Нейрохимия, 2020, T. 37, № 3, стр. 220-227

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на 72 взрослых самцах крыс линии Вистар массой около 230 г из ЦКП “Биоколлекция ИФ РАН”. При проведении экспериментов соблюдались требования Директивы 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета ЕС по охране животных, используемых в научных целях. Крыс разделили на контрольную (“Контроль”, n = 6) и 2 экспериментальные группы по 18 животных: “ВБ” – крысы, перенесшие стресс, в классической экспериментальной модели эндогенной депрессии – парадигме “выученная беспомощность”; “гпВБ” – животные, которые перед аверсивным стрессированием подвергались прекондиционированию умеренной гипоксией.

Для выработки депрессивноподобного состояния “выученной беспомощности” (ВБ) крыс подвергали неизбегаемому стрессу – стимулировали 60 асинхронными ударами электрическим током (1 мА, 60 Гц, 15 с) в небольшой клетке в течение часа [7]. В результате у животных значительно снижалась двигательная и исследовательская активность, повышался уровень тревожности, развивалась агедония, устойчиво возрастал уровень кортикостерона в крови и нарушалось глюкокортикоидное торможение гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы (ГАС) по механизму отрицательной обратной связи [5, 6].

Гипоксическое прекондиционирование осуществляли в декомпрессионной барокамере проточного типа при давлении 360 мм рт. ст. Животных подвергали 3 сеансам умеренной гипобарической гипоксии (10% O₂) по 2 ч с интервалом 24 ч [8], последний сеанс проводили за 24 ч до патогенного стресса в модели ВБ. В этих условиях прекондиционированные крысы успешно адаптировались и экспериментальное депрессивное состояние у них не развивалось, поведенческие и гормональные показатели группы “гпВБ” не отличались от контрольных [5, 6]. Интактных животных из контрольной группы и животных из группы “ВБ” перед стрессированием трижды помещали в барокамеру на 2 часа, не создавая гипоксии.

Спустя 1, 5 и 10 суток после стрессирования (ранний, промежуточный и отсроченный постстрессовый период, соответственно) по 6 крыс из каждой экспериментальной группы декапитировали, затем, после извлечения и фиксации мозга, стандартных процедур обезвоживания и заливки в парафиновую среду, изготавливали срезы во фронтальной плоскости толщиной 7 мкм около –2.8 от брегмы для гиппокампа и неокортекса, и –1.8 для гипоталамуса. Для иммуногистохимической оценки содержания глюкокортикоидных (GR) и минералокортикоидных (MR) рецепторов в нейронах срезы инкубировали с поликлональными антителами к GR или MR (Santa Cruz, USA) в разведении 1 : 100, далее обрабатывали с использованием наборов для детекции фирмы Vector Labs, USA, и проводили оценку иммунореактивности на основании компьютерного анализа микроизображений паравентрикулярного ядра гипоталамуса (крупно- и мелкоклеточной частей), поля СА1 и зубчатой извилины гиппокампа, I–II и V слоев неокортекса – областей мозга, играющих ключевую роль в регуляции стрессорных реакций и обеспечении адаптивного ответа. Используя программу Мастер Морфология (“ВидеоТест”, СПб), в поле зрения производили подсчет числа иммунопозитивных клеток, с их автоматическим разделением на слабо- и интенсивно-иммунопозитивные по величине оптической плотности в условных единицах по сравнению с фоном. Для каждого животного анализировали 2–3 гистопрепарата, использовали усредненные значения по каждой области мозга у данного животного. Эти данные обрабатывали, вычисляя среднюю арифметическую величину и стандартную ошибку среднего в исследуемых подгруппах животных (n = 6 для каждой точки), сравнивали средние значения выборок. Статистическую обработку проводили средствами однофакторного дисперсионного анализа ANOVA (Statistica 7.0), с апостериорным сравнением методом Фишера, если распределение выборки являлось нормальным, а дисперсии групп равны. В противном случае использовали непараметрический тест ANOVA Kruskal–Wallis. Различия между группами считали достоверными и при p ≤ 0.05. Результаты по экспериментальным подгруппам выражены в процентах от среднего значения контрольной группы, принятого за 100%, и представлены в виде средней арифметической величины количества иммунопозитивных клеток, выраженной в процентах от контроля, ± стандартная ошибка среднего, выраженная в %.

РЕЗУЛЬТАТЫ

У контрольных животных выявлен достаточно высокий уровень иммунореактивности к GR во всех исследованных областях мозга, с наибольшими значениями интенсивности экспрессии в гиппокампе.

В паравентрикулярном ядре (ПВЯ) гипоталамуса в течение формирования экспериментальной депрессии общее число иммунопозитивных к GR нейронов достоверно не изменялось (рис. 1а и 1в, черные столбцы). Тем не менее, количество клеток, интенсивно иммунореактивных к GR, выражено (1/2–1/4 от контроля) и устойчиво (до 10 дней) снижалось как в мелко- (F(3.20) = 4.25, p = 0.018), так и в крупноклеточной (F(3.22) = = 3.481, p = 0.033) части ПВЯ (рис. 1б, 1г, 1е). В гипоталамусе крыс из группы “гпВБ” 3 сеанса умеренной гипобарической гипоксии частично нивелировали постстрессорное ослабление экспрессии GR и вызывали ее ап-регуляцию в отсроченный постстрессовый период. Первоначальная редукция числа интенсивно GR-позитивных нейронов в ранний период сменялась постепенным восстановлением до контрольных (в крупноклеточной части ПВЯ) и даже превосходящих контрольные (в мелкоклеточной) значений к 10 суткам (рис. 1, белые столбцы).

Рис. 1.

Модификации иммунореактивности к GR в крупноклеточной (а, б) и мелкоклеточной (в, г) частях ПВЯ гипоталамуса крыс в процессе формирования и коррекции экспериментальной депрессии. д, е – микрофотографии (20×), иллюстрирующие GR-иммунореактивность в ПВЯ контрольных (д) и ВБ (е) животных через 1 сут после стресса. По оси абсцисс – дни после неизбегаемого стресса; по оси ординат – (а, в) общее число иммунореактивных клеток или (б, г) количество интенсивно иммунопозитивных к GR нейронов в % от значений контрольной группы, принятой за 100%. Серые столбцы – интактный контроль; черные столбцы – крысы с экспериментальной депрессией после неизбегаемого ВБ стресса; белые столбцы – прекондиционированные перед стрессированием гпВБ животные, у которых патология не развивалась. * Различия достоверны по отношению к контролю, # достоверные различия относительно группы “ВБ”, р ≤ 0.05.

В экстрагипоталамических областях мозга непрекондиционированных животных воздействие неизбегаемого стресса приводило к заметной редукции GR-иммунореактивности (рис. 2). В поле СА1 гиппокампа через 24 ч оставалось около трети от числа иммунореактивных нейронов с интенсивной окраской по сравнению с контролем, к 10-му постстрессорному дню – около половины (рис. 2а). Наиболее резкие и выраженные изменения экспрессии GR после стрессирования были отмечены в зубчатой извилине (рис. 2б), где практически не выявлялось интенсивно иммунореактивных нейронов (F(3,21) = 4.346, p = 0.016), также в этой области, единственной среди исследованных, существенно и устойчиво понижалась не только интенсивность экспрессии, но и общее число иммунопозитивных клеток (до 18% от контроля). Снижение иммунореактивности наблюдалось и в неокортексе – количество интенсивно-окрашенных клеток здесь достигало минимума к 10 суткам (45% во II слое и 30% в V слое).

Рис. 2.

Постстрессорные изменения числа интенсивно GR-иммунореактивных клеток в мозге непрекондиционированных и прекондиционированных животных. а – область СА1 гиппокампа; б – зубчатая извилина; в – I–II слои неокортекса; г – V слой неокортекса. Обозначения как на рис. 1.

Прекондиционированные умеренной гипоксией животные демонстрировали значительную модификацию постстрессорного паттерна экспрессии GR. В гиппокампе крыс группы “гпВБ” число иммунореактивных клеток резко возрастало, максимально (из всех исследованных структур) – в зубчатой извилине, где увеличение иммунореактивности происходило в основном за счет значительного роста количества интенсивно иммунопозитивных нейронов (F(3,20) = 24.434, p = 0.00006), 8-кратного в 1 день и устойчивого на всем периоде наблюдения (рис. 2б). Пик роста имунореактивности в СА1 также приходился на ранние сроки, достигая 227% (рис. 2а). В неокортексе животных, перенесших трехкратное гипоксическое воздействие, иммунореактивность к GR после стресса не снижалась, как у непрекондиционированных, а оставалась неизменной относительно контрольного уровня (рис. 2г), либо незначительно возрастала на ранних сроках (рис. 2в).

Области неокортекса и гиппокампа контрольных животных демонстрировали умеренное содержание MR-иммунореактивных нейронов, в ПВЯ гипоталамуса MR-содержащие клетки практически не обнаруживались.

В гиппокампе крыс, стрессированных в парадигме ВБ, достоверных изменений в общем числе MR-содержащих нейронов (данные не представлены) и количестве интенсивно иммунопозитивных клеток в области СА1 и зубчатой извилине не обнаружено (рис. 3а и 3б). На раннем этапе формирования экспериментальной депрессии I–II слои неокортекса животных реагировали увеличением числа интенсивно иммунопозитивных к MR нейронов, затем выявлено постепенное снижение, и к 10 суткам наблюдалась значительная редукция их числа относительно контрольной группы (рис. 3в). Нейроны V слоя неокортекса в ответ на стресс продемонстрировали менее выраженные изменения со сходным временным паттерном (рис. 3г).

Рис. 3.

Влияние неизбегаемого стресса и гипоксического прекондиционирования на количество нейронов интенсивно иммунопозитивных к MR в области СА1 (а) и зубчатой извилине (б) гиппокампа, в I–II (в) и V (г) слоях неокортекса. По оси абсцисс – дни после стресса; по оси ординат – число интенсивно MR-иммунореактивных клеток в % от контроля, принятого за 100%. Обозначения как на рис. 1.

По суммарному количеству MR-иммунореактивных клеток у прекондиционированных перед стрессированием в парадигме ВБ животных достоверных отличий относительно непрекондиционированных или контрольных не наблюдалось. По числу интенсивно иммунореакционноспособных нейронов в группе “гпВБ” отмечено повышение в области СА1 гиппокампа на 5 день после стресса, а в зубчатой извилине на 10-й, в этот же период их число достоверно больше чем в группе “ВБ”. В верхних и нижних слоях неокортекса через 24 ч выявлено снижение количества интенсивно экспрессирующих MR нейронов, к 5 суткам снижение сменилось ростом (246% – I–II слои, 200% – V слой), и в отсроченный постстрессовый период во II слое сравнялось с контролем, а в V слое оказалось вновь ниже контрольного уровня (45%, p = = 0.027), как и в первые сутки (рис. 3в и 3г). Таким образом, интенсивность экспрессии МR нейронами неокортекса гпВБ крыс в первые сутки значительно ниже, а на пятые сутки наоборот достоверно выше, чем у ВБ животных.

ОБСУЖДЕНИЕ

В целом можно заключить, что во всех исследованных областях мозга крыс стресс ВБ вызывал редукцию числа интенсивно иммунопозитивных к глюкокортикоидным рецепторам клеток. Важно отметить, что к интенсивно иммуноокрашенным клеткам, прежде всего, относятся нейроны с ядерной локализацией белка, при том, что общее число GR-содержащих нейронов могло оставаться неизменным, как, например, в кортиколиберин-продуцирующих центрах ПВЯ гипоталамуса. В этом случае снижение интенсивности иммунореактивности может объясняться нарушением связывания глюкокортикоидов с рецепторами и уменьшением транслокации GR из цитоплазмы в ядро, а также усилением их взаимодействия с транскрипционными факторами, что, в свою очередь, негативно влияет на транскрипцию GR-зависимых генов, чем, вероятно, обусловлено ослабление отрицательной обратной связи ГАС, характерное для депрессивной патологии. Вместе с этим в мозге запускаются процессы образования провоспалительных цитокинов, которые препятствуют транслокации комплекса кортизол-глюкокортикоидный рецептор в ядро, а вновь образованные комплексы создают конкуренцию для связывания GR с ДНК [9, 10].

Изменения уровня экспрессии GR, как центрального элемента регуляции ГАС, рассматривались в качестве вероятной причины глюкокортикоидной резистентности при психических расстройствах многими исследователями. В фибробластах пациентов с тяжелыми формами депрессий достоверного снижения GR выявлено не было [11], отдельные постмортальные исследования нескольких областей мозга in situ гибридизацией и ПЦР позволили зафиксировать существенные изменения уровня тотальной мРНК GR лишь в III–VI слоях фронтальной коры [12–14]. Что не позволяет исключить радикального снижения экспрессии этого рецептора в определенных отделах мозга, нарушений на уровне трансляции белка при неизменном уровне тотальной мРНК, а также образования функционально различающихся изоформ этого белка за счет альтернативного сплайсинга мРНК и использования альтернативных стартов трансляции, в том числе изоформы GRβ, которая является доминантным ингибитором нормальной формы GRα [15–17]. Еще одним механизмом, вносящим вклад в формирование резистентности к глюкокортикоидам, могут быть посттрансляционные модификации, в частности, фосфорилирование N-концевого домена белка-рецептора, которое влияет не только на взаимодействия с компонентами транскрипционной машины и кофакторами, но, возможно, и с исследовательскими антителами [18]. В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что при депрессиях имеет место существенная недостаточность глюкокортикоидных рецепторов, предположительно, преимущественно функциональная [9].

Активация ГАС приводит к увеличению содержания глюкокортикоидов в высших отделах мозга, из которых наиболее чувствительным к стрессу, как известно, является гиппокамп, в котором плотность глюкокортикоидных рецепторов максимальна [19]. Интересно отметить, что единственной из исследованных в настоящей работе областей мозга, в которой, наряду с редукцией количества интенсивно иммунореактивных к GR клеток, было выявлено снижение общего числа GR-содержащих нейронов, являлась зубчатая извилина гиппокампа. Таким образом, мы можем сделать вывод о том, что в процессе формирования депрессивной патологии в этой структуре наблюдалось достоверное снижение содержания глюкокортикоидных рецепторов. Поскольку тормозное действие гормонов надпочечников на секрецию кортиколиберина осуществляется на уровне регуляторных областей головного мозга, и прежде всего именно гиппокампа, можно предположить, что обнаруженная редукция глюкокортикоидных рецепторов в зубчатой извилине может вносить существенный вклад в формирование глюкокортикоидной резистентности при моделировании депрессии.

Обратное влияние глюкокортикоидов на биосинтез нейрогормонов гипоталамусом опосредуется не только низкоаффинными глюкокортикоидными, но и намного более чувствительными минералокортикоидными рецепторами, которые экспрессируются преимущественно в нейронах гиппокампа и поддерживают как базовую, так и стрессиндуцированную активность ГАС [20, 21], стимулируя нейрональную активность в гиппокампе [22]. MR считаются главными для первичной, быстрой реакции на кортикостерон [23], предполагают, что их основная функция связана с адаптацией в условиях относительной нормы [24]. Это косвенно подтверждается продемонстрированным в настоящей работе отсутствием существенных изменений их уровня при формировании депрессивной патологии, но при этом условный баланс GR к MR оказывается значительно сдвинут в сторону MR (особенно в зубчатой извилине гиппокампа). Но, несмотря на преобладание MR при ВБ, они не способны связывать гормон в том диапазоне концентраций, который характерен для депрессивных состояний, и ключом к нарушениям в работе ГАС, очевидно, становится нехватка GR.

Считается, что повышенные уровни глюкокортикоидов способны индуцировать изменения в GR и MR гиппокампа, проявляющиеся в функциональной недостаточности, повышении соотношения MR : GR и даже редукции GR [2–4]. Соответственно, с течением времени ингибиторная активность гиппокампа ослабевает, что приводит к нарушению обратной связи и гиперсекреции кортизола. Данное исследование показало, что значительная недостаточность GR мозга выявляется с первых дней развития депрессивного состояния и не является следствием длительного воздействия высоких доз глюкокортикоидов. Скорее, можно предположить обратное – недостаточность GR при ВБ способствует гиперсекреции гормона.

Антидепрессивные эффекты гипоксического прекондиционирования сопровождались резким и устойчивым повышением GR-иммунореактивности в гиппокампе (особенно выраженном в зубчатой извилине) крыс, подвергнутых ВБ стрессу, и при этом наблюдалась их ядерная локализация. Очевидно, что в данном случае GR является активным транскрипционным фактором для генов-мишеней, имеющих в своем промоторе GRE последовательности. Так, прекондиционирование, вероятно, запускает синтез необходимых для включения обратной связи и связывания избыточного при ВБ гормона GR. Таким образом, предварительное воздействие умеренной гипоксией не только предотвращало редукцию GR в ответ на ВБ стресс, но и способствовало постстрессовой оверэкспрессии GR в образованиях мозга, вовлекаемых в нейроэндокринную регуляцию стрессорных реакций. Ранее показано, что длительное введение антидепрессантов, сходным образом может усилить механизм обратной отрицательной связи путем стимуляции экспрессии кортикостероидных рецепторов [25].

Интересно, что если проследить за изменением условного соотношения глюко- и минералокортикоидных рецепторов гиппокампа при развитии и предотвращении депрессивной патологии ВБ, то при ВБ за счет падения числа GR преобладающими оказываются MR, а в результате применения умеренной гипоксии в чувствительной к повреждениям области СА1 наступает условное GR/MR равновесие, в то время как в зубчатой извилине отмечается значительный и устойчивый перевес в пользу GR. Что, вероятно, связано с медленными эффектами глюкокортикоидов, сводящимися к подавлению первичного стрессорного ответа и предотвращению сверхактивации ГАС. В этом отношении, глюкокортикоидные гормоны – это компонент восстановительной фазы, подготавливающей организм к последующим событиям [26].

Таким образом, обнаружено, что при депрессивных состояниях у крыс резко сокращается число глюкокортикоидных рецепторов в гиппокампе, и, вероятно, снижается их функциональная активность в ГАС-регулирующих областях мозга, у прекондиционированных крыс, не развивающих депрессию, эти показатели, напротив, даже возрастают. Можно предположить, что недостаточность глюкортикоидных рецепторов и дисбаланс GR/MR гиппокампа являются одним из молекулярных механизмов дисфункции системы глюкокортикоидной регуляции при стрессиндуцированных психопатологиях, в то время как активация экспрессии рецепторов после стресса вносит вклад в проявление антидепрессивных эффектов умеренной интервальной гипоксии. Полученные данные расширяют современные представления об эндокринных механизмах формирования и предотвращения депрессивных патологий и повышают трансляционный потенциал умеренной гипоксии в качестве немедикаментозного способа их коррекции.