Нейрохимия, 2022, T. 39, № 1, стр. 80-88

ВВЕДЕНИЕ

Сахарный диабет (СД) представляет собой серьезную проблему современного общества. Распространенность сахарного диабета во всем мире резко возросла за последние годы и составляет 422 млн человек [1]. Риск заболеваемости СД увеличивается с возрастом [2]. Развивающийся при этом метаболический синдром приводит к полиогранным нарушениям, формирующимися на фоне ожирения, гипертонии, гипергликемии, дислипидемии и хронического окислительного стресса [3–6 и др.]. СД повышает риск сердечно-сосудистых заболеваний, деменции, способствует снижению продолжительности жизни и т.д. [7–9 и др.].

Механизмы, лежащие в основе развития деменции у больных сахарным диабетом, исследованы недостаточно, хотя о связи, например, болезни Альцгеймера (БА) с сахарным диабетом сообщают уже на протяжении нескольких десятилетий. Известно, что сахарный диабет провоцирует развитие микроангиопатий на фоне окислительного стресса и нейровоспалительных процессов [10–12 и др.]. Также при нейродегенеративных процессах нарушается регуляция клеточного цикла, что вместе с окислительным стрессом инициирует патологический каскад реакций в гиппокампе при БА [13–15 и др.].

В условиях СД изменяется экспрессия генов в клетках мозга, что приводит к дисфункции нейронов и глиальных клеток на уровне нарушений передачи сигнала и клеточного цикла, связанных с развитием деменции и болезни Альцгеймера [16]. В процессе старения снижается способность к обучению, хотя молекулярные механизмы, лежащие в основе дефицита памяти, до сих пор не до конца исследованы. Также не до конца определены механизмы, лежащие в основе снижения способности к сохранению ранее выработанных навыков в условиях развития сахарного диабета.

Целью данного исследования явилось выявление возрастных изменений способности к пространственному обучению и сохранности выработанного навыка, а также сравнение экспрессии генов регуляции синаптической пластичности (c-fos, c-jun, Egr-1 и Cyt-c) в гиппокампе у 3-х и 18-месячных крыс в модели стрептозотоцинового диабета.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с директивами Европейского Союза 86/609/ЕЕС по использованию экспериментальных животных и местным законодательством по этике экспериментов на животных. Протоколы для животных были оценены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Южного федерального университета (разрешение № 02/2014, 12 февраля 2014 г.).

Эксперимент проведен на беспородных белых крысах-самцах 3-х и 18-месячного возраста. Крыс делили на группы: 1 – контрольная (оценивали только уровень экспрессии генов), 2 – моделирование пространственного обучения в лабиринте Морриса (ПО), 3 – моделирование стрептозотоцинового диабета, 4 – моделирование стрептозотоцинового диабета и пространственного обучения (диабет + ПО). Количество животных в каждой группе представлено в табл. 1, дизайн эксперимента – в табл. 2.

Экспериментальный диабет вызывали путем однократного введения крысам раствора стрептозотоцина (Sigma) в 0.4 мл цитратного буфера в дозе 50 мг/кг массы тела после 18-часового голодания [17]. На 21 сут после введения стрептозотоцина проводили декапитацию; в крови определяли уровень гликозилированного гемоглобина (HbA1, %) с использованием анализатора DS5 Glycomat (Великобритания).

Изучение пространственного обучения проводили с использованием лабиринта Морриса [18], представляющего круглый бассейн диаметром 100 см, заполненного непрозрачной белой водой (t = 24–25°С) с разведенным сухим молоком. В центре лабиринта располагали платформу из оргстекла площадью 25 см², погруженную на 5 см ниже поверхности воды. Платформа находилась в одном и том же положении в бассейне на всем протяжении эксперимента. Вокруг бассейна помещали два черно-белых рисунка на плотной бумаге (визуальные ориентиры), которые располагали в одинаковом положении вокруг бассейна в течении всего эксперимента. При каждом тестировании животное помещали в лабиринт Морриса из разных положений относительно визуальных ориентиров. Тестирование проводили 3 дня подряд: максимальное нахождение в лабиринте Морриса составляло 120 с. После нахождения платформы животное извлекали из бассейна, вручную обсушивали полотенцем и помещали в отдельную клетку с подогревом. На 24 день после первого тестирования у крыс оценивали сохранность пространственной памяти. Учитывали средние показатели времени трех повторов тестирования в водном лабиринте Морриса на 1-й, 2-й, 3-й и 24-й дни эксперимента (между каждым тестом в день эксперимента было не менее 1.0 ч). Критерием обучения служило снижение времени выхода на платформу относительно показателя в 1-й день тестирования в лабиринте Морриса.

Статистическую обработку результатов исследования пространственного обучения проводили с использованием программы Stаtistiсa 10.0 (Statsoft, США). Проверку на нормальность распределения экспериментальных данных проводили с использованием критерия Колмагорова-Смирнова. Для оценки межгрупповых различий использовали t-критерий Стьюдента. Данные представлены в виде средних значений и стандартных ошибок среднего (M ± SEM). Достоверными считали различия при уровне значимости р < 0.05.

Относительный уровень траскриптов изучаемых генов исследовали с использованием метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) после обратной траскрипции.

Образцы тканей (гиппокампа) крыс забирали через 1 ч после последнего тестирования в лабиринте Морриса, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при –80°C. Количество анализируемых образцов в каждой группе соответствовало количеству животных (табл. 1).

Чтобы избежать деградации, образцы размораживали только один раз. Тотальную РНК из тканей коры и гиппокампа выделяли при помощи набора Aurum Total RNA fatty and fibrous tissue kit (BioRad). Количество и чистоту выделенной РНК оценивали спектрофотометрически на приборе NanoPhotometer (Implen). OD260/280 образцов РНК колебалось от 1.80 до 2.00. Тотальную РНК (0.5 мкг) подвергали обратной транскрипции в кДНК, в объеме смеси 25 мкл. Реакцию обратной транскрипции проводили c использованием реагентов фирмы Евроген (Россия), в соответствии с инструкцией производителя при 40°С в течение 40 мин, после чего инактивировали при 92°С в течение 10 мин. Дизайн прямых и обратных праймеров для проведения ПЦР-РВ проводили в программе Primer3 с последующей проверкой в IDT. Праймеры были синтезированы фирмой Синтол (Россия). Последовательности праймеров приведены в табл. 3. ПЦР-РВ была проведена на амплификаторе CFX-96 фирмы Bio-Rad c использованием готовой реакционной смеси iQ BioRad в объеме 25 мкл, включая по 50 пмоль прямого и обратного праймеров и 1 мкл кДНК. Условия для проведения ПЦР: первичную денатурацию проводили при 95°С 3 мин. Проводили 35 циклов амплификации: 20 с при 95°С, 10 с при 60°С, 20 с при 72°С. Для проверки специфичности после окончания циклов амплификации строили кривую плавления от 65 до 95°С с шагом 0.5°С. В качестве красителя использовали SYBR Green I. Реакцию амплификации для каждого исследуемого гена проводили отдельно в дупликатах. В качестве референсного гена был использован ген HPRT1, кодирующий фермент гипоксантин фосфорибозилтрансферазу 1.

Расчет относительной экспрессии проводили, оценивая величины Ct (Threshold cycle), получаемые в ходе проведения ПЦР-РВ. Все данные представлены в виде относительных единиц (отн. ед.) уровня мРНК изучаемых генов в сравнении с референсным геном (HPRT1), расчет которых проводили по отношению к контрольной группе с использованием метода 2^–ΔΔCt. Статистическую обработку результатов исследования экспрессии генов проводили с помощью программы Statistica 10.0 с использованием критериев Колмогорова–Смирнова и Ливиня, а также с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA. Статистически значимыми считали различия при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животных, у которых уровень HbA1 после моделирования стрептозотоцинового диабета оставался в пределах контрольных значений, исключали из эксперимента: пять крыс 3-месячного возраста и три крысы 18-месячного возраста. Анализ результатов исследования уровня HbA1 показал, что данный показатель после моделирования диабета был значительно выше исходных значений как у 3-месячных, так и, особенно, 18-месячных крыс (p < 0.001) (табл. 4).

В динамике трех дней тестирования в лабиринте Морриса было установлено снижение времени платформы как у 3-месячных, так и 18-месячных животных. Достоверных различий показателей времени выхода на платформу в каждый день тестирования на этапе обучения в группе 3-месячных животных не установлено, как и в группе 18-месячных крыс (табл. 5).

В контрольной группе на 3-й день тестировании в лабиринте Морриса среднее значение времени выхода на платформу у 18-месячных крыс было на 32% (p < 0.05) выше относительно 3-месячных животных, а в модели ПО + диабет_3 – на 21% (0.05 < p < 0.1). Сходная динамика показателей времени выхода на платформу в ходе пространственного обучения в обеих группах (контроль и ПО + диабет_3) объясняется тем, что моделирование диабета во втором случае осуществляли после 3-х дней тестирования в лабиринте Морриса.

В результате проведения оценки сохранности пространственного обучения в лабиринте Морриса установлено, что на 24-й день эксперимента у животных 3-месячного возраста контрольной группы и в модели ПО + диабет_24 время выхода на платформу увеличивалось на 38% (p < 0.05) и 92% (p < 0.05), соответственно. У 18-месячных крыс наблюдали еще более значительное возрастание времени выхода на платформу относительно значений на 3 день эксперимента: в контрольной группе увеличение данного показателя составило 74% (p < 0.01), а в модели ПО + диабет_24 – на 233% (p < 0.0001) (табл. 5). Это подтверждает существующее представление о том, что с возрастом снижается способность к обучению, в частности к пространственному обучению [19].

Анализ экспрессии генов регуляции синаптической пластичности показал, что на 3-й день эксперимента у 3-месячных крыс происходило возрастание уровня экспрессии гена c-fos (рис. 1). Ген c-fos связан с различными сигнальными каскадами, участвующими в процессах пластичности нейронов, роста клеток и митозе. При этом уровень экспрессии данного гена был выше контрольных значений у 3-месячных крыс и на 24-й день эксперимента, а также в модели ПО + диабет_24. У 18-месячных крыс наблюдали сниженные значения относительной экспрессии гена c-fos по сравнению с 3-месячными животными; после моделирования стрепотозотоцинового диабета и, в меньшей степени, в модели ПО + диабет_24 у 18‑месячных животных установлено достоверное уменьшение уровня экспрессии данного гена относительно контрольных показателей у животных этого возраста. Повышение экспрессии гена c-fos в гиппокампе после тестирования в водном лабиринте Морриса, а также в модели ПО + диабет_24 у 3-месячных животных в отличии от 18-месячных крыс может отражать возрастные различия уровня экспрессии данного гена в ответ на предъявление стрессовых воздействий разной интенсивности. Следует отметить, что у 3-месячных в модели ПО + диабет_24 время выхода на платформу было ниже значения в первый день обучения, что наблюдали на фоне роста уровня экспрессии гена c-fos. В тоже время у 18-месячных животных время выхода на платформу в модели ПО + диабет_24 не отличалось от показателя на 1-й день тестирования в лабиринте Морриса, и у этих животных уровень экспрессии гена c-fos был ниже контрольных показателей (табл. 5, рис. 1).

Рис. 1.

Относительная экспрессия гена c-fos в гиппокампе у 3-х (n = 40) и 18-месячных крыс (n = 36) в модели стептозотоцинового диабета. Примечание: К – контрольная группа; ПО – группа животных в модели пространственного обучения (ПО_3 – 3-й день эксперимента, ПО_24 – 24-й день эксперимента); диабет – модель стрептозотоцинового диабета (24 день эксперимента); ПО + диабет_24 – группа крыс в модели стрептозотоцинового диабета после пространственного обучения (24 день эксперимента). * достоверные отличия показателей относительно контрольных значений; § достоверные отличия показателей относительно значений в группе УР_3; # достоверные отличия у 18-месячных животных показателей относительно значений у 3-месячных крыс (при р < 0.05).

Известно, что ген c-fos кодирует ядерный фосфопротеин Fos, который образует димерный комплекс с белком Jun, имеющим участки связывания последовательности ДНК для белка-активатора фактора транскрипции-1 (AP-1) [20]. При изучении уровня экспрессии гена c-jun установлено, что у 3-месячных животных данный показатель значительно повышается в моделях стрептозотоцинового диабета и ПО + диабет_24, тогда как у 18-месячных крыс, напротив, в данных моделях, особенно, в модели стрептозотоцинового диабета, уровень его экспрессии снижается относительно контрольных значений. Также показано, что у этих крыс уровень экспрессии гена c-jun снижен на 3-й день эксперимента по сравнению с 3-месячными животными (рис. 2).

Рис. 2.

Относительная экспрессия гена c-jun в гиппокампе у 3-х (n = 40) и 18-месячных крыс (n = 36) в модели стептозотоцинового диабета. Примечание: см. рис. 1.

Анализ результатов исследования экспрессии гена Egr-1, связанного с синаптической активностью зрелых нейронов, индуктором транскрипции которого является активация НМДА-рецепторов [21], показал следующее. У 3-х и 18-месячных крыс изменение уровня экспрессии данного гена выявлено только в модели ПО + диабет_24: у 3-месячных животных наблюдали повышение экспрессии Egr-1, а у животных 18-месячного возраста, напротив, ее снижение по сравнению с контрольными значениями. Также установлено, что после тестирования в лабиринте Морриса и в модели ПО + диабет_24 у 18-месячных крыс уровень экспрессии был ниже относительно 3-месячных животных в этих же экспериментальных моделях (рис. 3).

Рис. 3.

Относительная экспрессия гена Egr-1 в гиппокампе у 3-х (n = 40) и 18-месячных крыс (n = 36) в модели стептозотоцинового диабета. Примечание: см. рис. 1.

При изучении уровня экспрессии гена Cyt-c, кодирующего белок цитохром с, наблюдали повышение его экспрессии в гиппокампе у 3-х и, особенно, 18-месячных животных в модели ПО + диабет_24 и, особенно, в модели стрептозотоцинового диабета. Также установлено, что у 18-месячных крыс уровень экспрессии данного гена превышал значения у 3-месячных животных как в контрольной группе, так и в модели ПО + диабет_24 (рис. 4). Повышение экспрессии гена Cyt-c, как известно, усиливает активность каспаз-3 и -9, что сопровождается активацией апоптоза клеток мозга, а также выходом цитохрома-с из мембран и развитием окислительного стресса [22].

Рис. 4.

Относительная экспрессия гена Cyt-c в гиппокампе у 3-х (n = 40) и 18-месячных крыс (n = 36) в модели стептозотоцинового диабета. Примечание: см. рис. 1.

Таким образом, у 18-месячных крыс снижение обучаемости в лабиринте Морриса, а также нарушение сохранности ранее выработанного пространственного обучения, особенно, при моделировании стрептозотоцинового диабета, сопровождается изменением экспрессии генов регуляции синаптической пластичности относительно 3-месячных животных.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Механизмы, происходящие в мозге при развитии сахарного диабета, остаются недостаточно исследованными. В настоящее время известны следующие факторы, влияющие на функции инсулина в мозге. Инсулин способен проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) [23, 24] с помощью переносчика. Данный процесс является регулируемым, зависит от уровня периферического инсулина: если его уровень повышается, это приводит к росту уровня инсулина в спиномозговой жидкости, но в условиях периферической гиперинсулинемии наблюдается подавление связывания рецепторов инсулина в клетках ГЭБ с инсулином, что препятствует транспорту инсулина в мозг [25, 26]. Периферический инсулин может проникать в ЦНС и непосредственно через area postrema и околожелудочковую область, что обеспечивает свободную диффузию растворимых в плазме веществ непосредственно в эту область [27].

В мозге выявлено множество сигнальных путей инсулина, которые принимают участие в регуляции метаболизма мозга, дифференцировки и роста нейронов, а также нейромодуляции [28]. При недостаточности инсулина в мозге может приводить к нейрональной гибели путем апоптоза [29]. Таким образом, эти данные, а также тот факт, что недостаточность инсулина может быть связана с развитием болезни Альцгеймера, доказывают участие инсулина в пластических процессах, связанных с поведением.

В настоящее время насчитывают семь различных путей инициации болезни Альцгеймера в результате развития сахарного диабета. Один из них – это повышение активности инсулин-деградирующего фермента в областях мозга, чувствительных к инсулину, в том числе, в гиппокампе [30]. Данный фермент также способен снижать экспрессию белков, участвующих в синаптической пластичности [31]. В то же время повышение уровня инсулиноподобного фактора роста может приводить к развитию окислительного стресса [32] в тканях мозга и как результат, стать одним из факторов накопления бета-амилоида [24].

В последние десятилетия открытие инсулиновых рецепторов в областях мозга, связанных с обучением и памятью, привело к формированию понимания роли инсулина в процессе старения мозга и развитии нейродегенеративных заболеваний, и, таким образом, о его влиянии на пластические процессы [33, 34].

Модификация активности синапсов и изменение их количества является функциональным и структурным субстратом для пластических процессов, лежащих в основе обучения и памяти, а также закрепления поведенческих изменений [35]. Стимуляция инсулином нейронов гиппокампа вызывает как пресинаптические, так и постсинаптические эффекты. Инсулин повышает высвобождение нейротрансмиттеров из пресинаптических терминалей [36], поэтому в условиях недостатка инсулина в мозге, как например, при сахарном диабете, возможно снижение способности к обучению.

В моделях диабета, чаще всего индуцированных стрептозоцином, у животных, выявляется незначительное снижение объема памяти [37, 38]. Это подтверждается полученными в данном исследовании результатами. Наиболее выражено снижение способности сохранять ранее выработанный навык установлен у 18-месячных крыс. Это сопровождается изменением уровня экспрессии генов регуляторов синаптической пластичности.

Снижение уровней экспрессии ранних генов c-fos и c-jun, связанных с сигнальными каскадами, участвующими в процессах пластичности нейронов, роста клеток и митозе, установлено у 18-месячных крыс, особенно, в модели ПО + диабет_24. Семейство белков Jun и родственные им Fos-белки образуют многочисленное количество комбинаций, контролирующих поздние гены и белки, связанные с процессами памяти, моторики и обучения [39]. Гены c-fos и c-jun являются важными компонентами взаимодействий между генами и стимулами из окружающей среды, поскольку они обеспечивают молекулярную основу для быстрого и динамического ответа нейронов и открывают возможность для длительной и устойчивой адаптации посредством регуляции экспрессии широкого спектра поздних генов. Таким образом, ранние гены тесно связаны с изменением активности нейронов, а также с различными процессами, регулируемыми центральной нервной системой, такими как обучение, память и т.д. [40]. Тем не менее, регуляция экспрессии этих двух генов может различаться при действии разных факторов [41]. В данном исследовании у крыс, которых тестировали в лабиринте Морриса, изменения уровня экспрессии генов c-fos и c-jun у 3‑месячных крыс не были сонаправлены: возрастание уровня экспрессии гена c-fos происходило на фоне отсутствия изменений экспрессии гена c-jun. В тоже время у 18-месячных животных в модели ПО + диабет_24 снижалась экспрессия обоих генов.

Разнонаправленное изменение экспрессии гена Egr-1 у 3-х и 18-месячных животных может отражать возрастные изменения его регуляции в условиях одинаковых внешних воздействий на организм. Согласно существующим представлениям экспрессия гена Egr-1 может активироваться при большом разнообразии стимулов, что отражается в его повышающей регуляции после увеличения уровня внутриклеточного кальция в нейронах гиппокампа. Это дало основание предполагать, что возрастание уровня экспрессии этого гена в структурах мозга в выше перечисленных экспериментальных моделях может лежать в основе повышения нейрональной активности, нейроадаптационных реакций, лежащих в основе обучения и памяти, а также реакции на стресс [42, 43]. Кроме того, известно, что электрическая стимуляция нейронов, приводящая к развитию длительной потенциации, способствует возрастанию уровня мРНК Egr-1, индуктором экспрессии которой является активация НМДА-рецепторов [21]. Поэтому предполагают, что у экспериментальных животных, у которых в структурах мозга наблюдается возрастание экспрессии данного гена происходит активация НМДА-рецепторов [44].

Повышение уровня экспрессии гена Cyt-c в гиппокампе у 18-месячных крыс, особенно, в модели ПО + диабет_24 предположительно может сопровождается и ростом уровня цитозольного цитохрома с, который играет ключевую роль в активации апоптоза нейронов [45] через запуск каскада каспаз. При этом показано, что инсулин способен подавлять высвобождение цитохрома с из митохондрий посредством PI3-K-зависимого пути и оказывать нейропротекторные эффекты в условиях окислительного стресса [46].

Таким образом, в основе возрастных изменений обучения и памяти лежат молекулярные механизмы, регуляция которых, вероятно, изменяется на фоне развивающегося окислительного стресса в структурах мозга и сопутствующих патологий, в частности, развития сахарного диабета.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Способность к пространственному обучению и сохранности выработанного навыка в лабиринте Морриса выше у 3-месячных крыс относительно 18-месячных животных. В модели стрептозотоцинового диабета после обучения в лабиринте Морриса снижение сохранности выработанного навыка у 18-месячных крыс наблюдается на фоне значительного повышения экспрессии гена Cyt-c и понижении экспрессии генов c-fos, c-jun и Egr-1.