Нейрохимия, 2020, T. 37, № 3, стр. 257-262

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Паркинсона – хроническое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы, одной из причин которого является дисфункция гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) с нарушением структуры плотных контактов и дизрегуляцией белков-транспортеров, приводящая к накоплению нейротоксинов в головном мозге [1].

Гликопротеин-P (Pgp, ABCB1-белок) − один из переносчиков, локализованный в эндотелиоцитах ГЭБ, представляющий собой эффлюксный АТФ-зависимый трансмембранный белок, препятствующий проникновению из крови в головной мозг большого числа эндогенных и экзогенных веществ различной химической структуры, в том числе нейротоксинов [2, 3].

Ряд исследований продемонстрировал угнетение функционирования Pgp в ГЭБ и снижение его протекторной функции в качестве одного из патогенетических звеньев болезни Паркинсона [4–6]. Можно предположить, что индукция активности Pgp в ГЭБ позволит снизить проницаемость нейротоксинов-субстратов данного белка-транспортера в головной мозг и, соответственно, замедлить или предотвратить повреждение нейронов черной субстанции.

Целью исследования была оценка перспективы индукции белка-транспортера Pgp в ГЭБ среднего мозга крыс для профилактики развития паркинсонического синдрома, вызванного введением нейротоксина–ротенона.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 48 крысах-самцах Вистар массой 280–320 г в соответствии с правилами лабораторной практики (приказ МЗ РФ № 199н от 1 апреля 2016 г.).

Протокол исследования был рассмотрен и утвержден на заседании Комиссии по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных № 11 от 29.01.2018 г.

Все животные были разделены на 2 группы. Первая группа включала животных, у которых в среднем мозге и стриатуме определяли концентрацию дофамина, вторая группа представлена крысами, у которых оценивали количество Pgp в среднем мозге.

Каждая группа была разделена следующим образом:

1) Контрольные животные (n = 6), которым подкожно вводили масло подсолнечное в дозе 1 мл/кг курсом 28 дней, которое фильтровали и стерилизовали через фильтрующую насадку из ацетата целлюлозы с префильтром с диаметром пор 0.2 мкм (“Corning”, США) и подогревали до температуры 35°С. Стерильное подсолнечное масло использовали также для приготовления масляного раствора ротенона.

2) Животные (n = 6), которым внутрижелудочно вводили суспензию рифампицина (“Белмедпрепараты”, Республика Беларусь) в дозе 20 мг/кг в крахмальном клейстере дважды в день в течение 14 сут [7] для индукции функционирования Pgp в ГЭБ.

3) Животные (контроль патологии, n = 9), которым подкожно вводили масляный раствор (содержащий 2% диметилсульфоксида) ротенона (“Sigma”, США) в дозе 2.5 мг/кг 1 раз в день в течение 28 дней для моделирования паркинсонического синдрома [8, 9].

4) Животные (n = 8), которым внутрижелудочно вводили суспензию рифампицина в дозе 20 мг/кг в крахмальном клейстере дважды в день в течение 7 дней, а затем в течение 28 дней – ротенон подкожно в дозе 2.5 мг/кг один раз в сутки совместно с внутрижелудочным введением рифампицина в дозе 20 мг/кг два раза в день.

Летальность при введении ротенона (в 3-й и 4-й сериях эксперимента) составила 29.4%, поэтому в итоговое исследование в каждую группу было включено по 6 животных из числа выживших.

У животных всех серий оценивали основные (наличие гипо-, бради- и олигокинезии, постуральная нестабильность, неустойчивая походка) и дополнительные (ригидность мышц, тремор покоя, нарушение равновесия) признаки паркинсонизма по трехбальной шкале, где 1 балл соответствовал низкой степени выраженности признака, 2 балла – средней степени, 3 балла – высокой степени, после чего рассчитывали суммарную выраженность признаков паркинсонизма [10].

Крыс выводили из эксперимента декапитацией под внутривенным золетиловым наркозом в дозе 30 мг/кг массы (“Золетил 100”, “Virbac C.A.”, Франция).

У животных первой группы методом иммуноферментного анализа (ELISA kit “Cloud-Clone Corp”, Китай) определяли содержание дофамина в среднем мозге и стриатуме. Для этого образцы тканей гомогенизировали на гомогенизаторе DIAX 900 (“Heidolph”, Германия) при 26 000 об./мин в фосфатном буфере (pH 7.2) на холоде в соотношении 1 : 10 в течение 1 мин, затем центрифугировали при 1750 g 10 мин. Анализировали надосадочный слой. Количество дофамина рассчитывали в пересчете на массу ткани, взятую для исследования.

У крыс второй группы методом иммуноферментного анализа (ELISA kit “BlueGene”, Китай) определяли количество Pgp в среднем мозге. Образцы тканей гомогенизировали на гомогенизаторе DIAX 900 при 26 000 об./мин в фосфатном буфере (pH 7.2) на холоде в соотношении 1 : 1 в течение 1 мин, затем подвергали трехкратному замораживанию–размораживанию при –20°С для разрушения цитоплазматических мембран, а затем центрифугировали при 1500 g 15 мин. Анализировали надосадочный слой. Количество транспортера рассчитывали в пересчете на общую массу белка, которую определяли по методу Брэдфорда (“Themofisher” kit, Германия).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы “Statsoft Statistica 7.0 (США)". Характер распределения данных определяли по критерию Шапиро–Уилка. При нормальном распределении статистическую значимость различий оценивали с помощью теста ANOVA, попарные сравнения выполняли с помощью критерия Тьюки. При распределении данных, отличном от нормального, различия между сериями оценивали с помощью критерия Крускала–Уоллиса. При уровне значимости менее 0.05 проводили парное сравнение параметров с помощью критерия Манна–Уитни с поправкой Бонферонни. Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартное отклонение при нормальном распределении данных или медианы, нижнего и верхнего квартилей при распределении данных, отличном от нормального.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании паркинсонический синдром моделировали подкожным ведением ротенона. Ротенон является липофильным пестицидом из семейства изофлавоноидов, систематическое введение которого вызывает подавление активности митохондриального комплекса I. Данные биохимические изменения приводят к избирательной дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатума с последующим ограничением дофаминергической нейротрансмиссии в головном мозге и нарушениям двигательных функций, характерным для болезни Паркинсона [11].

Введение ротенона в дозе 2.5 мг/кг 1 раз в день в течение 28 сут приводило к развитию типичных признаков паркинсонизма (табл. 1): снижалась двигательная активность, появлялись постуральная нестабильность, неустойчивость походки, ригидность мышц и тремор покоя, нарушалось равновесие. Суммарный балл выраженности признаков паркинсонизма составил 8 (6; 10) и достоверно превышал показатели контрольных животных (p < 0.05) (табл. 1).

Концентрация дофамина в серии введения ротенона в стриатуме и среднем мозге снижалась на 92.8 и 67.2% (p < 0.05) соответственно по сравнению с показателями контроля (рис. 1). В то же время количество Pgp в среднем мозге достоверно не изменялось, что свидетельствует об отсутствии динамики экспрессии данного белка-транспортера при моделировании паркинсонизма введением ротенона (рис. 2).

Рис. 1.

Влияние ротенона и рифампицина на концентрацию дофамина в среднем мозге (среднее и стандартное отклонение). Примечание: к – контроль, рф – рифампицин, рт – ротенон; * достоверные различия с контрольной серией (p < < 0.05); # достоверные различия с показателями животных, получавших ротенон (p < 0.05).

Рис. 2.

Влияние ротенона и рифампицина на концентрацию гликопротеина-Р в среднем мозге (медиана, верхний и нижний квартили). Примечание: к – контроль, рф – рифампицин, рт – ротенон; * достоверные различия с контрольной серией (p < 0.05); # достоверные различия с показателями животных, получавших ротенон (p < 0.05).

Введение классического индуктора Pgp рифампицина в дозе 20 мг/кг в течение 14 суток приводило к увеличению количества белка-транспортера в среднем мозге на 230.2% (p < 0.05) по сравнению с показателями контрольных животных, что свидетельствует о повышении экспрессии Pgp (рис. 2). Признаки паркинсонизма у животных отсутствовали, а концентрация дофамина в среднем мозге и стриатуме достоверно не изменялась по сравнению с контрольными крысами (табл. 1, рис. 1). Таким образом, в данной серии было показано индуцирующее влияние рифампицина на Pgp в ГЭБ.

Предварительное введение рифампицина в дозе 20 мг/кг в течение 7 дней перед введением ротенона, а затем совместно с нейротоксином в течение 28 дней также приводило к повышению количества Pgp в среднем мозге по сравнению с показателями контрольных животных на 135.8% (p < 0.05), а по сравнению со значениями крыс, получавших только ротенон, − на 202.8% (p < 0.05) (рис. 2).

У экспериментальных животных данной серии уменьшалась выраженность признаков паркинсонизма по сравнению с крысами, получавшими только ротенон (табл. 1), суммарный балл выраженности признаков паркинсонизма снизился на 43.7% (p < 0.05) (табл. 1).

Уровень дофамина в стриатуме у животных четвертой серии составлял 8.77 ± 1.64 пг/мг ткани, что в 8.27 раза превосходило аналогичный показатель третьей серии (контроль патологии) (p < 0.05), однако оставался ниже значений нормы в 1.69 раза (p < 0.05) (рис. 1). В среднем мозге введение индуктора Pgp рифампицина совместно с ротеноном приводило к нормализации концентрации дофамина, значения данного показателя достоверно не отличались от показателей контроля (серия 1).

Известно, что ротенон является субстратом Pgp, как и ряд других нейротоксинов [12], т.е. степень его проникновения в головной мозг, а, следовательно, и нейротоксичность зависят от интенсивности эффлюкса данным белком-транспортером. Снижение функционирования Pgp в ГЭБ может привести к аккумуляции в головном мозге нейротоксинов − субстратов белка-транспортера и, как следствие, способствовать развитию нейрогенеративных процессов [13].

Для оценки перспективности индукции Pgp в ГЭБ с целью профилактики развития паркинсонизма животным совместно с ротеноном вводили классический индуктор Pgp − рифампицин. Рифампицин является непрямым индуктором функционирования Pgp, активирующим экспрессию транскрипционного фактора − прегнан-Х-рецептора (PXR) [14, 15]. Поскольку воздействие данного индуктора на синтез транспортера развивается постепенно, введение рифампицина крысам начинали за 7 дней до использования ротенона и продолжали параллельно с ним.

Снижение выраженности признаков паркинсонизма и одновременное повышение уровня дофамина в стриатуме и среднем мозге крыс при совместном введении рифампицина и ротенона по сравнению с животными, получавшими только ротенон, свидетельствует о способности рифампицина замедлять прогрессирование паркинсонизма, обусловленного воздействием нейротоксина. Поскольку в серии совместного применения рифампицина и ротенона количество Pgp в среднем мозге увеличивается, по сравнению с серией изолированного введения ротенона, противопаркинсонический эффект рифампицина, вероятнее всего, обусловлен снижением проникновения субстрата Pgp ротенона в головной мозг.

Способность повышать активность белка-транспортера выявлена у ряда лекарственных средств (дексаметазона, карбамазепина, морфина, рифампицина, фенитоина, ретиноевой кислоты, фенотиазина), однако данные препараты обладают широким спектром фармакологических эффектов, а также нежелательных лекарственных реакций, что препятствует их применению в качестве индукторов Pgp. Таким образом, актуальным является поиск селективного индуктора белка-транспортера в ГЭБ и его исследование в качестве средства для профилактики паркинсонизма нейротоксического генеза, например, у лиц, по роду своей профессиональной деятельности, контактирующих с токсическими веществами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Индукция функционирования белка-транспортера Pgp в ГЭБ может рассматриваться как способ профилактики развития паркинсонического синдрома нейротоксического генеза, однако требуются дальнейшие исследования с применением других нейротоксинов и индукторов Pgp.