Океанология, 2020, T. 60, № 4, стр. 545-555

ВВЕДЕНИЕ

К пикофитопланктону (ПФ) относят эукариотические водоросли и цианобактерии с размерами клеток менее 3 мкм [31, 32]. ПФ является одним из ключевых компонентов планктона, дающим существенный вклад в биомассу фитопланктона и первичную продукцию в разных районах Мирового океана [8].

Климатические изменения, происходящие в последние десятилетия в Арктике, привели к существенным изменениям абиотических условий в шельфовых арктических морях [28, 35, 36], что повлияло на условия существования базового трофического звена арктических экосистем — фитопланктон. Прогнозируется, что изменения пелагической морской среды, происходящие в арктическом регионе, приведут к увеличению доли ПФ в суммарной биомассе планктонных водорослей [24] и изменению видового состава всех размерных групп фитопланктона, включая ПФ, за счет проникновения водорослей умеренных вод и исчезновения арктических эндемиков [25].

В арктических районах в составе ПФ доминируют фототрофные пикоэукариоты (ФПЭ) [23, 45]. При всей значимости ФПЭ они являются наименее изученной по таксономическому составу группой фитопланктона. Малый размер, отсутствие у многих таксонов выраженных морфологических признаков, разрушение нежных форм при фиксации – все это затрудняет идентификацию ФПЭ природного фитопланктона традиционными методами микроскопического анализа и ведет к недооценке их видового богатства. В настоящее время для выявления таксономического разнообразия ФПЭ с успехом применяются молекулярно-генетические методы. Генетическое разнообразие ФПЭ исследовано во многих районах Мирового океана, включая Арктику [21, 23, 30], однако сведения о составе ФПЭ Карского моря до настоящего времени отсутствовали.

Цель настоящей работы состояла в оценке численности и биомассы ПФ, содержания хлорофилла “a” (хл “а”) пикофракции, вклада пикоформ в суммарное содержание хлорофилла, а также в выявлении с использованием метагеномного подхода таксономического состава фотоавтотрофных пикоэукариот в заливе Благополучия архипелага Новая Земля и прилегающем районе Карского моря в осенний период.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для работы послужили пробы, отобранные в ходе 69-го рейса НИС “Академик Мстислав Келдыш” в третьей декаде сентября 2017 г. на трех станциях (5642, 5644, 5641_2) в заливе Благополучия восточного побережья архипелага Новая Земля и на ст. 5649, расположенной в районе Новоземельской впадины в северо-западной части Карского моря (далее Карское море) (рис. 1).

Рис. 1.

Схема расположения станций в Карском море и заливе Благополучия архипелага Новая Земля.

Распределение температуры, солености, плотности воды и интенсивности флуоресценции хлорофилла оценивали на основании данных вертикального зондирования CTD-зондом SeaBird-911, оснащенным флуориметром. Интенсивность надводной и подводной облученности в диапазоне фотосинтетически активной радиации (ФАР) измеряли с использованием, соответственно, датчиков LI-190 и LI-192 (LI-COR, США). Подводная облученность определялась в режиме зондирования до глубин ~ 60–80 м, а на мелководных стациях – до дна. Данные зондирования подводной облученности были использованы для определения глубины эвфотической зоны (Z_eu) (1% ФАР). На станциях, на которых не проводились зондирования, Z_eu восстанавливали по региональной эмпирической зависимости значений коэффициента диффузного ослабления нисходящей облученности (Kd) от глубины видимости диска Секки [16]. Пробы воды отбирали батометрами комплекса SBE 32 в пределах эвфотической зоны: в верхнем квазиоднородном слое, в пикногалоклине и/или в слое максимума флуоресценции и с горизонтов ниже пикноклина. Всего было отобрано и проанализировано 14 проб.

Одновременно определяли концентрацию биогенных элементов – P-PO₄, N-NO₃, N-NO₂, N-NH₄ и Si(OH)₄, согласно методам [18]. Далее по тексту все формы неорганического азота суммировали и обозначали N_неорг.

Подсчет численности фотосинтезирующих пикоформ (цианобактерий и эукариот) проводили с использованием люминесцентного микроскопа Leica DM1000 по методике, изложенной в работе [12], а также проточного цитометра Accury C6 (BD Bioscience, США). Использование двух методов учета обусловлено тем, что цитометр Accury C6 дает заниженные оценки численности цианобактерий [39]. Для расчета биомассы содержание углерода в клетках цианобактерий принимали равным 470 фг С/кл [29], а в клетках эукариот определяли по клеточным объемам (W_кл) с использованием зависимости С_кл = 0.433${\text{W}}_{{{\text{кл}}}}^{{0.863}}$ [29]. Объем клеток пикоэукариот рассчитывали, исходя из объема соответствующих стереометрических фигур [47].

При определении концентрации суммарного хл “a” (ХЛ_сум) пробы воды объемом 0.5–1 л фильтровали через фильтры GF/F. Для определения концентрации хл “a” пикофракции (ХЛ_пик) пробы воды объемом 0.5–1 л предварительно профильтровывали методом обратной фильтрации через фильтр с диаметром 3 мкм. Полученный фильтрат осаждали на фильтры GF/F. Концентрацию ХЛ_сум и ХЛ_пик определяли флуориметрически в ацетоновом экстракте [9], используя флуориметр Trilogy Turner Designs (США).

По величинам биомассы на отдельных горизонтах рассчитывали интегральные значения под 1 м² в эвфотическом слое. Величина ошибки при расчете средних значений численности и биомассы ПФ, концентрации ХЛ_сум и ХЛ_пик составляла 20–30%.

Для оценки таксономического состава фотоавтотрофных пикоэукариот на станциях 5642 и 5649 были отобраны пробы воды объемом 2 л с поверхностного горизонта. Для удаления нано- и микропланктона воду предварительно пропускали через камеру обратной фильтрации (диаметр пор фильтра 3 мкм), фильтрат осаждали на картридж Sterivex (Millipore, Durapore, USA) с диаметром пор 0.2 мкм, заполняли его лизирующим раствором [11], замораживали и хранили в жидком азоте до дальнейшего анализа.

Для выделения ДНК использовали набор “Nucleospin Plant” (Macherey-Nagel, Germany), амплификацию проводили с праймерами на область V4 гена 18S рРНК: прямой – EuF-V4 и обратный – picoR2 [11], секвенирование ПЦР продуктов осуществлялось ООО “БиоСпарк” (http://biospark.pro) на платформе “Illumina MiSeq” (США). Прямые и обратные прочтения были объединены, отфильтрованы по качеству и проверены на наличие химер при помощи программного продукта MOTHUR [40]. Для идентификации операционных таксономических единиц (ОТЕ) нуклеотидные последовательности анализировали пакетом программ SILVAngs 1.2 (порог кластеризации 97%) [38], последовательности классифицировали при помощи BLASTn (version 2.2.30+) со стандартными установками.

Филогенетическое дерево филотипов ФПЭ по области V4 гена 18S рРНК построено методом максимального правдоподобия программой RAxML 8.2.10 [42] с использованием эволюционной модели GTRGAMMA и 1000 бутстреп-реплик.

При использовании фракционной фильтрации в фильтратах помимо пикоформ регистрируются организмы нано- и микропланктона, что обусловлено разрушением нежных форм даже при самой мягкой фильтрации, прохождением через поры фильтра простейших с эластичной клеточной оболочкой, а также присутствием в воде пула растворенной ДНК разных размерных групп организмов [46]. Хотя фракционная фильтрация не дает полного отделения пикофракции от нано- и микроорганизмов, при метагеномном секвенировании она способствует снижению риска недоучета пикоформ из-за малого числа копий их генов [52]. В пикофракции планктона также присутствует значительное число гетеротрофных простейших [46]. Поскольку целью настоящего исследования являлись фотоавтотрофные пикоэукариоты, то для дальнейшего анализа из выявленных в фильтратах таксонов были отобраны только те виды фотоавтотрофов, размеры клеток которых не превышают 3 мкм. Также в случаях идентификации до уровня рода и выше в анализ включали таксоны, в состав которых согласно опубликованным данным [46] входят виды, соответствующие по размерам пикофракции.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Абиотические факторы. Температура и соленость поверхностного слоя воды колебались в пределах от –0.9 до 2.8°С и от 33.0 до 27.3‰ соответственно. Минимальные значения температуры и максимальные значения солености отмечены на ст. 5642, расположенной в кутовой части залива Благополучия. По мере продвижения в сторону моря поверхностная температура воды повышается, соленость снижается и на ст. 5649 их значения достигают максимального для температуры и минимального для солености (табл. 1). Анализ спутниковых данных показал, что район исследований полностью был свободен ото льда к середине августа 2017 г.

Глубина эвфотического слоя (1% ФАР) в заливе Благополучия колебалась от 6 до 17 м (табл. 1), в Карском море на ст. 5649 составляла 13 м.

Биогенные элементы. В заливе концентрация минеральных форм азота и фосфора в поверхностных водах была выше, а кремния – ниже, чем в поверхностном слое ст. 5649 в Карском море (табл. 1.). На всей исследованной акватории с глубиной содержание кремния снижалось, а фосфора возрастало. Концентрация минерального азота в заливе Благополучия увеличивалась с глубиной, в Карском море снижалась.

Количественные показатели пикофитопланктона. ПФ был представлен эукариотными водорослями. Исключение составила ст. 5649 в Карском море, где в поверхностном горизонте были выявлены цианобактерии, численность и биомасса которых составили 0.02 × 10⁹ кл/м³ и 0.01 мг С/м³ соответственно. В заливе в поверхностном горизонте численность и биомасса ФПЭ составляла в среднем 0.75 × 10⁹ кл/м³ и 1.49 мг С/м³ соответственно. С глубиной обилие ФПЭ снижалось (рис. 2г, д). Только на ст. 5642 на глубине 20 м биомасса пиководорослей соответствовала значениям, выявленным для поверхностного горизонта (рис. 2г, 2д). В Карском море максимальные значения численности (2.29 × 10⁹ кл/м³) и биомассы (2.76 мг С/м³) выявлены на горизонте 8 м (рис. 2г, 2д).

Рис. 2.

Вертикальное распределение общего хлорофилла (ХЛ_сум) (а), хлорофилла пикофракции (ХЛ_пик) (б), вклад пикофитопланктона в общий хлорофилл (вклад ХЛ_пик, %) (в), численности (N_пик, ×10⁹ кл/м³) (г) и биомассы (В_пик, мг С/м³) (д) и интегральная биомасса пикофитопланктона в ФС (В_пик, мг С/м²) (е) в заливе Благополучия и на шельфе Карского моря.

Интегральная биомасса пикофитопланктона в ФС возрастала по мере продвижения из кута залива в сторону шельфа и достигала наибольших значений на ст. 5649 Карского моря (рис. 2е).

Хлорофилл “a”. В заливе максимальные величины ХЛ_сум и ХЛ_пик отмечены в поверхностном горизонте (рис. 2а, 2б). Минимальные значения ХЛ_сум и ХЛ_пик выявлены в самой кутовой станции залива (ст. 5642), по мере продвижения в направлении от залива в сторону моря в поверхностном горизонте концентрации ХЛ_сум и ХЛ_пик возрастают, и наибольшие значения отмечены в Карском море на ст. 5649 (рис. 2). С глубиной на всех станциях залива ХЛ_сум и ХЛ_пик снижаются. В Карском море наибольшие концентрации ХЛ_сум и ХЛ_пик отмечены на горизонте 8 м. Вклад пикофракции в общий хлорофилл на станциях залива колебался от 12 до 24% и с глубиной существенно не менялся. В Карском море доля пикофитопланктона значительно возрастала с глубиной, достигая 46% на горизонте 23 м (рис. 2в).

Состав фотоавтотрофных пикоэукариот. Доля последовательностей ФПЭ в общем числе качественных прочтений пикофракции планктона как в заливе, так и в Карском море составила 8% (табл. 2). Число ОТЕ и выявленных таксонов в заливе и Карском море практически не различались (табл. 2).

Выявленные ОТЕ соответствовали таксонам, относящимся к четырем крупным филогенетическим группам, включающим 8 классов водорослей (табл. 3). По числу прочтений преобладали Chloroplastida, основной вклад на обеих станциях вносили представители класса Mamiellophyceae (табл. 3). В Карском море выявлены последовательности Trebouxiophyceae, в то время как представители Nephrophyceae и Pyramimonadophyceae не обнаружены. В заливе доля кокколитофорид существенно превышало таковую в Карском море (табл. 3).

Наибольшим таксономическим разнообразием характеризовался класс Mamiellophyceae, в его составе выявлены представители родов Micromonas, Ostreococcus, Bathycoccus, Mantoniella, Mamiella, Crustomastix и Dolichomastix (табл. 4). Последовательности M. polaris и B. prasinos доминировали в общем числе прочтений пикоэукариот (R_ФПЭ), их вклад составил в среднем 36 и 16% соответственно.

Средний вклад представителей двух классов – Bolidophyceae и Mediophyceae, относящихся к группе Stramenopila, совокупно составил 8% R_ПФЭ. Класс Bolidophyceae был представлен родом Triparma, класс Mediophyceae – родами Chaetoceros, Skeletonema и Minidiscus. Среди Haptophyta идентифицированы последовательности класса Coccolithophyceae, относящиеся к двум родам – Phaeocystis и Chrysochromulina. Относительный вклад представителей каждого рода составил в среднем 8 и 2% R_ПФЭ соответственно. Класс Pyramimonadophyceae был представлен родом Pyramimonas, класс Trebouxiophyceae – родами Nannochloris и Picochlorum, класс Nephrophyceae – родом Nephroselmis. Доля представителей каждого рода не превышала 1% от общего числа R_ПФЭ.

Проведенный филогенетический анализ показал, что часть последовательностей, идентифицированная по базе NCBI как некультивируемые организмы, относилась к классам Mamiellophyceae, Coccolithophyceae, Pyramimonadophyceae, Mediophyceae, Bolidophyceae и Cryptophyceae (рис. 3).

Рис. 3.

Филогенетическое дерево филотипов ФПЭ, построенное по области V4 гена 18S рРНК методом максимального правдоподобия. Приведены бутстреп-значения поддержки узлов ≥50%. Жирным шрифтом отмечены филотипы, определенные до вида.

Общими для залива и Карского моря оказались 17 филотипов водорослей, относящихся к 11 родам (табл. 4). Некоторые виды, а также таксоны, идентифицированные до уровня рода и выше рангом, были выявлены только на одной из станций (табл. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей работе впервые охарактеризованы видовой состав ФПЭ, пространственное распределение численности, биомассы и содержания хл “a” ПФ, а также вклада пикоформ в суммарное содержание хлорофилла в заливе Благополучия и прилегающем шельфе Карского моря.

Обилие ПФ было невысоким. Средние значения численности и биомассы в заливе были более чем на порядок ниже таковых в северо-западном районе моря в сентябре 2011 г. (5.0 × 10⁹ кл/м³, 1.8 мг С/м³) [6]. На ст. 5649 Карского моря биомасса была в два раза меньше, чем в северо-западном районе море в сентябре 2011 г. Наибольшая величина интегральной биомассы пикофитопланктона в слое 0–25 м в 2017 г. (ст. 5649, 41.3 мг С/м²) была в два раза ниже таковой в 2011 г. (83.1 мг С/м²). В заливе пикофракция фитопланктона была представлена исключительно эукариотами, в то время как в Карском море (ст. 5649) в поверхностном горизонте выявлены цианобактерии, их вклад в суммарную биомассу пикоформ был незначителен и не превышал 1%. Существенно более низкую биомассу цианобактерий по сравнению с эукариотами вплоть до полного их отсутствия отмечали во многих районах Арктики [14, 33, 45]. Согласно опубликованным данным в исследуемом районе Карского моря регулярно регистрируют поверхностную распресненную “линзу”, формирующуюся паводком рек Оби и Енисея [3, 7]. Пониженное значение солености верхнего 8–10-метрового слоя воды, а также более высокие значения концентрации кремния – показателя степени распреснения поверхностных вод, в исследуемом районе Карского моря по сравнению с заливом Благополучия может быть обусловлено остатками пресных вод “линзы”, которые постепенно смешиваются с солеными морскими водами. В полярных водах пикоцианобактерии представлены преимущественно видами рода Synechococcus, которые являются либо автохтонными [35], либо аллохтонными формами [15, 35, 48]. Ранее было показано, что в центральной части Карского моря пикоцианобактерии имеют автохтонное происхождение и основным источником их поступления является речной сток [2]. Таким образом, можно предположить, что выявленные цианобактерии в поверхностном слое Карского моря являются пресноводными формами, вносимыми речным стоком.

Концентрация ХЛ_сум в верхнем 50-метровом слое в заливе (4.74 мг/м²) была в 4 раза ниже, чем в сентябре 2013 г. (22.25 мг/м²), и в 2 раза ниже, чем в августе 2014 г. (11.80 мг/м²) [1]. Значение ХЛ_сум в фотическом слое Карского моря (9.52 мг/м²) соответствовало среднему значению этого параметра, полученному в этом районе в сентябре 2007 г. (11.40 мг/м²) [4].

Пределы колебания вклада пикофракции в суммарное содержание хл “а” в заливе (12–24%) соответствовали таковым во внешнем эстуарии реки Оби и прилегающем шельфе (4–23%) [2]. В Карском море доля пикофитопланктона была выше, что согласуется с данными, полученными ранее для западной части Карского моря, где отмечены более высокие величины вклада пикоформ в содержание хлорофилла – до 54% [2]. Согласно опубликованным данным, пикоформы могут вносить существенный вклад не только в содержание пигментов и биомассу фитопланктона, но и в его функциональные показатели. Так в северной части Карского моря в сентябре 2013 г. вклад мелкоклеточного (<5 мкм) фитопланктона в потребление СО₂ варьировал от 34 до 69%, нитратов – от 56 до 89%, аммония – от 45 до 76% [14].

Как и во многих арктических районах [21, 30, 51], в заливе Благополучия и Карском море среди ФПЭ преобладали Chloroplastida. Наибольшее число прочтений принадлежало видам Micromonas polaris и Bathycoccus prasinos. M. polaris относится к арктическим видам, максимальное его обилие выявлено в районах с температурой воды около 0°C. Доминирование M. polaris ранее было отмечено в пикофракции летнего планктона моря Боффорта [10], в проливе Фрама его вклад в число последовательностей класса Mamiellophyceae достигал 66% [44]. В свою очередь B. prasinos относится к видам с широким ареалом распространения, последовательности B. prasinos выявлены как в тропических, так и полярных водах [44]. Высокий вклад B. prasinos согласуется с фактом приуроченности наибольшего обилия этого космополитного вида к прибрежным водам [46].

Филотипы Trebouxiophyceae выявлены только в Карском море и соответствовали родам Nannochloris и Picochlorum. Представители этих родов относятся как к пресноводным, так и солоноватоводным и морским видам. В холодных и соленых водах залива Благополучия Trebouxiophyceae полностью отсутствовали, в Карском море доля последовательностей этого класса водорослей была невысока. Учитывая, что воды в исследуемом районе моря могут иметь речное происхождение, можно предположить, что представители выявленных родов Nannochloris и Picochlorum относятся к пресноводным или солоноватоводным видам.

Относительно высокий вклад последовательностей Haptophyta в водах залива Благополучия, в частности Phaeocystis pouchetii, согласуется с регистрацией высокого обилия этого таксона в пикопланктоне атлантического сектора Арктики [30]. В Карском море доля Haptophyta была существенно ниже, что возможно связано с присутствием более пресных вод в этом районе. Положительная связь между числом прочтений Haptophyta и соленостью выявлено в проливе Скагерра́к, Северное море [17]. Часть ОТЕ Haptophyta не кластеризовалось с ОТЕ известных культивируемых видов, а относилась к некультивируемым гаптофитам и некультивируемым эукариотам. Последовательности этих некультивируемых организмов были ранее выделены из вод северной части Тихого океана, северной Атлантики, Мраморного и Южно-Китайского моря, а также Баренцева моря [27, 34, 41, 50].

Среди Bolidophyceae в составе пикофракции планктона доминировали некультивируемые болидофитовые водоросли, последовательности которых были выявлены во льду, подледной воде и летнем планктоне Белого моря [13]. Единственный представитель Bolidophyceae идентифицированный до вида – Triparma strigata, относится к холодолюбивым видам и не встречается в планктоне при температуре более 10°С [19, 20].

Диатомея Minidiscus trioculatus является широко распространенным видом и в ряде случаев достигает значительной численности [46]. Учитывая незначительное число выявленных прочтений M. trioculatus, а также тот факт, что ранее в планктоне Карского моря эта водоросль не была идентифицирована, ее следует отнести к редким видам карского планктона. Число прочтений диатомеи Skeletonema marinoi также было невысоким. Однако это обусловлено тем, что размер колоний Skeletonema превышает 3 мкм, и в пикофракцию попадают только отдельные клетки. В фитопланктоне юго-западной части Карского моря отмечена Skeletonema, ранее идентифицированная как S. costatum [5]. Настоящее исследование позволяет расширить список видов этого рода, входящих в состав фитопланктона Карского моря. Это первая регистрация S. marinoi в планктоне Карского моря.

Среди Cryptophyceae отсутствуют виды, имеющие размеры клеток <3 µm, за исключением водоросли Hillea marina [46], однако в генбанке NCBI последовательность данного вида отсутствует. Включение в анализ последовательностей криптофитовых водорослей обусловлено тем, что ранее Cryptophyceae регистрировались в пикофракции планктона при использовании фракционной фильтрации [26, 46]. Проведенный нами филогенетический анализ показал, что в летнем пикофитопланктоне Карского моря и залива Благополучия могут присутствовать криптофитовые водоросли. Однако уверенно утверждать, что выявленные ОТЕ относятся к пикофракции, а также являются фототрофными криптофитовыми водорослями, возможно только после выделения этих таксонов в культуру и их описания.

Таким образом, нами впервые дана оценка биомассы планктонных фотосинтезирующих пикоформ и их вклада в общее содержание хл “a” в заливе Благополучия архипелага Новая Земля. Выявленные значения оказались ниже, чем в западной части Карского моря, где пикофитопланктон играл существенную роль. Впервые получены данные по таксономическому составу пиководорослей в Карском море. Метагеномный анализ выявил представителей восьми классов водорослей, относящихся к 17 родам. В составе сообществ присутствовали как арктические виды, например, Micromonas polaris, так и виды космополиты – Bathycoccus prasinos, Skeletonema marinoi. Разнообразие пикофитопланктона в заливе Благополучия и Карском море определялось гидрологией районов – в менее соленых водах Карского моря вследствие разбавления их речными водами в пикофракции планктона выявлены цианобактерии и таксоны эукариотических водорослей, имеющие в своем составе солоноватоводные и пресноводные формы. Подчеркнем, что исследования были проведены в осенний период и только на четырех станциях. Для планктонных пикоавтотрофов характерна выраженная пространственно-временнáя изменчивость состава и обилия [22, 26, 43, 49]. Для полной оценки таксономического состава ФПЭ необходимы исследования с использованием молекулярных методов в другие периоды и в других районах моря.

Благодарности. Авторы благодарят П.Н. Маккавеева и С.А. Щуку за предоставленные материалы по гидрофизике и гидрохимии.

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках Государственных заданий МГУ им. М.В. Ломоносова часть 2 (тема №АААА–А16–116021660052–0 и АААА-А17-117120540067-0), экспедиционные исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ (проект № 18–05–60069 Арктика), обработка и анализ полученных результатов – РФФИ (проект № 19–05–00026а).