Онтогенез, 2020, T. 51, № 6, стр. 417-439

Разработка питательных сред для культивирования in vitro преимплантационных эмбрионов млекопитающих

При создании питательных сред исследователи используют два основных подхода: “back-to-nature”, когда компоненты и их концентрации стараются сделать максимально приближенными по составу к таковым репродуктивных путей и “let embryo choose”, когда их состав подбирают эмпирическим путем (Summers, Biggers, 2003; Брусенцев и др., 2014). В настоящее время наиболее популярными средами для культивирования in vitro преимплантационных эмбрионов лабораторных животных являются: KSOM, KSOMaa, HECM, mR1ECM, G1/2, SOF, CZB (Summers, Biggers, 2003; Брусенцев и др., 2014; Finger et al., 2015; Belli et al., 2019). Состав этих питательных сред представлен в табл. 1. Питательные среды, которые были весьма популярны при культивировании эмбрионов лабораторных животных ранее, в частности, среда М16, разработанная в 1971 г., представляют, в наше время, скорее исторический интерес (Summers, Biggers, 2003) и в таблицу не включены. Некоторые из культуральных сред, представленных в табл. 1, состоят из минимального числа необходимых веществ, подобранных по принципу “let embryo choose”, как, например, среда KSOM (К+ simplex optimized medium), которая содержит 11 ингредиентов (при добавлении сывороточного альбумина – 12). Несмотря на небольшое число компонентов, данная среда является сбалансированной по их концентрациям и оптимально подходит для развития ранних зародышей мышей (Summers, Biggers, 2003; Брусенцев и др., 2014). Однако для других видов млекопитающих используют, зачастую, более богатые компонентами варианты этой среды, в частности, KSOMaa, в которой 32 компонента, благодаря добавлению аминокислот (Biggers et al., 2000; Summers, 2014; Belli et al., 2019).

В среды для культивирования эмбрионов некоторых животных добавляют 5–15% сыворотки крупного рогатого скота (КРС) или других млекопитающих (Han, Niwa, 2003; Amstislavsky et al., 2018). Также для оптимизации среды иногда добавляют репродуктивные жидкости (фолликулярную, яйцевода или матки). Так, например, в эксперименте по культивированию ранних зародышей свиней добавление этих компонентов не только улучшает качество развивающихся бластоцист, но и корректирует эпигенетические изменения, вызванные применением ВРТ (Canovas et al., 2017). Другим подходом для оптимизации питательной среды является добавление в нее осмолитов, таких как сывороточный альбумин (Summers, Biggers, 2003; Брусенцев и др., 2014; Brusentsev et al., 2018) или его синтетические аналоги, в частности, поливиниловый спирт – ПВС (Cozzi et al., 2010; Брусенцев и др., 2014). В качестве ресурса для пластического обмена используют свободные аминокислоты (Cozzi et al., 2010).

Преодоление двухклеточного блока развития преимплантационных эмбрионов грызунов

Проблемой культивирования со стадии зиготы ранних зародышей грызунов (мышей, хомячков, крыс) долгое время являлся двухклеточный блок развития (Schini, Bavister, 1988; Lawitts, Biggers, 1991; Miyoshi et al., 1994). Многочисленные попытки преодоления блока включали в себя модификацию состава сред путем изменения концентраций некоторых базовых компонентов: NaCl, KCl, NaHCO₃, KH₂PO₄, пирувата, глюкозы, а также добавлением дополнительных компонентов, таких как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и глутамин (Chatot et al., 1990). С использованием симплекс-метода, который позволил оптимизировать концентрации компонентов культуральной среды, Джоном Биггерсом и его коллегами была создана среда SOM – simplex optimized medium (Lawitts, Biggers, 1991; Summers, 2014). Культивирование на данной среде позволило не только преодолеть двухклеточный блок развития эмбрионов мышей, но и получить высокий процент бластоцист (Lawitts, Biggers, 1991). Впоследствии среда SOM была модифицирована и получила название KSOM, то есть среда SOM, обогащенная калием (Lawitts, Biggers, 1993). Исследователи показали успешное развитие мышиных эмбрионов до стадии бластоцисты на модифицированной среде mKSOM, обогащенной глюкозой (Biggers, McGinnis, 2001). Также было установлено, что в случае с мышиными эмбрионами, наличие в среде KSOM фосфатов вызывает блок развития лишь у малой группы зигот, чувствительных к данному компоненту (Biggers, McGinnis, 2001).

Между тем, было показано негативное влияние наличия фосфатов в культуральной среде на развитие эмбрионов хомячков (Schini, Bavister, 1988) и крыс (Miyoshi et al., 1994). Для культивирования эмбрионов хомячков была создана среда hamster embryo culture medium (HECM), в которой отсутствуют фосфаты (табл. 1). До настоящего времени было создано десять модификаций этой среды (Seshagiri, Vani, 2019). На основе HECM была создана специализированная среда rat one-cell embryo culture medium (R1ECM), предназначенная для культивирования эмбрионов крыс (табл. 1). Эмбрионы некоторых линий крыс удавалось культивировать при помощи этой среды вполне успешно (Miyoshi et al., 1994; Брусенцев и др., 2015). Между тем, недавно была создана модификация среды KSOM, предназначенная для культивирования крысиных эмбрионов (KSOM-R), в составе которой были исключены все фосфаты и добавлены таурин, глицин, глутамат и аланин (Nakamura et al., 2016). Было показано, что в среде KSOM-R эмбрионы крыс развиваются быстрее, чем в mR1ECM (Men et al., 2020).

Оптимальные среды для культивирования преимплантационных эмбрионов разных видов млекопитающих

На сегодняшний день не существует универсальной питательной среды, на которой можно было бы культивировать in vitro преимплантационные эмбрионы всех видов млекопитающих. Тем не менее, большой прогресс достигнут в оптимизации культуральных сред в экспериментах, при культивировании эмбрионов лабораторных животных (Summers, Biggers, 2003; Брусенцев и др., 2014; Summers, 2014). В настоящее время, успешно культивируют ранние зародыши таких млекопитающих как куньи (Amstislavsky et al., 2012), кошачьи (Herrick et al., 2007; Amstislavsky et al., 2018; Brusentsev et al., 2018), псовые (Lindeberg et al., 1993; Luvoni et al., 2006), КРС (Sugimura et al., 2012) и многих других. При культивировании эмбрионов млекопитающих необходимо учитывать их видовую специфику (Amstislavsky et al., 2012), так как существенные отличия наблюдаются при развитии in vitro зародышей даже таких близкородственных видов грызунов, как мыши (Summers, Biggers, 2003; Брусенцев и др., 2015), крысы (Miyoshi et al., 1995; Han, Niwa, 2003; Брусенцев и др., 2015; Igonina et al., 2019) и хомячки (Schini, Bavister, 1988; Amstislavsky et al., 2015; Brusentsev et al., 2015). При подборе концентраций компонентов питательных сред, в частности, пирувата также учитывают видовую специфику. Примером служат эмбрионы свиней, богатые липидными гранулами, потребности которых отличаются от эмбрионов мышей с низким содержанием внутриклеточных липидов (Bradley, Swann, 2019).

На средах KSOM (mKSOM, KSOMaa и KSOM-R) эффективно развиваются ранние зародыши мыши (Belli et al., 2019), крысы (Men et al., 2020), крупного рогатого скота (Nedambale et al., 2004), кролика (Liu et al., 1996), овцы (Aghaz et al., 2016), свиньи (Machaty et al., 1998) и верблюда (Yaqoob et al., 2017). Среды HECM и созданная на ее основе R1ECM применяются для развития ранних зародышей мышей (Брусенцев и др., 2015), хомячков (Amstislavsky et al., 2015; Brusentsev et al., 2015; Seshagiri, Vani, 2019), крыс (Miyoshi et al., 1995; Igonina et al., 2019) и макак (Zhou et al., 2006). Можно выделить и другие среды-кандидаты на “универсальность”, на которых можно успешно культивировать in vitro преимплантационные эмбрионы различных видов млекопитающих, такие как G1/2, SOF и CZB. Среда G1/2 или G1.2/2.2 используется для культивирования эмбрионов мыши (Finger et al., 2015), лошади (Choi et al., 2003а), КРС (Lane et al., 2003), козы (Hosseini et al., 2015) и свиньи (Swain et al., 2001). Различные модификации среды SOF (SOFaa, SOF1/2 и другие) используется для культивирования in vitro эмбрионов КРС (Nedambale et al., 2004), овцы (Mara et al., 2014), козы (Hosseini et al., 2015), ламы (Trasorras et al., 2014), собаки (Rodrigues et al., 2004) и кошки (Sananmuang et al., 2011). На среде CZB развиваются ранние зародыши мыши (Chatot et al., 1990), лошади (Choi et al., 2003b), козы (Izquierdo et al., 1999), свиньи (Pollard et al., 1995) и хорька (Li et al., 2001). Однако какой бы сбалансированной не была искусственная питательная среда для культивирования in vitro преимплантационных эмбрионов, она все равно остается субоптимальной, в частности, потому, что на развитие эмбрионов in vivo воздействуют различные гормоны и факторы роста, как уже было сказано ранее (Aguilar, Reyley, 2005).

Включение отдельных факторов роста или их комбинации в культуральную среду in vitro способствует улучшению раннего эмбрионального развития и увеличению доли имплантирующихся зародышей (Kawamura et al., 2012; Брусенцев и др., 2014). Ряд исследований указывает на ускорение развития преимплантационных эмбрионов млекопитающих при добавлении таких ростовых факторов, как IGF-1 (Кожевникова и др., 2017), EGF (Брусенцев и др., 2015), GM-CSF (Amstislavsky et al., 2015) и других, а также комбинации нескольких факторов роста (Kawamura et al., 2012). Стимулирующее воздействие на развитие эмбрионов млекопитающих in vitro оказывают также хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), бета-эндорфин, инсулин и другие гормоны (Брусенцев и др., 2014; Dinopoulou et al., 2016).

Влияние физико-химических параметров культивирования на развитие преимплантационных эмбрионов млекопитающих in vitro

Такие условия, как температура, влажность, pH культуральной среды, состав газовой смеси, поддерживаемые в лабораторных CO₂-инкубаторах, могут существенно повлиять на развитие эмбрионов (Брусенцев и др., 2014). Основным правилом эмбриологической лаборатории является поддерживание стабильности среды, где происходит культивирование эмбрионов in vitro: необходимо минимизировать число манипуляций и наблюдений за эмбриологическим материалом вне СО₂-инкубатора, чтобы снизить стресс для дробящихся зародышей (Miller, 2014).

Температурный контроль, а также контроль влажности в СО₂-инкубаторе, является наиболее важным для системы культивирования, так как развивающиеся эмбрионы очень чувствительны к перепадам температуры (Miller, 2014). В настоящий момент наиболее оптимальной температурой для поддержания развития ранних зародышей вне организма считается температура около 37°С (Swain et al., 2016), а также влажность около 90% (Higdon et al., 2008). Кроме того, необходимо учитывать, что в каждом конкретном СО₂-инкубаторе температура неравномерно распределена, и существуют “холодные” и “горячие” зоны, где температура может различаться (Miller, 2014).

Важнейшим показателем для поддержания развития преимплантационных эмбрионов вне организма матери является pH культуральной среды (Брусенцев и др., 2014). Компоненты питательных сред, а также состав газовой смеси инкубатора, подбирают таким образом, чтобы обеспечить pH в интервале 7.2–7.4 (Брусенцев и др., 2014). Основным компонентом питательной среды, который регулирует данный показатель, является бикарбонат натрия, который обычно добавляется в среду в концентрации 25 мМ (Брусенцев и др., 2014). Инкубатор поддерживает pH на нужном уровне благодаря постоянному содержанию в нем 5–7% CO₂ (Higdon et al., 2008).

Оптимальный состав газовой смеси оказывает большое влияние на результативность культивирования преимплантационных эмбрионов in vitro (Брусенцев и др., 2014). Часто газовый состав в инкубаторе содержит 5% CO₂ и 95% воздуха (Higdon et al., 2008). In vivo эмбрионы млекопитающих находятся в среде, где содержание кислорода в 2.5 и более раз ниже, чем в атмосфере (Fischer, Bavister, 1993; Menezo et al., 2013). Было показано, что высокое содержание O₂ ухудшает развитие эмбрионов, приводит к повышению частоты возникновения нарушений в митохондриях, высокому уровню активных форм кислорода, а также может влиять на процессы расхождения хромосом (Menezo et al., 2013; Belli et al., 2019). В эксперименте было показано, что снижение содержания кислорода в газовой смеси с 20 до 5% при культивировании эмбрионов мышей существенно улучшает их развитие (Belli et al., 2019). Кроме того, некоторые летучие органические соединения (стирол, формальдегид, глутаровый альдегид, толуол), а также микроорганизмы в воздухе лаборатории, могут оказывать негативное влияние на процесс культивирования эмбрионов (Miller, 2014).

Культивирование in vitro преимплантационных эмбрионов человека

Результаты исследований, полученных на различных видах животных, учитывают и при создании сред для культивирования in vitro эмбрионов человека (Брусенцев и др., 2014). Большой прогресс достигнут в оптимизации культуральных сред, используемых в медицине (Youssef et al., 2015). Важное значение для культивирования in vitro эмбрионов человека является развитие двухступенчатых сред – sequential media, а также переход к одноступенчатому протоколу – single media (Morbeck et al., 2014, 2017). Состав некоторых фирменных питательных сред, используемых на сегодняшний день в репродуктивной медицине, представлен в табл. 2.

Двухступенчатый метод был создан исследователями с использованием подхода “back-to-nature” для максимального приближения условий культивирования к естественным условиям среды с меняющимся составом (Gardner, 1998; Gardner, Lane, 2014). По отношению к культивированию in vitro ранних зародышей человека были разработаны следующие двухступенчатые питательные среды: 1) G1/2 от компании Vitrolife, Швеция; 2) QACM/QABM от компании CooperSurgical (SAGE), Дания; 3) SICM/SIBM от компании Cook, США; 4) IVC1/IVC3 от компании InVitroCare, США; 5) ISM1/BA от компании CooperSurgical (Origio), Дания (Morbeck et al., 2014). Позднее, используя подход “let embryo choose”, исследователями были разработаны одноступенчатые питательные среды, которые подходят как для ранних, так и для более поздних стадий развития (Morbeck et al., 2017). К этим средам относятся: 1) Global от компании CooperSurgical (LifeGlobal), Дания; 2) CSC от компании FUJIFILM Irvine Scientific, Япония; 3) G-TL от компании Vitrolife, Швеция; 4) 1-Step от компании CooperSurgical (Origio), Дания (Morbeck et al., 2017). Такие среды позволяют совершать меньше манипуляций с эмбрионами и таким образом сводить к минимуму вероятность повреждений (Dieamant et al., 2017).

По аналогии со средами для культивирования in vitro преимплантационных эмбрионов млекопитающих, в клинике также используют добавление некоторых гормонов и факторов роста с целью повышения эффективности ВРТ (Ziebe et al., 2013). Учитывая сложный каскад молекулярных взаимодействий между эндометрием и эмбрионом (Makieva et al., 2018), был применен другой подход к оптимизации систем культивирования, а именно со-культивирование эмбрионов с аутологичными эндотелиальными клетками эндометрия (Le Saint et al., 2019). В недавнем клиническом исследовании было показано, что такой способ культивирования существенно увеличивает процент получения бластоцист хорошего качества по сравнению с традиционным методом (Le Saint et al., 2019). Однако, такой подход является технически сложным и дорогостоящим, что затрудняет его внедрение в клиническую практику.

Влияние культивирования in vitro на изменение экспрессии генов в преимплантационных эмбрионах лабораторных животных

К настоящему времени на эмбрионах различных видов млекопитающих получены данные, указывающие на значительные изменения в паттерне экспрессии генов, обусловленные применением ВРТ (de Waal et al., 2014). Однако в большинстве работ исследовали совокупный эффект ВРТ на фенотип и экспрессию генов, но не вклад отдельных этапов (de Waal et al., 2014; Feuer et al., 2016). Кроме того, исследования на мышах показали значительное влияние на результат культивирования межлинейных различий (de Waal et al., 2014).

В работе о влиянии различных этапов in vitro процедур на состояние транскриптома бластоцист и взрослых потомков, показано, что именно условия культивирования, и в первую очередь, концентрация кислорода, провоцируют наибольшие отклонения экспрессии генов в бластоцистах мышей (Feuer et al., 2016). При этом каждая комбинация исследованных процедур характеризуется своим уникальным профилем экспрессии, ассоциированным с различными сигнальными и метаболическими путями (Feuer et al., 2016).

Наибольшее внимание исследователей сосредоточено на эффектах ВРТ по отношению к эпигенетической регуляции экспрессии генов, и в частности, на нарушениях геномного импринтинга в ходе раннего развития эмбриона (Market-Velker et al., 2010). Именно в контексте фактора состава среды для культивирования, одним из наиболее показательных можно считать исследование на мышах, в котором проводят параллельное сравнение пяти коммерческих культуральных сред (KSOMaa, Global, HTF, P1/MB и G1.5/G2.5) в сравнении с наиболее бедной средой Whitten’s и условиями in vivo (Market-Velker et al., 2010). Анализ метилирования и экспрессии трех импринтируемых локусов, H19, Peg3 и Snrpn, при культивировании до стадии бластоцисты показал, что во всех шести средах происходит утрата как отцовского (H19), так и материнского (Peg3 и Snrpn) импринтинга, хотя и в разной степени, что позволило ранжировать среды по приближенности к условиям in vivo (Market-Velker et al., 2010).

Масштабные изменения в профилях метилирования и экспрессии генов эмбриона в результате культивирования были показаны с помощью полногеномных методов. Так, с помощью RNA-seq и PBAT-seq было показано, что культивирование эмбрионов свиньи в сравнении с in vivo условиями приводит к изменению паттернов метилирования и экспрессии генов, связанных с репрограммированием, импринтингом и развитием клеток (Canovas et al., 2017). Более того, добавление в культуральную систему содержимого репродуктивных путей приводило к менее выраженным отклонениям экспресии генов и эпигеноме на стадии бластоцисты, что обусловлено, в частности, предотвращением деметилирования локуса IGF2R, непосредственно ассоциированного с синдромом крупного потомства (Canovas et al., 2017).

На модели мышей совместный эффект in vitro оплодотворения и культивирования на транскриптом и эпигеном экстраэмбриональных и плацентарных тканей был исследован с помощью RNA-seq и MeDIP-seq (Tan et al., 2016). Было выявлено 409 генов, экспрессия которых была изменена в соответствии с гипо- или гиперметилированием их промоторов в ответ на in vitro процедуры (Tan et al., 2016). Выявленные гены функционально связаны с формированием цитоскелета, развитием сосудов, органов и метаболизмом всего организма. Было также показано, что степень гипометилирования генома в эмбрионах КРС более выражена при увеличении длительности их культивирования in vitro (Salilew-Wondim et al., 2015).

Влияние культивирования in vitro на изменения в профиле экспрессии генов и эпигеноме эмбрионов человека

Значительное влияние состава культуральной среды на профиль экспрессии генов показано и на эмбрионах людей (Kleijkers et al., 2015). В частности, было выявлено, что культивирование ранних зародышей человека в достаточно простой среде HTF по сравнению с богатой многокомпонентной средой Vitrolife G5 Plus приводит на стадии бластоцисты к значительному изменению экспрессии 951 гена, большинство которых ассоциированно с апоптозом, деградацией белка, метаболизмом и контролем клеточного цикла, что, в частности, выражается в двукратном снижении частоты имплантации (Kleijkers et al., 2015). Очевидно, что стадия развития эмбриона и возраст донора играют заметную роль в наблюдаемых изменениях транскриптома при сравнении вышеупомянутых культуральных сред (Mantikou et al., 2016). Однако такой результат являлся вполне ожидаемым, поскольку среда HTF предназначена лишь для дозревания ооцитов и, собственно, оплодотворения. Намного больший интерес представляют собой сравнение влияния сред, предназначенных для культивирования эмбрионов со стадии зиготы до момента переноса эмбриона в матку, на транскриптом бластоцист одного класса, однако, в связи с этическими ограничениями, проведение таких исследований затруднено. Морбек с коллегами (2017) провели детальные исследования состава культуральных сред CSC, Global, G-TL и 1-Step, которые используются в репродуктивной медицине (Morbeck et al., 2017). Было показано, что эти среды существенно различны по концентрации пирувата, лактата и составу аминокислот (Morbeck et al., 2017). Более того, было обнаружено, что состав сред, а также концентрация кислорода, достоверно влияет на процент развития бластоцист (Morbeck et al., 2017).

Стоит отметить, что в упомянутых работах подчеркивается выраженная стохастичность наблюдаемых изменений в транскриптоме и эпигеноме эмбрионов, что может также отражать значительное влияние других биологических факторов на системы регуляции экспрессии генов ранних зародышей, помимо условий их культивирования (Mani, Mainigi, 2018; Ramos-Ibeas et al., 2019). Более детально влияние различных факторов культивирования на эпигеном эмбриона описано в соответствующих обзорных работах (Mani, Mainigi, 2018; Ramos-Ibeas et al., 2019).

Влияние культивирования in vitro ранних эмбрионов млекопитающих на их постимплантационное развитие

Условия оплодотворения и раннего преимплантационного развития эмбриона in vivo и in vitro существенно отличаются друг от друга (Summers, Biggers, 2003). Различные компоненты питательных сред и другие факторы культивирования способны нарушить формирование бластоцисты, вызвать уменьшение числа клеток во внутренней клеточной массе и изменения в экспрессии генов, которые впоследствии могут повлиять на течение беременности (Ramos-Ibeas et al., 2019). В частности, после процедуры ЭКО с последующим культивированием преимплантационных эмбрионов мыши на таких питательных средах как KSOMаа и Whitten’s, повышается частота выкидышей (Delle Piane et al., 2010). Однако, в другой работе после культивирования эмбрионов мышей по 13 протоколам, используемым в настоящее время в клинике, не было отмечено повышенной частоты выкидышей (Schwarzer et al., 2012). Более того, в некоторых протоколах было отмечено снижение этого явления (Schwarzer et al., 2012). Также у разных видов млекопитающих после применения ВРТ, в том числе после культивирования in vitro, обнаруживается ограничение роста плода на ранних сроках беременности, однако, на более поздних ее этапах, наблюдается как значительное увеличение размера плаценты, так и ускорение развития плода (Delle Piane et al., 2010; Bloise et al., 2012, 2014). Это компенсаторное увеличение размеров плаценты в ответ на внутриутробную задержку роста у зародышей после применения ВРТ обеспечивает, вероятно, дополнительную поддержку плода (Bloise et al., 2014).

Противоречивые данные получены на мышах по влиянию ВРТ, и, в частности, культивирования in vitro, на изменение уровня апоптоза в плаценте (Raunig et al., 2011; Bloise et al., 2012). Одни исследователи показали усиление апоптоза после процедур ЭКО или интрацитоплазматической инъекции сперматозоида – ИКСИ (Raunig et al., 2011), другие такого изменения не обнаружили (Bloise et al., 2012). Также показана связь ВРТ с изменениями в транскриптоме плаценты у мышей (Delle Pianne et al., 2010; Fauque et al., 2010), а также снижением плотности кровеносных сосудов в ней у КРС (Miles et al., 2005). Исходя из вышесказанного, можно заключить, что воздействия, которым подвергается преимплантационный эмбрион при проведении ВРТ, в частности, в период культивирования in vitro, оказывают влияние на дальнейшее пренатальное развитие плода, а также, как показывают другие исследования, могут иметь отдаленные последствия в постнатальном онтогенезе у животных (Duranthon, Chavatte-Palmer, 2018; Sunde, 2019).

Влияние культивирования in vitro эмбрионов человека на их постимплантационное развитие

Влияние ВРТ на постимплантационное развитие было показано и у человека, при этом отклонения были подобны тем, что обнаружены на животных, в частности, в некоторых случаях, наблюдалась внутриутробная задержка роста плода, компенсаторное увеличение размеров плаценты и вероятность возникновения микрокальцинаций (Joy et al., 2012; Haavaldsen et al., 2012; Nelissen et al., 2013). Однако, частота спонтанных абортов при применении ВРТ в целом оставалась такой же, как и после естественного зачатия, хотя данных, включающих в себя сопутствующие факторы материнского возраста и другие, недостаточно, чтобы сделать однозначный вывод (Bloise et al., 2014). Новорожденные, зачатые с использованием ВРТ, чаще рождаются преждевременно и имеют низкую массу тела при рождении по сравнению с зачатыми естественным путем (Pandey et al., 2012; Wennerholm et al., 2020). Перинатальная смертность и врожденные аномалии в таких случаях также встречаются достоверно чаще, чем при спонтанной беременности (Pandey et al., 2012).

Несколько работ посвящено сравнению различных протоколов культивирования эмбрионов, которые используются в настоящее время в клинике, на внутриутробное развитие и перинатальные исходы (Zandstra et al., 2015). Однако, из 11 работ по этой теме, только в пяти было показано, что среды разных производителей могут влиять на массу тела ребенка при рождении, в шести эффекта не наблюдали (Zandstra et al., 2015).

Таким образом, качественный и количественный состав питательной среды, предназначенной для культивирования in vitro эмбрионов различных видов млекопитающих, в том числе и человека, а также другие условия, например, парциальное давление кислорода, могут оказывать влияние на эффективность развития преимплантационных зародышей. Исследования в данном направлении до сих пор являются актуальными, и нуждаются в продолжении.

Перинатальные характеристики

Исследования последствий применения ВРТ на человеке прежде всего сосредоточены на показателях беременности и живорождений. Дети, зачатые с помощью ВРТ, несколько чаще рождаются недоношенными и имеют низкий для гестационного возраста вес, а также повышенный риск врожденных пороков развития (D’Angelo et al., 2011; Pinborg et al., 2013; Sunkara et al., 2019). Первоначально считалось, что это связано с многоплодной беременностью, но недавно эти риски также подтверждены по сравнению с естественно зачатыми и при одноплодной беременности (Pandey et al., 2012; Wennerholm, Bergh, 2020). Повышенные риски возникновения неблагоприятных перинатальных исходов после применения методов ВРТ связаны, по-видимому, со многими факторами (Sunkara et al., 2019). Ряд исследований указывает на связь неблагоприятных перинатальных исходов с субфертильностью пациентов (Jaques et al., 2010; Hayashi et al., 2012) возрастом родителей (Kahveci et al., 2018; Pinheiro et al., 2019). Между тем, различия по перинатальным исходам между спонтанными и полученными с помощью ВРТ беременностями сохраняются и после исключения влияния данных факторов (Pinborg et al., 2013), что может свидетельствовать о вкладе именно манипуляций в ходе ВРТ.

В частности, такой необходимый этап ВРТ, как овариальная стимуляция может оказывать негативное влияние на перинатальные исходы, даже в случае применения ее у женщин перед естественным зачатием (Klemetti et al., 2010; D’Angelo et al., 2011; Labarta et al., 2014). Одним из подходов является сравнение естественных и полученных с помощью ВРТ беременностей у одной и той же женщины. Такие исследования показывают повышенный риск преждевременных родов после применения ВРТ по сравнению с естественным зачатием (Pinborg et al., 2013), следовательно, факторы, связанные с гормональной стимуляцией и/или методами ВРТ, также могут играть важную роль. Интересную работу проделала немецко-британская группа, в которой была проанализирована выборка женщин, родивших первого ребенка после ИКСИ, а второго после применения данной процедуры, так и в результате естественного зачатия (Ludwig et al., 2008). Не было установлено достоверных отличий по продолжительности беременности, а также по весу новорожденных в обеих группах (Ludwig et al., 2008). В другой работе этих же исследователей было показано повышение частоты крипторхизма у мальчиков, рожденных после ИКСИ, по сравнению с естественно зачатыми (Ludwig et al., 2009a). Однако не было обнаружено никаких существенных различий по остальным показателям здоровья, в том числе по неврологическим отклонениям, двигательным навыкам, эмоциональному развитию и интеллекту (Ludwig et al., 2009a, 2009b).

Эпигенетические нарушения

Применение методов ВРТ сопряжено с потенциально чувствительным к воздействиям окружающей среды периодом эпигенетического перепрограммирования. Так, первая волна деметилирования-реметилирования происходит во время гаметогенеза, а вторая в течение преимплантационного развития (Zacchini et al., 2019). Анализ уровней метилирования некоторых генов в плаценте показал, что различия метилирования ДНК у детей, зачатых естественным путем и при помощи ВРТ, наблюдаются независимо от наличия родительского бесплодия (Song et al., 2015). Эпигенетические изменения связанные, вероятно, с культивированием in vitro, наблюдались также в человеческих гаметах и эмбрионах (El Hajj, Haaf, 2013). Было продемонстрировано, что экспрессия генов в преимплантационных зародышах изменяется в зависимости от культуральной среды, используемой для ЭКО и последующего in vitro культивирования (Kleijkers et al., 2015). Однако в другом исследовании пришли к выводу, что на глобальный профиль экспрессии генов в эмбрионе человека большее влияние оказывают такие факторы, как стадия развития эмбрионов и материнский возраст, а не тестируемая среда и условия культивирования (Mantikou et al., 2016).

ВРТ-ассоциированные изменения метилирования ДНК найдены в регионах дифференциально метилированной области (DMR), которые импринтированы во время гаметогенеза и эмбрионального развития (Hiura et al., 2014). По данным метаанализа Лазаравициут с соавторами (2014), болезни геномного импринтинга, группа редких врожденных расстройств, возникают несколько чаще после применения ЭКО (Lazaraviciute et al., 2014). Установлено, что ВРТ ассоциированы с более высокой вероятностью развития заболеваний, обусловленных нарушениями геномного импринтинга, таких синдромов как Беквита-Видемана (СБВ), Ангельмана, Прадера-Вилли и Сильвера-Рассела (Hattori et al., 2019). Однако в клинической практике это не имеет большого значения. Например, СБВ остается крайне редким заболеванием даже при десятикратном увеличении риска у детей, рожденных после применения ВРТ (Mussa et al., 2017).

Одним из факторов, связанным с нарушением геномного импринтинга является мужская субфертильность. Метаанализ из 24 исследований показал значительное гипометилирование импринтированного гена H19, а также гиперметилирование SNRPN и MEST в сперматозоидах мужчин с идиопатическим бесплодием по сравнению с фертильным контролем (Santi et al., 2017). Другим фактором, который может влиять на эпигенетическое перепрограммирование в ооцитах, является гормональная индукция овуляции (Sato et al., 2007; Marshall, Rivera, 2018). Однако исследования ооцитов на людях ограничены в связи с небольшим количеством материала и недостатком подходящего контроля, с учетом возраста и общего расстройства оогенеза. Показано, что ооциты на стадии GV и MI, полученные от субфертильных женщин в результате гормональной стимуляции яичников, имеют увеличение метилирования гена H19 и потерю метилирования в гене PEG1 (Sato et al., 2007). Кроме того, необходимо учитывать влияние материнского возраста на эпигеном, поскольку известно, что поздний репродуктивный возраст связан с аберрантным глобальным метилированием ДНК в ооцитах и эмбрионах (Marshall, Rivera, 2018). В исследовании Хиура с соавторами (2014) обнаружен клеточный мозаицизм по уровням метилирования у детей с болезнями геномного импринтинга, зачатых с помощью ВРТ, что позволяет предположить, что эти изменения происходят во время первых делений клеток в период культивирования эмбрионов in vitro (Hiura et al., 2014). Таким образом, до сих пор неизвестно, когда возникают ошибки геномного импринтинга и какие факторы предрасполагают к эпигенетическим изменениям. Однако, имеется четкая ассоциация между применением ВРТ и специфическими нарушениями импринтинга.

Метаболический синдром

Предпосылки к возникновению у людей отклонений в работе сердечно-сосудистой системы, а также заболеваний, связанных с нарушениями метаболизма, зачатых с использованием ВРТ, отмечали еще с тех пор, когда гипотеза DOHaD была применена к преимплантационному периоду (Fleming et al., 2015, 2018). На протяжении более 40 лет у полученных в результате применения ВРТ потомков было исследовано состояние сердечно-сосудистой системы, сначала у детей, затем подростков и молодых взрослых (Ceelen et al., 2008; Scherrer et al., 2012; Guo et al., 2017; Meister et al., 2018; Halliday et al., 2019).

В одной из первых работ у детей препубертатного возраста (12 лет) было обнаружено небольшое, но достоверное повышение систолического артериального давления (САД) – 109 ± 11 у детей после ВРТ по сравнению с 105 ± 10 мм рт. ст. у естественно зачатых, и диастолического артериального давления (ДАД) – 61 ± 7 у рожденных с применением ВРТ детей по сравнению с 59 ± 7 мм рт. ст. у естественно зачатых (Ceelen et al., 2008). Стоит отметить, что в данной работе в качестве контроля использовалась выборка детей, рожденных у субфертильных родителей, таким образом, влияние родительского фактора бесплодия было исключено (Ceelen et al., 2008). Однако, несмотря на то что показатели АД были повышены, они оставались в пределах нормы для детей такого возраста (Ceelen et al., 2008).

В систематическом обзоре Гуо с соавторами (2017) был проведен метаанализ данных по артериальному давлению, включающих в себя выборку из 872 детей, зачатых в циклах ЭКО-ИКСИ и 3034 детей, зачатых естественных путем из 10 клинических исследований, в котором была обнаружена небольшая, но достоверная средневзвешенная разница в 1.88 мм рт. ст. по САД, и 1.52 мм рт. ст. по ДАД (Guo et al., 2017). Однако показатель гетерогенности в группах был довольно высоким. Между тем, этот показатель значительно снизился, когда авторы метаанализа стратифицировали выборки по году рождения. Это позволило выявить интересную особенность – дети, рожденные в 1990–1999 гг., имели достоверное повышение как САД (3.75 мм рт. ст.), так и ДАД (2.70 мм рт. ст.), в отличие от группы детей, рожденных в 2000–2009 гг. (0.186 мм рт. ст. – разница по САД и 0.19 мм рт. ст. – разница по ДАД). В дальнейшем авторы оценили вклад факторов более молодого возраста и преобладающего числа детей, зачатых с использованием именно ИКСИ, в 2000–2009 гг., но не обнаружили их влияния. Авторы предположили, что совершенствование программ ВРТ с течением времени, в том числе протоколов стимуляции овуляции и условий культивирования эмбрионов, внесли свой вклад в нивелирование различий по показателям АД между группами (Guo et al., 2017).

В этом же обзоре представлен метаанализ метаболических показателей, таких как уровень инсулина натощак, уровень глюкозы и липидный профиль у детей, зачатых с использованием ВРТ. Кроме того, объединены и проанализированы данные исследований по индексу массы тела (ИМТ), который является одним из диагностических критериев метаболического синдрома (Guo et al., 2017). Метаанализ семи исследований показал, что у детей, зачатых с помощью ЭКО/ИКСИ (n = 477), наблюдается более высокий уровень инсулина натощак по сравнению с естественно зачатыми детьми (n = 185), но не меняется уровень глюкозы и индекс инсулинорезистентности (Guo et al., 2017). Метаанализ данных пяти исследований показал, что дети, рожденные в результате ВРТ (n = 332), имели статистически более низкий уровень липопротеинов низкой плотности по сравнению с детьми, рожденными в результате естественного оплодотворения (n = 1701), в то время как уровень липопротеинов высокой плотности не отличался между группами. Таким образом, дети после ВРТ, имели более благоприятный липидный профиль (Guo et al., 2017). Данные 14 исследований, сообщавших об ИМТ (суммарная выборка составила 1914 детей после ЭКО-ИКСИ и 3881 естественно зачатых), были объединены и проанализированы в том же обзоре: оказалось, что разницы по данному показателю между группами не наблюдалось (Guo et al., 2017).

Интересные результаты были представлены в недавней работе, авторы которой проанализировали уровни важного компонента липидного гомеостаза – пропротеинконвертазы субтилизин/кексин 9 типа (PCSK9) в плазме крови у детей, зачатых с использованием ВРТ (n = 73) и естественно рожденных (n = 73) (Vlachopoulos et al., 2019). Было показано, что уровень PCSK9 возрастает с возрастом (в пределах двух лет, от восьми до десяти) у детей, рожденных после ВРТ, в то время как у естественно зачатых, напротив, снижается (Vlachopoulos et al., 2019). Возрастание уровня PCSK9 приводит к постепенному ухудшению липидного профиля у таких детей, что ведет к возрастанию рисков сердечно-сосудистых заболеваний (Vlachopoulos et al., 2019). Результаты данного исследования подчеркивают роль показателей липидного обмена как ранних индикаторов скрытых кардиометаболических нарушений в соответствии с методом зачатия (Vlachopoulos et al., 2019). Однако стоит отметить, что размер выборок был небольшим, и не был учтен вклад дополнительных факторов. Для того чтобы сделать однозначный вывод, необходимы дальнейшие исследования с большим размером выборок.

Помимо показателей АД, исследователями изучались структурно-функциональные особенности сердечно-сосудистой системы у детей, зачатых с использованием ВРТ (Scherrer et al., 2012; Valenzuela-Alcazar et al., 2013; Von Arx et al., 2015). В одной из этих работ показано проявление признаков как системной, так и легочной эндотелиальной дисфункции во время препубертатного периода (Scherrer et al., 2012). Позднее было показано, что изменения затрагивают не только АД и функцию сосудов, но и структуру сердца (Valenzuela-Alcazar et al., 2013; Von Arx et al., 2015). Были выявлены признаки ремоделирования сердца и сосудов у плодов и младенцев, зачатых с использованием ВРТ (Valenzuela-Alcazar et al., 2013). Следует отметить, что в данной работе различия между группами сохранялись даже после исключения из выборки детей с низкой массой тела при рождении, так как известно, что фетальное ремоделирование сердца ассоциировано с внутриутробной задержкой роста и соответственно низкой массой тела плода (Valenzuela-Alcazar et al., 2013). Таким образом, авторы предположили, что различия были связаны непосредственно с применением ВРТ, а не перинатальными факторами (Valenzuela-Alcazar et al., 2013). Недавно этой же группой исследователей было показано, что выявленные различия сохраняются до возраста трех лет (Valenzuela-Alcazar et al., 2019).

Однако вопрос о различиях на более поздних этапах жизни все еще остается дискуссионным: некоторые исследователи сообщают о дисфункции левого желудочка у детей 4–5 лет (Zhou et al., 2014; Liu et al., 2015), другие – о дисфункции правого желудочка у детей 12 лет, но проявляющейся только в стрессовых условиях (Von Arx et al., 2015). В недавнем исследовании на предмет признаков эндотелиальной дисфункции и мониторинга АД были протестированы дети подросткового возраста (средний возраст – 16.5 лет) (Meister et al., 2018). Стоит отметить, что в этой работе исследовалась та же когорта детей, что и в предыдущем исследовании с использованием таких же методов; выборки были выравнены по массе тела при рождении и гестационному возрасту, ни у кого из матерей детей из этих выборок не было осложнений беременности, которые бы могли внести свой вклад в отклонение от нормальных параметров функционирования сердечно-сосудистой системы (Scherrer et al., 2012). Оказалось, что спустя пять лет признаки системной эндотелиальной дисфункции у детей сохранялись примерно в той же мере (Meister et al., 2018). Более того, 8 из 52 детей в группе ВРТ уже в этом возрасте подходили под критерии артериальной гипертензии первой степени (АД > 130/80 мм рт. ст.). Следует отметить, что в данной работе были исключены недоношенные дети и с низкой массой тела при рождении. Однако ограничениями в этой работе являлся сравнительно небольшой размер выборки (54 человека в группе ВРТ и 40 в контроле), а также то обстоятельство, что все дети являлись пациентами одной клиники (Meister et al., 2018). В противоположность данному исследованию, у молодых людей (22–35 лет) в Австралии в выборках из 193 человек в группе ВРТ и 86 в контрольной группе не было обнаружено каких-либо отклонений в параметрах работы сердечно-сосудистой системы (Halliday et al., 2019).

В связи с тем, что в клинических исследованиях выборки являются неоднородными вследствие влияния огромного числа факторов, вклад которых зачастую невозможно учесть в человеческой популяции, на данном этапе сложно вычленить влияние именно ВРТ, а тем более этапа культивирования эмбрионов. Тем не менее, следует более внимательно отнестись к состоянию здоровья и проводить мониторинг состояния сердечно-сосудистой системы у людей, зачатых в циклах ВРТ. Так как многие из выявленных признаков хоть и находятся в пределах нормы для данных возрастов, но являются прогностическими критериями заболеваний в будущем. Механизмы, лежащие в основе таких отклонений, до сих пор остаются неясными, однако если принять во внимание исследования на лабораторных моделях, можно предположить, что одной из причин могут быть специфические изменения в паттернах экспрессии генов в системах регуляции АД (Wang et al., 2018).

Таким образом, в настоящее время накоплены данные по состоянию здоровья детей, рожденных после стандартного комплекса процедур ВРТ, состоящего обычно из ЭКО, либо ИКСИ с последующим культивированием in vitro и переносом эмбрионов. У некоторых детей, выявлены ВРТ-ассоциированные отклонения в сердечно-сосудистой, нервной и других системах организма, у них отмечают более высокие показатели систолического и диастолического давления, уровня глюкозы (Ceelen et al., 2008) и инсулина в крови (Guo et al., 2017), снижение периферической чувствительности к инсулину (Chen et al., 2014), а также более высокий коэффициент риска возникновения диабета (Kettner et al., 2016). Помимо этого, у них могут возникать изменения когнитивных способностей и интеллекта (Sandin et al., 2013; Liu et al., 2017).

Заболевания центральной нервной системы

Несмотря на то, что исследований, в которых пытались установить причинно-следственную связь между применением ВРТ и возникновением неврологических расстройств у детей достаточно много (Klemetti et al., 2006; Maimburg, Vaeth, 2007; Kallen et al., 2010; Sandin et al., 2013; Liu et al., 2017), лишь в нескольких из этих работ обнаружены предпосылки ее существования. В частности, противоречивые результаты были получены при попытках найти взаимосвязь между применением ВРТ и частотой возникновения детского церебрального паралича – ДЦП (Klemetti et al., 2006; Kallen et al., 2010). В одном из исследований было показано повышение риска возникновения этой патологии после применения ЭКО (Klemetti et al., 2006), однако в другой работе среди одноплодных беременностей статистически достоверного влияния этого фактора обнаружено не было, тем не менее исследователи показали более высокий риск развития ДЦП при вынашивании двойни (Kallen et al., 2010).

Противоречивые результаты были получены и по расстройствам аутистического спектра – РАС (Maimburg, Vaeth, 2007; Lehti et al., 2013; Sandin et al., 2013; Liu et al., 2017). В ранней работе на относительной небольшой выборке (976 человек) из Дании, за период 1990–1999 гг., было обнаружено снижение риска возникновения аутизма у детей после ВРТ на 59% по сравнению с зачатыми естественным путем (Maimburg, Vaeth, 2007). В другом более позднем исследовании, проведенный анализ истории болезней 16582 детей из Финляндии (рожденных в период 1991–2005 годы), не выявил достоверного влияния ЭКО на частоту РАС (Lehti et al., 2013). Однако наблюдалась достоверная связь данной процедуры с синдромом Аспергера у мальчиков (Lehti et al., 2013). Важно отметить, что работы, связанные с исследованием влияния ВРТ на здоровье, в частности, на развитие нервной системы потомков, довольно гетерогенны по дизайну (Rumbold et al., 2017), например, исследовали смешанные группы детей, не разделенных по способу зачатия – ЭКО/ИКСИ (Pinborg et al., 2003).

Одна из первых работ, в которой разделили группы по способу зачатия (ЭКО или ИКСИ), была проведена в Швеции на обширной выборке более 2.5 миллиона человек, рожденных 1982–2007 гг. (Sandin et al., 2013). В данной работе было обнаружено незначительное повышение риска развития РАС, а также умственной отсталости, у детей, зачатых с использованием более инвазивного метода – ИКСИ, по сравнению с зачатыми путем применения традиционного ЭКО (Sandin et al., 2013). В дальнейшем, этот результат был подтвержден в работе, в которой изучали последствия применения ВРТ в клиниках США (Kissin et al., 2015). Авторы выявили, что 0.9% детей, рождались с данным диагнозом после ИКСИ и 0.6% после ЭКО (Kissin et al., 2015). В других работах исследователи не выявили различий в неврологических функциях и когнитивных способностях у детей после ЭКО/ИКСИ и одноплодной беременности (Place, Englert, 2003; Ponjaert-Kristoffersen et al., 2004, 2005; Belva et al., 2007; Leunens et al., 2008; Wagenaar et al., 2008). В бельгийской работе на выборке из 66 детей, зачатых с помощью ИКСИ, 52 после ЭКО и 59 в контроле не было выявлено значительных отличий при сравнении этих групп между собой в возрасте трех и пяти лет по вербальным навыкам и IQ, но только при учете уровня родительского образования (Place, Englert, 2003). Другая группа исследователей из Бельгии позднее также не обнаружила значительных отличий по неврологическим показателям у детей в возрасте восьми лет, рожденных после ИКСИ (n = 150) по сравнению с естественно зачатыми (n = 147), кроме незначительных изменений в тестах на баланс и диадохокинез, которые ВРТ-группа выполняла несколько хуже (Belva et al., 2007). Однако, в тесте на касание кончиков пальцев дети, зачатые с помощью ИКСИ, имели лучшие показатели (Belva et al., 2007). В интернациональном исследовании (на выборке из трех стран мира) при сравнении детей в дошкольном возрасте, рожденных после ИКСИ (300 человек) и естественно зачатых (260 человек) также не было обнаружено различий по итогам теста Векслера (Ponjaert-Kristoffersen et al., 2004). Позднее эта же группа на выборке детей пятилетнего возраста из пяти европейских стран (ИКСИ, ЭКО и контроль: 511, 424 и 488 человек, соответственно) показала, что способ зачатия (ЭКО или ИКСИ) не оказывает влияние на интеллектуальное развитие ребенка (Ponjaert-Kristoffersen et al., 2005). Тем не менее, авторы уточняют, что такие факторы, как возраст и образование матери могут влиять на когнитивное развитие детей, рожденных с помощью ВРТ, по сравнению с естественно зачатыми (Ponjaert-Kristoffersen et al., 2005). Эта же группа позднее показала, что дети в возрасте восьми лет, рожденные в Бельгии, из группы ВРТ (n = 151) имели более высокий показатель IQ по сравнению с контролем (n = 153); авторы связывают это с более высоким уровнем образования их матерей (Leunens et al., 2006). Тем не менее, через два года у этих детей показатели интеллектуального развития выравнивались, что также может быть связано с ослаблением эффекта влияния матери (Leunens et al., 2008). В нидерландской работе, выполненной на выборке из школьников в возрасте 8–18 лет, было проведено исследование влияния ЭКО на когнитивные способности детей (Wagenaar et al., 2008). В результате не было выявлено достоверных отличий между группами ЭКО (n = 233) и контролем (n = 233) по успеваемости и умственным способностям (Wagenaar et al., 2008). Британские ученые показали, что дети, рожденные в результате ВРТ в возрасте трех и пяти лет, имели более высокие показатели вербальных способностей по сравнению с естественно зачатыми; однако к 11-ти годам эта разница нивелировалась (Barbuscia, Mills, 2017). Данные из представленных работ свидетельствуют в пользу того, что в человеческом обществе более важную роль для формирования когнитивных способностей у ребенка играют социальные факторы в семье, нежели возможное влияние процедуры ВРТ.

В 2017 г. был опубликован первый метаанализ, который включал в себя три популяционных исследования и восемь исследований типа “случай-контроль”, проведенные за период 2006–2015 гг., на разнородной выборке из более восьми миллионов детей, который подтвердил связь применения ВРТ с незначительным повышением риска возникновения РАС у потомков (Liu et al., 2017). Четыре из взятых в анализ исследований были проведены в Европе, четыре в Америке и три в Азии. В работах, которые вошли в данный метаанализ оценивалось влияние либо в целом ВРТ, либо ЭКО или ИКСИ по отдельности. В целом, результаты метаанализа показали, что использование ВРТ может приводить к повышению частоты РАС у детей. Кроме того, в европейских странах, а также среди азиатского населения показана достоверная связь между ВРТ и риском развития РАС. Авторы метаанализа предполагают, что возможно эпигенетические изменения, возникающие вследствие манипуляций с гаметами и эмбрионами, гормональной стимуляции, замораживанием и культивированием эмбрионов и других процедур ВРТ лежат в основе выявленного феномена (Liu et al., 2017). Однако, для подтверждения данной гипотезы, необходимо проведение молекулярно-генетического анализа эмбрионов, полученных in vitro (Liu et al., 2017).

Приведенный обзор литературных источников демонстрирует, что данные о влиянии ВРТ на развитие заболеваний ЦНС у людей весьма противоречивы и сложно интерпретируемы. Кроме того, важную роль в постнатальной жизни ребенка играет материнский фактор, здоровье и возраст родителей, а также их уровень образования (Ponjaert-Kristoffersen et al., 2005; Barbuscia, Mills, 2017). Поэтому, для того чтобы корректно оценить влияние тех или иных репродуктивных процедур на перинатальные исходы, необходимо исключить влияние негативных материнских факторов (Sunkara et al., 2019). Исходя из этого, для понимания воздействия данных технологий на организм потомков создают экспериментальные модели на животных (Ramos-Ibeas et al., 2019).