Нейрохимия, 2022, T. 39, № 2, стр. 176-183

ВВЕДЕНИЕ

Иммунная система представляет собой морфологически сложное многокомпонентное образование. Клетки и органы иммунной системы постоянно пребывают под влиянием различных эндогенных влияний, которые изменяют интенсивность иммунного ответа, активность и степень вовлечения клеток лимфоидного ряда. Это и предопределяет ее высокую чувствительность к воздействию различных стрессовых факторов [1].

Иммунодефициты – это стойкие структурные изменения в иммунной системе, выявленные с помощью лабораторных исследований, являющиеся морфологической базой иммунной недостаточности и иммунопатологии. Наиболее типичной приобретенной формой вторичного иммунодефицита является СПИД, развивающийся в результате поражения лимфоидной ткани вирусом иммунодефицита человека [2].

Являясь одной из ведущих интегрирующих общерегуляторных систем организменного уровня, иммунная система находится в тесной взаимосвязи с нервной и эндокринной системами [2].

Мозг – субстрат интеллекта, эмоций, сознания и памяти. Кроме этого установлена еще одна его важнейшая функция – участие в сложнейших процессах иммунитета. В ЦНС иммунные функции осуществляются с помощью трех морфологически и функционально отличающихся подсистем: первая подсистема представлена лимфоидными клетками спинно-мозговой жидкости (Т-, В-клетки и их субпопуляции), естественные киллерные клетки, моноциты и макрофаги; вторая – нелимфоидными клетками нервной ткани: клетки микроглии, астроциты, олигодендроциты и клетки эндотелия мозговых сосудов; к третьей подсистеме относятся гуморальные факторы, биологически активные вещества – медиаторы, пептиды, цитокины и другие [3].

Несмотря на многочисленные доказательства тесной взаимосвязи нервной и иммунной систем, пути и механизмы передачи информации от активированной иммунной системы в мозг остаются наименее изученным аспектом их взаимодействия. В связи с этим представляется актуальным изучение состояния аминокислотного фонда головного мозга в условиях иммунодепрессии.

Цель исследования – изучение состояния аминокислотного фонда в отделах головного мозга крыс при введении иммунодепрессанта микофеналата мофетил (ММФ).

ММФ – иммуносупрессивный препарат, основным иммунологическим эффектом которого является способность ингибировать пролиферацию В- и Т-лимфоцитов, соответственно, продукцию антител и генерацию цитотоксических Т-клеток, оказывая тем самым влияние на клеточный и гуморальный иммунитет.

ММФ метаболизируется в его активную форму – микофенольную кислоту (МФК), которая через ряд последовательных стадий превращается в глюкуронид фенилмикофенольной кислоты и ацилглюкуронид микофенольной кислоты. МФК и ее ацилглюкуронид ингибируют инозин-5'-монофосфат-дегидрогеназу (ИМФДГ) – ключевой фермент в биосинтезе пуриновых нуклеотидов de novo, необходимых для синтеза лимфоцитарной ДНК [4, 5].

МФК оказывает более выраженное цитостатическое действие на лимфоциты, чем на другие клетки, поскольку пролиферация Т- и В-лимфоцитов очень сильно зависит от синтеза пуринов de novo, в то время как клетки других типов могут переходить на обходные пути метаболизма [6].

Согласно накопленным литературным данным, назначение ММФ в дозе 40 мг/кг индуцирует желудочно-кишечные расстройства, которые главным образом относятся к местным воспалительным реакциям, вследствие снижения иммунитета [7] в той же дозе препарат угнетает лейкоцитарную инфильтрацию трансплантата после пересадки сердца в модели крыс [8]. Установлено, что внутрижелудочное введение иммуносупрессанта ММФ на протяжении 7 и 14 суток может применяться для экспериментального моделирования иммунодефицитных состояний, не сопровождающихся развитием морфологических признаков лекарственного поражения печени, имеющего место при использовании других иммунодепресантных препаратов [9].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на 32 белых беспородных крысах-самцах массой 180–220 г гетерогенной популяции, находящихся на стандартном рационе вивария со свободным доступом к воде. В эксперименте подбирали однородных по возрасту и массе животных. Иммунодефицитное состояние моделировалось путем внутрижелудочного введения препарата “Микофенолата мофетил” (“Тева”, Венгрия) в дозе 40 мг/кг массы тела один раз в сутки животным трех экспериментальных групп (по 8 особей в каждой): 1-я группа “ММФ-7” 7 сут получала препарат; 2-я группа “ММФ 7 + 7” – 7 сут препарат + 7 сут эквиобъемное количество воды с наблюдением после отмены; 3-я группа “ММФ-14” – 14 сут. Животные контрольной группы внутрижелудочно получали эквиобъемное количество 0.9% хлорида натрия. За 12 ч до забоя животных лишали пищи с сохранением воды в качестве источника питья. Забой животных второй группы проводили на 8-е сут, третьей и четвертой – на 15-е сут. После декапитации животных, извлекали головной мозг, промывали охлажденным 0.9% раствором натрия хлорида и выделяли исследуемые отделы (ствол, гипоталамус) в соответствии с анатомическими границами, которые замораживали в жидком азоте. Все опыты проведены с учетом “Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных” [10]. На данное исследование получено разрешение комитета по биомедицинской этике Гродненского государственного медицинского университета (заседание комитета по биомедицинской этике от 30.01.2018 г. протокол № 1).

Содержание свободных аминокислот в пробах определяли после осаждения белков. Для этого образец гомогенизировали в 10 объемах 0.2 М раствора хлорной кислоты, содержащем 0.2 ммоль/л норвалина (nVal), 1 мкмоль/л ванилиновой кислоты, а также 50 мг/л ЭДТА, 50 мг/л метабисульфита натрия (Na₂S₂O₅). После тщательного перемешивания пробы центрифугировали при 4°С 15 мин при 15 000 g, супернатанты отделяли и хранили при –18°С.

Определение серотонина, предшественников и метаболитов биогенных аминов осуществляли с использованием модифицированного метода, основанного на ион-парной ВЭЖХ с детектированием по природной флуоресценции. Подвижная фаза: 0.1 М NaH₂PO₄, 0.035 M CH3COOH, pH 3.55; 100 мг/л октансульфоната натрия, 50 мг/л ЭДТА, 5% (об.) ацетонитрила, температура колонки 27°С, скорость потока 0.2 мл/мин, детектирование по флуоресценции (280/340 нм).

Определение свободных аминокислот и их производных проводили в тех же хлорнокислых экстрактах с помощью обращеннофазной ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией с о-фталевым альдегидом и 3-меркаптопропионовой кислотой и детектированием по флуоресценции [11]. Метод был доработан для улучшения разрешения предшественников таурина. Предколоночную дериватизацию проводили непосредственно перед вводом проб в хроматограф путем смешивания пробы (0.2 мкл) с 5-кратным объемом 0.4% о-фталевого альдегида и 0.3% 3-меркаптопропи-оновой кислоты в 0.4 М Na-боратном буфере, pH 9.4, затем пробы нейтрализовали 0.2 М раствором HClO₄ до слабокислой среды и немедленно вводили в колонку. Подвижная фаза: 0.1 М Na-а-цетатный буфер, pH 6.15, содержащий 20 мг/л ЭДТА (A); ацетонитрил/вода 7/3 (об./об.) (B), метанол/вода 7/3 (об./об.) (С), 0.1 М Na-ацетатный буфер, pH 5.55, содержащий 20 мг/л ЭДТА (D). Градиентное элюирование от 2 до 100% В с изменением соотношения B/C и A/D в ходе анализа, за 69 мин; скорость потока 0.2 мл/мин, температура колонки 35°С. Детектирование по флуоресценции (231/445 нм) [11].

Хроматограммы обрабатывали с помощью программы Agilent ChemStation В.04.02 по методу внутреннего стандарта. Для калибровки системы использовали смесь аминокислот Aldrich (США), содержащую по 500 нмоль/мл каждого соединения.

Статистическую обработку данных проводили с помощью непараметрических методов. При этом использовали пакет статистических программ STATISTICA 10.0 (SN AXAR207F394425FA-Q). Для всех исследованных показателей определяли базовые параметры описательной статистики. Нормальность выборок проверяли критериями Колмогорова–Смирнова с поправкой Лиллифорса и Шапиро–Уилка. Вследствие отклонения распределения показателей от нормального для сравнения количественного признака в трех и более независимых группах пользовались методом Крускала–Уоллиса. В случае выявления различий проводили попарное сравнение групп с помощью теста Манна–Уитни, применяя поправку Бонферрони [12]. Количественные данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха (между 25 и 75 процентилями). Для характеристики фонда АК рассчитывали следующие показатели: содержание АРУЦ (сумма АК с разветвенной углеводородной цепью), ААК (ароматические аминокислоты), нейротрансмиттерных АК (группы возбуждающих и тормозных АК), гликогенных и кетогенных АК.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследуемые структуры головного мозга характеризуются трансформацией пула АК во вторичном иммунодефицитном состоянии, вызванном воздействием препарата. При данных экспериментальных условиях регистрируются колебания содержания свободных АК в зависимости от длительности воздействия.

Введение ММФ приводит к нарушению метаболизма изучаемых показателей в стволе головного мозга крыс (табл. 1).

Следует обратить внимание на достоверно значимое увеличение содержания метионина в опытных группах “ММФ-7”, “ММФ-14” и “ММФ-7 + 7” на 25%, 13% и 31% соответственно в сравнении с контролем.

Возрастание уровня метионина при введении Микофенолата мофетил в некоторой степени отражает нарушение процессов метилирования, вследствие нарушения превращения метионина в его активную форму S-аденозилметионин [13]. Метионинаденозилтрансфераза II (МАТ II) является ключевым ферментом клеточного метаболизма и катализирует образование S-аденозилметионина из метионина и АТФ. Нормальные покоящиеся Т-лимфоциты имеют минимальную активность МАТ II, тогда как активированные пролифелирующие лимфоциты и трансформированные Т-клетки демонстрируют повышенную активность МАТ II. Этот механизм включает модификацию прокаспазы-8 и, как следствие, повышение активности каспазы-8. Fas-индуцированный путь через торможение МАТ II влияет на метаболизм в митохондриях, что неизбежно ведет к активации каспазы-3 и фрагментации ДНК в клетке. Показано, что бластные клетки утилизируют значительно более высокие уровни S-аденозилметионина, чем нормальные лимфоциты [14].

Уровни основных регуляторов белкового синтеза, каковыми являются АРУЦ – лейцин, изолейцин, валин – статистически значимо ниже в опытной группе “ММФ-7 + 7” в сравнении с контролем и опытными группами “ММФ-7” и “ММФ-14”.

Как известно, головной мозг является одним из мест катаболизма АРУЦ с образованием соответствующих α-кетокислот и образующегося при их катаболизме ацил-КоА [15]. Повышение уровней АРУЦ может быть следствием патологии первого этапа – трансаминирования с α-кетоглутаратом под действием аминотрансферазы, что может явиться причиной нарушения функции мозга при иммунодефицитном состоянии, либо изменениями систем транспорта АК в мозг.

Отмечено повышение уровня аспарагина, являющегося метаболитом возбуждающего медиатора аспартата. Содержание последнего в опытных группах “ММФ-7” и “ММФ-7 + 7” статистически значимо выше на 10% и 26% соответственно в сравнении с контролем (p < 0.05).

Наблюдается тенденция роста содержания глутаминовой кислоты в опытных группах в сравнении с контролем. Концентрация ГАМК при этом изменяется незначительно, за исключением группы “ММФ-7 + 7”, в которой при достоверно значимом увеличении содержания глутамата и аспартата наблюдается статистически значимое снижение ГАМК. При этом соотношение ГАМК/Глу снижается с 0.24 (контроль) до 0.18 для второй опытной группы и ГАМК/Асп – с 1.29 (контроль) до 0.89 для той же группы. В данной группе увеличивается содержание возбуждающих АК (ВАК) на 18% с одновременным снижением содержания тормозных АК (ТАК) на 14% в сравнении с контролем.

Аспартат и глутамат являются важными субстратами для клеток иммунной системы. Как предшественник в синтезе пуринов и пиримидинов, аспартат особенно важен для пролиферации лимфоцитов. Более того, он необходим для рециклинга, продуцируемого iNOS, цитруллина в аргинин в активированных макрофагах [16].

Глутамат регулирует экспрессию iNOS в некоторых тканях (например, мозге), таким образом, опосредованно модулируя состояние иммунокомпетентности животных. Одновременно кислота является субстратом для синтеза ГАМК, которая присутствует в лимфоцитах и макрофагах. Показана экспрессия ГАМК-рецепторов на Т-клетках, которые опосредуют ингибиторный эффект ГАМК на процессы пролиферации. Как промежуточный субстрат в синтезе глутатиона, глутамат играет важную роль в антиоксидантной защите и регуляции иммунного ответа [17].

Отметим повышение уровня триптофана и фенилаланина (ААК) в опытных группах в сравнении с контролем. Наряду с этим содержание ААК в группе “ММФ-7 + 7” на 21% достоверно выше в сравнении с контролем (p < 0.05). Как известно, данные АК в головном мозге являются предшественниками медиаторов (фенилаланин – катехоламинов, триптофан – серотонина и мелатонина).

Стоит отметить изменения показателей функционирования серотонинергической нейромедиаторной системы в опытной группе животных, получавших препарат в течение 7-ми сут. Так наблюдалась тенденция к ускорению оборота серотонина, что подтверждается повышенной концентрацией триптофана (на 11%), самого нейромедиатора – серотонина (на 26%), 5-оксииндолуксусной кислоты (на 50%, р < 0.05) по сравнению с контролем. Концентрация предшественника серотонина – 5‑окситриптофана – снизилась на 32% (p < 0.05).

Причиной имеющегося дефицита АРУЦ при избытке ААК может быть конкуренция последних за транспортные системы ГЭБ.

Отмечена тенденция к увеличению содержания гетероциклической аминокислоты гистидина (p < 0.05) – субстрата для образования гистамина, одного из важных нейромедиаторов в реакциях декарбоксилирования.

В группе “ММФ-7 + 7” отмечалось повышение по отношению к контролю соотношения заменимых и незаменимых АК (с 14.5 в контроле до 16.7) за счет статистически значимого повышения содержания первых. Также выросло отношение суммы концентраций гликогенных АК к кетогенным с 31.1 в контроле до 36.9 в данной опытной группе (p < 0.05) вследствие повышениия содержания гликогенных.

Следует отметить, что в группе “ММФ-14” аминокислотный дисбаланс качественно (АК, содержание которых изменялось) проявлялся аналогично группе “ММФ-7 + 7”, но количественные показатели изменялись не так существенно, а для некоторых АК нивелировались, достигая контрольных значений (триптофан, аспартат, глутамат, ГАМК, лейцин).

Главным вегетативным центром, регулирующим иммунную систему, является гипоталамическая область головного мозга [18, 19]. Возможно, это обусловлено тем, что в гипоталамусе может иметь место прямое воздействие тимических пептидов, так как срединное возвышение гипоталамуса не защищено ГЭБ. Кроме того, следует заметить, что гормональные системы гипоталамуса и гипофиза вовлечены в механизмы положительной или отрицательной обратной связи, регулирующие синтез и секрецию тимических пептидов. Установлено, что гормоны тимуса способны оказывать определенное влияние на аминокислотный фонд (ГАМК, глутаминовая и аспарагиновая кислоты) в различных структурах головного мозга крыс [20].

В гипоталамусе наблюдается явный дисбаланс ГАМК (табл. 2) при иммунодефицитном состоянии: ее концентрация снижается достоверно в сравнении с контролем в группе “ММФ-7” (на 22%) и в группе “ММФ-7 + 7” (на 23%). При этом содержание глутаминовой и аспарагиновой кислот остается практически неизменным, а соотношение ГАМК/Глу (0.64 для контроля) и ГАМК/Асп (2.2 для контроля) снижается до 0.49 и 1.7 соответственно в первой опытной группе; 0.44 и 1.8 соответственно во второй опытной группе.

В литературе имеются сведения как об угнетающем, так и активирующем влиянии ГАМК на иммунную систему [21]. Большинство авторов отмечает иммунокорригирующие свойства ГАМК-ергических средств [22]. В головном мозге синтез ГАМК осуществляется путем декарбоксилирования глутаминовой кислоты, катализируемого глутаматдекарбоксилазой (ГДК) – пиридоксаль-5-фосфатзависимым ферментом. Превращение ГАМК в субстраты цикла Кребса и некоторые АК позволяет рассматривать возможность ее функционирования в качестве нейротрофического агента. В пользу последнего предположения свидетельствует процесс синтеза ГАМК как в нейронах, так и глиальных клетках, а также неоднородное распределение ферментов метаболизма ГАМК в отделах мозга [23]. К настоящему времени доказано, что концентрация ГАМК в мозге, определяемая балансом между ее синтезом и деградацией, является показателем функционального состояния ЦНС при нормальных физиологических и патологических состояниях. [24].

Обращает на себя внимание тот факт, что наиболее существенные изменения содержания свободных АК характерны для опытной группы “ММФ-7 + 7” в сравнении с контрольной группой и группами “ММФ-7” и “ММФ-14”. При этом наблюдается тенденция к уменьшению содержания ряда АК: глутамина, ГАМК, валина, лейцина, лизина. При моделировании ИД состояния в группе “ММФ-7 + 7” наблюдается уменьшение содержания АРУЦ на 11% в сравнении с контролем (р < < 0.05). Важно отметить, что АРУЦ являются также донорами аминогруппы и углеродной основой для образования других АК, в первую очередь, таких как глутамин, важных для функционирования иммунной системы. Известно существование в головном мозге лейцин-глутаматного цикла, который служит дополнением глутамат-глутаминового цикла [25].

Кроме того лимфоциты экспрессируют АРУЦ-трансаминазу и дегидрогеназу для деградации разветвленных кетокислот [26]. Отметим возрастание содержания триптофана, аргинина, гистидина.

Введение препарата ММФ на протяжении 7-ми сут сопровождалось снижением уровня серотонина (2.90 (2.318; 3.370)) по сравнению с контролем (3.43 (2.929; 4.328)) в исследуемой структуре головного мозга крыс (р < 0.05). Дефицит нейромедиатора в данном отделе мозга может быть причиной определенной дисфункции серотонинергической системы при действии иммунодепрессанта. При увеличении срока воздействия до двух недель (ММФ-14) исследованный показатель увеличился (4.27 (2.008; 4.795)) в сравнении с контрольным. При введении ММФ в течение 7-ми сут с последующей 7-суточной отменой наблюдался рост содержания триптофана и снижения концентрации серотонина (2.93 (2.814; 3.255)) по сравнению с контролем (р < 0.05). Уровень содержания основного метаболита серотонина – 5-оксииндолилуксусной кислоты – остается практически неизменным во всех опытных группах в сравнении с контролем.

Глутамин – наиболее распространенная АК в плазме крови, скелетных мышцах, печени, клетках иммунной системы. Исследования in vitro показывают, что глутамин влияет на различные компоненты иммунного ответа. Так, эта АК необходима для пролиферации лимфоцитов в ответ на стимуляцию Т-клеток митогенами и активацию протеинкиназы С. Добавление 2 мМ глутамина к культуре клеток предупреждает апоптоз, стимулирует клеточный рост и способствует продукции антител в лимфоцитах [27].

Таким образом, выявленные изменения уровней свободных АК в изученных отделах головного мозга крыс доказывают формирование метаболического дисбаланса, вызванного введением препарата-иммунодепрессанта ММФ.

ВЫВОДЫ

1. Введение ММФ вызывает аминокислотный дисбаланс в концентрациях изученных АК в стволе и гипоталамусе головного мозга крыс, выраженность которого варьирует в зависимости от длительности иммунодефицитного состояния. Наиболее значимые сдвиги возникают у животных, подвергнутых более краткосрочному влиянию в режиме “ММФ-7” и “ММФ-7 + 7”; введение иммунодепрессанта в режиме “ММФ-14” оказывает наименьшее влияние на уровни изученных показателей.

2. Среди исследованных структур мозга наиболее значительные изменения регистрируются в стволе. В первую очередь это отражается в нарушении метаболизма метионина, ГАМК, глутаминовой и аспарагиновой кислот, гистидина, фенилаланина, что, вероятно, отражает максимальную вовлеченность серотонинергической, дофаминергической, ГАМК-ергической нейромедиторных систем, системы возбуждающих АК и системы гистамина этого региона в реализацию эффектов иммунодефицитного состояния.

3. В наибольшей степени трансформации подверглись показатели групп АРУЦ и нейротранстмиттерных АК (в особенности группа ВАК), что подтверждает их ключевую роль в функционировании ЦНС в норме и в условиях экспериментального иммунодефицита. Уровни ароматических аминокислот и их метаболитов при этом значительно не изменились.