большое количество новообразованных кровеносных сосудов, инфильтраты моноцитов, нейтрофилов и фибробластов, а также многочисленные кровоизлияния в области воспаления (рис. 1б, в). Применение ДГК приводит к уменьшению степени развития данных патофизиологических процессов (рис. 1г, д).

Рис. 1.

Морфологическое состояние дистального сегмента седалищного нерва в норме (а), при травматическом повреждении через 7 и 28 дней после операции (б, в) и терапии ДГК через 7 и 28 дней после операции (г, д). Окраска гематоксилин-эозином.

Содержание основного белка миелина как показатель сохранности структуры дистального сегмента поврежденного нерва. Количественный анализ содержания основного белка миелина (ОБМ) в нервной ткани – один из способов оценить степень морфологической и функциональной сохранности поврежденного нерва. Параметры распределения ОБМ, с одной стороны, демонстрируют выраженность демиелинизирующего процесса, а с другой – свидетельствуют об активности механизмов регенерации и ремиелинизации [14]. При проведении иммуногистохимической реакции на препаратах интактного нервного волокна ОБМ-позитивные структуры выявляются глыбками, расположенными в виде колец вокруг нервных волокон; толщина миелиновой оболочки прямо пропорциональна диаметру погруженного в нее нервного волокна. Основной белок миелина ровно контурирует аксоны среднего и крупного калибра, вокруг волокон мелкого диаметра он отсутствует (рис. 2а). При повреждении седалищного нерва, во всех экспериментальных группах, к 7 дню ОБМ создает прерывистый контур вокруг нервных волокон и выявляется не так четко (рис. 2б). К 28 дню основное количество ОБМ-позитивных структур представлено в виде мякотных шаров – глыбчатых скоплений конгломератов фрагментов миелина, беспорядочно расположенных в нервной ткани. В группе «боль» наблюдается практически полная деградация основного белка миелина (рис. 2в), при применении препарата докозагексаеновой кислоты деградация ОБМ-позитивных структур менее выражена (рис. 2д, е). Количественная оценка данного процесса демонстрирует, что на 7-е и 28-е сут в группе “боль” площадь окрашивания ОБМ-позитивных структур на срезах дистального сегмента седалищного нерва снижается (36.9 ± 1.4% и 8.3 ± 1.1% соответственно), по сравнению с интактными животными (53.2 ± 1.4%). В сходных точках наблюдения в группе “боль + ДГК” площадь окрашивания ОБМ-позитивных структур уменьшается (29.9 ± ± 2.5% и 26.4 ± 3.7% соответственно) (рис. 2г).

Рис. 2.

Основной белок миелина в дистальном сегменте седалищного нерва при травматическом повреждении. Группа “контроль” (а), группа “боль” через 7 и 28 дней после операции (б, в) и группа “боль + ДГК” через 7 и 28 дней после операции (д, е); динамика активности основного белка миелина (г). * Достоверные различия с группой “контроль” (при р < 0.05). ⁺ Достоверные различия между группой “боль” и “боль + ДГК” (при р < 0.05). ^# Достоверные различия в группе “боль” на 7 и 28 день после операции.

Активность SР-ергических нервных волокон в задних рогах спинного мозга после перевязки седалищного нерва и терапии ДГК. Субстанция Р (SP) в качестве медиатора сосуществует в более 90% терминалей высокопороговых сенсорных волокон, содержащих глутамат [15]. Терминали, содержащие SP, локализуются, преимущественно, в желатинозной субстанции задних рогов спинного мозга на нейронах, организующих “воротный” механизм болевого контроля [16]. На препаратах спинного мозга животных всех экспериментальных групп в поверхностных пластинах задних рогов наблюдается скопление плотно переплетающихся SР-позитивных волокон (рис. 3). В группе “боль” к 7 дню после операции в волокнах задних рогов спинного мозга наблюдается снижение (22.7 ± 0.9%) экспрессии SР, однако к 28 дню этот показатель увеличивается (43.4 ± 1.2%) по сравнению с интактными животными (33.5 ± 1.3%) (рис. 3б–г). В сходных точках наблюдения у животных группы “боль + ДГК” в поверхностных пластинах задних рогов спинного мозга площадь окрашивания субстанция Р-позитивных волокон (25.6 ± 1.1% (7 день); 38.45 ± 1.4% (28 день)) более приближено к уровню интактного контроля, что указывает на выраженное анальгетическое действие препарата (рис. 3г–е).

Рис. 3.

Субстанция P-позитивные нервные волокна в поверхностных пластинах задних рогов спинного мозга при развитии нейропатической боли. Группа “контроль” (а), группа “боль” через 7 и 28 дней после операции (б, в) и группа “боль + ДГК” через 7 и 28 дней после операции (д, е); динамика активности SP-позитивных нервных волокон (г). *Достоверные различия с группой “контроль” (при р < 0.05). ⁺ Достоверные различия между группой “боль” и “боль + ДГК” (при р < 0.05). ^# Достоверные различия в группе “боль” на 7 и 28 день после операции. ^& Достоверные различия в группе “боль + ДГК” на 7 и 28 день после операции.

Реакция астроцитов спинного мозга на травму седалищного нерва и терапию ДГК. Типичной реакцией астроцитов на повреждение (травмы, ишемические и геморрагические инсульты) является астроглиоз, морфо-химическим проявлением которого принято считать увеличение основного белка промежуточных филаментов – глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) [17]. Активация астроцитов сопровождается экспрессией ряда нейро- и иммуномодулирующих веществ, действие которых на окружающие нервные клетки приводит к сенсибилизации (или десенситизации) последних, сдвигам ионного гомеостаза в их волокнах и изменению метаболических и нейротрансмиттерных свойств [18]. Астроциты в спинном мозге интактных животных распределены достаточно плотно, располагаясь как в пределах серого вещества, так и в спинномозговых канатиках. В поверхностных пластинах заднего рога отмечается максимальная площадь окрашивания астроглии – здесь она занимает от 30 до 38% от общей площади исследуемой области (рис. 4а). На 7 день после перевязки седалищного нерва в группе “боль” площадь окрашивания GFAP-позитивных астроцитов в поверхностных пластинах спинного мозга уменьшается (28.3 ± 0.7%), к 28 дню данный показатель увеличивается (49.9 ± 1.5%) по сравнению с интактными животными (33.8 ± ± 1.6%) (рис. 4б–г). В группе “боль + ДГК” на всех сроках наблюдения площадь GFAP-позитивных астроцитов в поверхностных пластинах спинного мозга не отличается от контрольной группы (рис. 4г–е).

Рис. 4.

GFAP-позитивная астроглия в поверхностных пластинах задних рогов спинного мозга при развитии нейропатической боли. Группа “контроль” (а), группа “боль” через 7 и 28 дней после операции (б, в) и группа “боль + ДГК” через 7 и 28 дней после операции (д, е); динамика активности астроглии (г). *Достоверные различия с группой “контроль” (при р < 0.05). ⁺ Достоверные различия между группой “боль” и “боль + ДГК” (при р < 0.05). ^# Достоверные различия в группе “боль” на 7 и 28 день после операции. ^& Достоверные различия в группе “боль + ДГК” на 7 и 28 день после операции.

ОБСУЖДЕНИЕ

В наших предыдущих исследованиях установлено, что лигирование седалищного нерва у крыс сопровождается развитием холодовой аллодинии, формированием асимметрии в распределении веса и дистрофическими изменениями в тканях денервированной конечности. Применение ДГК снижает интенсивность и продолжительность развития нейрогенной боли, приводит к более ранней стабилизации распределения веса, предотвращает развитие холодовой аллодинии и дистрофических изменений в ткани денервированной конечности [10]. Повреждение седалищного нерва сопровождается патохимическими, патофизиологическими и патоморфологическими процессами в нервных волокнах и спинном мозге. В дистальном сегменте седалищного нерва травмированных животных наблюдается увеличение диаметра нервных волокон, их дезорганизация, воспалительная клеточная инфильтрация и деградация миелин-позитивных клеточных структур. Активация астроглии и увеличение активности нейрокининовой трансмиссии в задних рогах спинного мозга регистрируется в поздний период развития болевого синдрома.

Высвобождение субстанции Р из терминалей первичных афферентов связано с возникновением и поддержанием ощущения боли. В нашем исследовании показано, что активность нейрокининовой системы в задних рогах спинного мозга при развитии нейропатического болевого синдрома имеет неравномерную динамику. При повреждении нерва на ранних сроках у животных группы “боль” наблюдается снижение экспрессии субстанции Р в волокнах задних рогов спинного мозга, а повышение данного показателя происходит к 28 дню после операции. Подобная ситуация зарегистрирована другими авторами на иных экспериментальных моделях. Так, в ранний послеоперационный период после частичного повреждения седалищного нерва [19], а также на 8 день после наложения лигатуры на подглазничный нерв [11], авторы наблюдали снижение экспрессии SР в соответствующих ноцицептивных центрах. Такое явление можно объяснять разными механизмами. Во-первых, нейрокининовая система работает в сенсорных центрах по циклическому принципу – при гиперактивности SP-ергических механизмов наблюдается интернализация соответствующих нейрокининовых рецепторов с последующим ослаблением высвобождения медиатора из афферентных волокон [20]. Во-вторых, активация апоптоза в сенсорных нейронах ганглиев [10] может сопровождаться уменьшением запаса медиатора в их центральных терминалях. Последующее нарастание активности нейрокининовой сигнализации связано с развитием механизмов периферической сенситизации, и в первую очередь – активацией неуправляемого роста аксонов в месте повреждения, выработки ими нейротрофических факторов и формирования невром [21].

В аспекте проведенного нами исследования можно заметить, что активация нейрокининовой нейротрансмиссии динамически согласована с активацией астроцитарной глии в задних рогах спинного мозга. Насколько взаимомодулирующим или однонаправленным, прямым или опосредованным является взаимодействие SP-ергической системы и астроцитов спинного мозга, еще предстоит выяснить. Однако астроциты имеют на своей поверхности нейрокининовые рецепторы и получают прямые проекции от SP-ергических афферентов [22] и, соответственно, могут быть активированы афферентным нейрокининовым сигналом. В свою очередь, высвобождение SP из аксонов и активность нейрокининовой системы при боли может находиться под влиянием астроцитов – фармакологическое ингибирование их активности сопровождается снижением болевого синдрома за счет угнетения синтеза и высвобождения SP [23]. В нашей работе не удалось зафиксировать прямую связь астроцитарной и нейрокининовой активности в задних рогах спинного мозга с установленной ранее выраженностью болевого поведения экспериментальных животных (по тестам на холодовую аллодинию и инвалидности) [10]. Активация к 28 дню обоих маркеров может быть причастна к развитию другого патологического симптома – тактильной аллодинии. Так как другими исследователями было показано, что фармакологическая регуляция активности астроцитарной глии, а также угнетение SP-ергической нейротрансмиссии способно обеспечивать антиболевой эффект именно в отношении тактильных болевых расстройств [24].

Нейропротекторное действие ДГК в дистальном сегменте поврежденного седалищного нерва, очевидно, ориентировано на поддержание морфологического и функционального гомеостаза Шванновских клеток. Большинство авторов объясняют данный эффект ДГК реализацией системного антивоспалительного и антиоксидантного механизмов действия препарата, осуществляемых непосредственно в области повреждения периферического нерва [8, 25].

Использование ДГК в нашем эксперименте стабилизирует активность исследуемых медиаторных систем спинного мозга на всех сроках наблюдения. Ранее в спектре эффектов ДГК выявлены также специфические нейротрансмиттерные взаимодействия, обеспечивающие подавление болевого сигнала – активация эндогенных опиоидных [26] и неопиоидных [27] механизмов анальгезии. Важными факторами, обеспечивающими стабилизацию SP-ергического афферентного потока у животных, получающих ДГК, можно считать также периферические эффекты препарата, зафиксированные в настоящем исследовании – уменьшение демиелинизации седалищного нерва, ингибирование астроцитоза в задних рогах спинного мозга, а также – снижение уровня апоптоза в нейронах спинальных ганглиев [10]. Ранее установлено, что субстанция Р выступает в качестве медиатора нейрогенного механизма воспаления за счет стимуляции выброса цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, TNF-α) в поврежденных периферических тканях [28]. Докозагексаеновая кислота, в свою очередь, может снижать экспрессию данных провоспалительных цитокинов и хемокинов, путем образования высокоактивного метаболита нейропротектина D1 [29]. В нашей предыдущей работе на культуре клеток астроглии, мы также показали, что добавление ДГК приводит к увеличению активности антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы, что может способствовать снижению уровня развития нейрогенной боли [30].

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект № 17-74-20006.