Онтогенез, 2021, T. 52, № 5, стр. 345-366

Источник сперматозоидов для криобанка семени хищных

Извлечение сперматозоидов из эпидидимисов является достаточно распространенным способом их получения у представителей хищных (Luvoni, 2006). Этот метод практикуют и в настоящее время, особенно по отношению к домашним котам, поскольку эпидидимисы взрослых котов доступны в ветеринарных клиниках после процедур плановой стерилизации (Brusentsev et al., 2018). Эпидидимальное семя также может быть получено и у диких видов хищных, как правило, post-mortem или после стерилизации по медицинским показаниям. Так, было успешно криоконсервировано эпидидимальное семя бенгальского тигра (Cocchia et al., 2009).

Между тем, “золотым стандартом” получения семени по отношению к представителям отряда Carnivora является электроэякуляция, которую успешно применяют по отношению к кошачьим (Donoghue et al., 1992; Amstislavsky et al., 2018), псовым (Johnson et al., 2014; Van den Berghe et al., 2018; Yatu et al., 2018), куньим (Van der Horst et al., 2006) и медвежьим (Anel-Lopez et al., 2017; Cai et al., 2018). В большинстве рассматриваемых нами работ на диких представителях отряда хищных исследователи используют именно эякуляторное семя (табл. 1, 2).

Весьма перспективным является также использование уретральной катетеризации для получения семени у различных диких представителей отряда хищных (Lueders et al., 2012, 2014; Kheirkhah et al., 2017; Jeong et al., 2018; Franklin et al., 2018). Между тем, в исследовании на рыжем волке было продемонстрировано, что семя, взятое с использованием уретральной катетеризации, обладало худшими характеристиками подвижности и меньшим объемом по сравнению с эякуляторным (Franklin et al., 2018). Образцы уретрального семени, полученного у азиатской золотой кошки, обладали меньшим объемом, но большей концентрацией сперматозоидов при сходных процентах подвижности по сравнению с электроэякуляторным семенем (Lueders et al., 2014). Похожие результаты были получены при применении уретральной катетеризации к африканскому льву, камышовому и дальневосточному лесному коту (Lueders et al., 2012; Kheirkhah et al., 2017; Jeong et al., 2018).

Также успешно используется на кошачьих и мануальный метод, хотя проигрывает электроэякуляции по объему полученного эякулята, превосходит ее по количеству и подвижности сперматозоидов (Buranaamnuay, 2017). Однако, данный метод получения эякулята подразумевает использование искусственной вагины и требует определенной тренировки как персонала, так и самого животного, что может быть проблемой при работе с дикими особями (Zambelli, Cunto, 2006). Следует отметить, что для домашних псов наиболее предпочтительным методом получения семени является именно мануальный способ (Nunez-Martinez et al., 2006).

Анализ литературы позволяет сделать заключение о том, что способ получения семени влияет на некоторые морфологические и функциональные показатели семени, как до, так и после криоконсервации. В частности, целостность акросомы в эпидидимальном семени как до, так и после криоконсервации, ниже по сравнению с таковым, полученным в результате электроэякуляции (Luvoni, 2006). Также целостность акросом ниже и в сперматозоидах, полученных с помощью уретральной катетеризации, по сравнению с таковыми, полученными в результате электроэякуляции (Franklin et al., 2018). Плюсом применения электроэякуляции по сравнению с уретральной катетеризацией является больший объем получаемого семени (Lueders et al., 2014; Franklin et al., 2018). Однако по имеющимся литературным данным можно сделать вывод, что мануальный метод с использованием искусственной вагины, а также применение уретральной катетеризации имеют лучшие показатели по числу сперматозоидов и их подвижности, по сравнению с электроэякуляцией (Lueders et al., 2014; Buranaamnuay, 2017).

Этапы криоконсервации сперматозоидов и подбор криопротекоров

Данные по криоконсервации сперматозоидов диких представителей отряда хищных с использованием стандартных протоколов представлены в табл. 1. Приведенные в табл. 1 результаты свидетельствуют об эффективности криоконсервирования семени разных видов семейства кошачьих, псовых, куньих и медведей. За исключением медведей, у которых отсутствуют доместицированные виды, перед применением в отношении представителей дикой фауны, характерные для разных семейств хищных особенности криоконсервации семени изучают на домашних видах, а именно – домашних котах (Cheuqueman et al., 2018), домашних псах (Qamar et al., 2019) и домашних хорьках (van der Horst et al., 2009).

Криоконсервация сперматозоидов стала успешной после открытия криопротективных свойств глицерина (Polge et al., 1949). В настоящее время список криопротекторов, которые успешно применяют для криоконсервации гамет и эмбрионов, достаточно велик (Амстиславский и др., 2015; Elliott et al., 2017; Rajan, Matsumura, 2018). Криопротекторы разделяют на проникающие и не проникающие в клетки (Shaw, Jones, 2003). Малые (мол. масса <100) гидрофильные, проникающие в мембрану соединения, способные создавать водородную связь с молекулами воды и образовывать водородные связи, например, с белком (вместо молекулы воды), особенно эффективны в качестве криопротекторов. Наличие таких соединений в водных растворах снижает температуру образования льда (Shaw, Jones, 2003).

Для семени всех перечисленных видов сначала проводят пробоподготовку, состоящую из нескольких стадий. На первом этапе обычно производят смешивание образца семени с разбавителем, либо не содержащим основной проникающий криопротектор, либо содержащий этот криопротектор в концентрации ниже финальной, после чего смесь охлаждают до 4–5°C с последующим выдерживанием при заданной температуре в течение 1–3 ч (Van der Horst et al., 2009; Bateman, Swanson, 2017; Franklin et al., 2018; Yatu et al., 2018). В некоторых случаях, однако, этот этап эквилибрации осуществляют без добавления в разбавитель проникающего криопротектора, заменяя его на непроникающие, в частности, на глюкозу, лактозу или трегалозу (Karja et al., 2016). Иногда на первом этапе проникающий криопротектор добавляют уже в финальной концентрации (Johnson et al., 2014; Erdmann et al., 2019). На втором этапе полученную суспензию сперматозоидов смешивают со вторым разбавителем, содержащим основной проникающий криопротектор в достаточно высокой концентрации (6–16%), так, чтобы финальная концентрация основного криопротектора в смеси составила 3–8%.

Как показано, в подавляющем большинстве работ по криоконсервации сперматозоидов представителей отряда хищных в качестве основного криопротектора используют глицерин, реже – диметилсульфоксид (ДМСО) (табл. 1). При этом практически всегда в качестве дополнительного компонента криопротективной смеси используют яичный желток в концентрации 20%, заменяя его иногда на соевый лецитин. Во многих из приведенных в табл. 1 работах, наряду с основным проникающим криопротектором и яичным желтком, в криопротективную смесь добавляют непроникающие криопротекторы, такие как глюкоза (Franklin et al., 2018), фруктоза (Anel-Lopez et al., 2017; Franklin et al., 2018; Van den Berghe et al., 2018), лактоза (Karja et al., 2016) и раффиноза (Yatu et al., 2018).

Кроме того, используют готовые фирменные разбавители семени для криоконсервации сперматозоидов хищных (табл. 2). Использование таких криопротекторных смесей имеет одно существенное достоинство – стандартизацию протоколов криоконсервации. На рынке есть фирменные разбавители семени для криоконсервации различных видов млекопитающих, преимущественно человека и домашних или сельскохозяйственных животных. Для представителей отряда хищных хорошо зарекомендовали себя CaniPlus Freeze от немецкой компании Minitube (Sichtar et al., 2015; Amstislavsky et al., 2018; Brusentsev et al., 2018; Franklin et al., 2018), Freezing Medium TYB от Японско-Американской компании FUJIFILM Irvine Scientific (Ha et al., 2011; Terrell et al., 2012; Cai et al., 2018; Erdmann et al., 2019) и SpermFreeze от бельгийской компании FertiPro (Brusentsev et al., 2018).

После уравновешивания семени с криопротекторами его достаточно быстро охлаждают в парах жидкого азота (LN₂) до температуры ~–120°C (Van der Horst et al., 2009; Stasiak et al., 2014; Johnson et al., 2014; Bateman, Swanson, 2017; Cai et al., 2018; Van den Berghe et al., 2018; Yatu et al., 2018) или охлаждают с использованием программного замораживателя до –100°C с последующим погружением в жидкий азот (Anel-Lopez et al., 2017). В некоторых случаях используют сухой лед и охлаждают до ~–80°C (Donoghue et al., 1992; Stoops et al., 2007; Baudi et al., 2008; Howard et al., 2015; Franklin et al., 2018). В некоторых случаях семя сразу помещают в транспортировочный сосуд (dry shipper), где оно постепенно охлаждается до температуры ~–120°C (Stoops et al., 2007; Johnson et al., 2014). На последнем этапе контейнеры с замороженной суспензией сперматозоидов помещают в криохранилище, где их сохраняют при температуре –196°C.

Для представителей семейства кошачьих при криоконсервации семени используют в качестве контейнера пластиковые соломины, которые выдерживают в парах LN₂ (Amstislavsky et al., 2018; Brusentsev et al., 2018), иногда в качестве контейнера используют криопробирки, а для замораживания сухой лед (Donoghue et al., 1992; Baudi et al., 2008) или dry shipper (Stoops et al., 2007). Для замораживания семени различных видов семейства псовых применяют либо пластиковые соломины, которые выдерживают в парах LN₂ (Stasiak et al., 2014; Van den Berghe et al., 2018; Yatu et al., 2018) или dry shipper (Johnson et al., 2014), либо криопробирки и сухой лед (Franklin et al., 2018). Для криоконсервации семени представителей семейства куньих используют пластиковые соломины в качестве контейнера, которые выдерживают в парах LN₂ (Van der Horst et al., 2009), либо криопробирки и сухой лед (Howard et al., 2015; Bateman, Swanson, 2017). Для представителей семейства медвежьих при криоконсервации семени используют пластиковые соломины в качестве носителя и, либо выдерживают в парах LN₂ (Cai et al., 2018), либо применяют программное замораживание (Anel-Lopez et al., 2017).

Как видно из данных, приведенных в табл. 1, показатели жизнеспособности и подвижности семени после криоконсервации у исследованных видов хищных не сильно зависели от концентрации применяемого криопротектора (преимущественно глицерина в качестве основного криопротектора). Согласно литературным данным, способ охлаждения образцов семени (в парах азота, программное замораживание, на сухом льду, в драйшипере), также не оказывал критического влияния на результат криоконсервации. Между тем, наш собственный опыт работы с семенем кошачьих свидетельствует о том, что способ охлаждения образцов семени в парах азота является оптимальным, по крайней мере, при работе в условиях, приближенным к полевым, и более надежным по сравнению с охлаждением в драйшипере. Как видно из приведенных в табл. 2 данных, показатели эффективности криоконсервации семени представителей хищных с применением фирменных криопротективных смесей не сильно отличаются от таковых при применении самостоятельно изготовленных смесей на основе глицерина, используемых для тех же семейств хищных. Исключением, пожалуй, является Biladyl (Minitub, Germany), который показал заметное снижение подвижности и оплодотворяющей способности сперматозоидов пиренейской и рыжей рыси по сравнению с криопротекторными смесями, приготовленными экспериментаторами на основе глицерина (Ganan et al., 2009a, 2009b).

Способы оценки эффективности криоконсервации сперматозоидов

Для подбора наиболее эффективного протокола криоконсервации семя до и после замораживания оценивают по различным показателям, таким как жизнеспособность, подвижность, морфология сперматозоидов, а также их оплодотворяющая способность. В случае работы с дикими видами животных важно подбирать методы оценки, в том числе и для проведения в “полевых” условиях, где нет доступа к полноценной лаборатории. Использование таких методов возможно, если в наличии имеется, как минимум, световой микроскоп. Для комфортной работы со сперматозоидами большинства видов млекопитающих желательно увеличение 200× или более. Для характеристики морфологический аномалий сперматозоидов необходимо более сильное увеличение (1000×).

Жизнеспособность сперматозоидов различных видов млекопитающих, в том числе представителей отряда хищных, обычно оценивают по состоянию их плазматической мембраны, например, с помощью окрашивания образца смесью красителей эозина и нигрозина, при котором первый краситель проникает в сперматозоиды, но только в те, у которых повреждена мембрана, а второй создает темный фон, на котором лучше видно окрашенные сперматозоиды (Bjorndahl et al., 2003; Tipkantha et al., 2016). Альтернативно жизнеспособность сперматозоидов можно оценить с помощью гипоосмотического теста (Ramu, Jeyendran, 2012), при котором оценивается функциональная способность мембраны живых сперматозоидов поддерживать осмотическое равновесие в клетке. Данный тест, в частности, успешно применяется на сперматозоидах хищных (Silva et al., 2019). Помимо этого, применяют метод оценки с использованием флуоресцентных красителей SYBR Green I и йодистого пропидия (LIVE/DEAD тест), позволяющий получить информацию по процентному соотношению живых и мертвых сперматозоидов. В наших собственных исследованиях мы с успехом применяли эти методы для оценки жизнеспособности сперматозоидов кошачьих как на домашнем коте (Brusentsev et al., 2018), так и на дальневосточном лесном коте (Amstislavsky et al., 2018), а также на представителях рода Lynx (рис. 1).

Рис. 1.

Сперматозоид евразийской рыси (Lynx lynx) после криоконсервации, окрашенный смесью красителей эозина и нигрозина (Vital Screen, FertiPro, Бельгия). Красная окраска свидетельствует о том, что сперматозоид мертвый. Масштабная полоска: 20 мкм.

Очень важным параметром качества семени является подвижность сперматозоидов. С помощью камеры Маклера можно как в лабораторных, так и в полевых условиях оценить концентрацию сперматозоидов в образце, их общую, прогрессивную и непрогрессивную подвижность (Amstislavsky et al., 2018); в некоторых случаях используют сочетание гемоцитометра Нейбауэра (для определения концентрации) и определения процента подвижных сперматозоидов на предметном стекле (Ganan et al., 2009a, 2009b). Иногда прогрессивно подвижные сперматозоиды классифицируют по шкале от 0 до 5 и рассчитывают индекс подвижности сперматозоидов (ИПС) (Baudi et al., 2008).

Большое значение имеет и морфология сперматозоидов, которая может быть оценена окрашиванием сухого мазка с последующей световой микроскопией при большом увеличении (Amstislavsky et al., 2018; Franklin et al., 2018) или без окрашивания мазка, с применением фазового контраста (Tipkantha et al., 2016). В некоторых исследованиях дополнительно оценивают целостность акросомы окрашиванием сперматозоидов красителем кумасси бриллиантовым синим с последующей микроскопией (Larson, Miller, 1999; Ganan et al., 2009b).

Все вышеперечисленные показатели можно оценить более тщательно в условиях хорошо оборудованной лаборатории. Например, для оценки подвижности часто используют автоматические компьютерные системы (computer-assisted sperm analysis, CASA), которые рассчитывают не только процент подвижных сперматозоидов, но и скорость и траектории их движения (Luther et al., 2017). Также существуют автоматизированные системы для морфометрии сперматозоидов (Anel-Lopez et al., 2017). Оценку жизнеспособности сперматозоидов и целостности их акросом в лабораторных условиях можно проводить методом их окрашивания флуорохромами с последующим использованием флуоресцентной или конфокальной микроскопии (Amstislavsky et al., 2018; Van den Berghe et al., 2018). С помощью флуорохромов, например, JC-1 assay kit также можно оценить такие параметры, как активность митохондрий в сперматозоидах (Thuwanut et al., 2011).

Итоговой целью оценки параметров качества семени является определение его способности к оплодотворению (фертильность). Самым простым способом использования семени для оплодотворения является искусственное осеменение (ИО), однако такой способ весьма требователен к числу подвижных сперматозоидов в образце (Swanson et al., 2007). В случае работы с редкими и ценными видами хищных более экономичным выбором является экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) (Swanson et al., 2007). Для доместицированных видов хищных, в частности для домашней кошки, проще всего использовать гомологическое ЭКО, когда для проверки оплодотворяющей способности сперматозоидов домашнего кота ими экстракорпорально оплодотворяют ооциты домашней кошки (Brusentsev et al., 2018). Что касается диких видов хищных, то для проверки оплодотворяющей способности сперматозоидов после криоконсервации, технически проще использовать гетерологическое ЭКО. Между тем, возможность получения развивающихся эмбрионов путем гетерологического ЭКО продемонстрирована только для одного семейства отряда хищных – кошачьих. В частности, для оценки оплодотворяющей способности сперматозоидов красной рыси (Ganan et al., 2009b), пиренейской рыси (Ganan et al., 2009a) и дальневосточного лесного кота (Amstislavsky et al., 2018) были использованы ооциты домашней кошки. Поскольку для некоторых диких видов кошачьих характерен высокий процент тератозооспермии, это может ограничивать возможность применения ЭКО; в таком случае для оценки фертильности семени и получения эмбрионов может использоваться гомологическое или гетерологическое ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида). Для применения этого метода требуются единичные нормальные подвижные сперматозоиды. Метод ИКСИ был, в частности, успешно применен на гепарде, леопарде и льве c целью проверки оплодотворяющей способности сперматозоидов этих видов кошачьих после криоконсервации (Moro et al., 2014; Fernandez-Gonzalez et al., 2015).

Наш собственный опыт работы с диким представителем семейства кошачьих – дальневосточным лесным котом показал, что в условиях, приближенных к полевым, экспресс метод оценки жизнеспособности при помощи смеси красителей эозина и нигрозина и оценки их концентрации и подвижности при помощи камеры маклера оказывается вполне достаточно, по крайней мере для того, чтобы осуществить криоконсервацию семени с последующей более тщательной оценкой и изучением, в том числе и оплодотворяющей способности сперматозоидов после их оттаивания в лабораторных условиях (Amstislavsky et al., 2018). Между тем, крайне желательна предварительная апробация протоколов криоконсервации и оценки семени на доместицированном представителе семейства, в данном случае – на домашнем коте (Brusentsev et al., 2018).

Показатели жизнеспособности сперматозоидов после их криоконсервации у различных представителей отряда хищных

Анализ эффективности процедуры криоконсервации сперматозоидов (табл. 1, 2) после их оттаивания/отогрева выявил, что жизнеспособность образцов эякуляторного семени диких видов кошачьих, за исключением одного исследования составляет 22–55% (43.75 ± 6.92% в среднем). У домашнего кота жизнеспособность сперматозоидов после криоконсервации обычно несколько выше и составляет 47–65% (Chatdarong et al., 2017; Cheuqueman et al., 2018; Jara et al., 2019). Между тем, в одном исследовании на сперматозоидах суматранского тигра была отмечена исключительно высокая жизнеспособность сперматозоидов после оттаивания – 85% (Karja et al., 2016). В данном исследовании, наряду с глицерином и яичным желтком, в криопротективную смесь был добавлен дополнительный ингредиент, а именно Orvus ES paste, а в процессе эквилибрации образцов семени использовали глюкозу, лактозу или раффинозу.

Жизнеспособность эякуляторного семени у диких псовых составила 24–79% (51.4 ± 8.9% в среднем); причем для гривистого волка (Chrysocyon brachyurus) была обнаружена большая эффективность использования ДМСО по сравнению с глицерином (Johnson et al., 2014), который является основным криопротектором при замораживании сперматозоидов других представителей отряда хищных (табл. 1). Между тем, сравнение ДМСО и глицерина, в качестве основного криопротектора при криоконсервации сперматозоидов рыжего волка, показало существенно более высокие характеристики подвижности при применении глицерина (Franklin et al., 2018). Для некоторых других диких представителей отряда псовых, а именно песца, рыжей лисицы, гиеновидной собаки и мексиканского волка, глицерин в концентрации 2.5–6.0% оказывал достаточно хороший криопротективный эффект и показатели жизнеспособности и (или) подвижности для размороженного семени были не ниже 45%. Эти показатели находятся в хорошем соответствии с таковыми для домашних псов: 45% жизнеспособности семени при применении 6% глицерина в качестве основного криопротектора (Qamar et al., 2019). Между тем, для койота и рыжего волка показатели жизнеспособности и (или) подвижности семени при использовании глицерина в качестве криопротектора оказались весьма низкими (табл. 1). Достаточно перспективным, на наш взгляд, является применение фирменной криопротективной смеси на основе глицерина, созданной специально для криоконсервации сперматозоидов представителей семейства псовых – CaniPlus Freeze (Minitube, Германия). Показательно, что эта смесь, которая создавалась для работы с семенем домашних псов, оказалась эффективна при криоконсервации семени дикого представителя семейства псовых – рыжего волка (табл. 2).

Среди диких видов куньих жизнеспособность сперматозоидов была определена только у домашнего и степного хорька (Mustela eversmanni), и составляла 60% (Van der Horst et al., 2009). У других диких видов куньих, а именно – канадской выдры и черноногого хорька, была определена только подвижность сперматозоидов после процедур криоконсервации, которая также оказалась достаточно высокой, соответственно 59 и 45% (табл. 1).

У медвежьих разброс в жизнеспособности оттаянных сперматозоидов составляет 36–58% (47 ± 6.4% в среднем). Было продемонстрировано, что у большой панды и бурого медведя эти показатели могут быть улучшены с помощью селекции сперматозоидов путем центрифугирования через коллоидный раствор (Anel-Lopez et al., 2017; Cai et al., 2018).

Оплодотворяющая способность оттаянного семени диких кошачьих в большинстве случаев определялась с помощью гетерологического ЭКО ооцитов домашней кошки (табл. 1, 2); процент дробления при этом составил 11–61%, в среднем 41.0 ± 5.3% в зависимости от вида: пиренейская рысь – 11% (Ganan et al., 2009a), рыжая рысь – 24% (Ganan et al., 2009b), оцелот – 29% (Stoops et al., 2007), дальневосточный лесной кот – 36% (Amstislavsky et al., 2018), барханный кот – 41% (Vansandt et al., 2018), индокитайский леопард – 46% (Thuwanut et al., 2017), кот Жоффруа – 46% (Sestelo et al., 2018), черноногая кошка – 59% (Vansandt et al., 2018), кот-рыболов – 60% (Vansandt et al., 2016) и манул – 61% (Vansandt et al., 2016). Также проводили оценку на фертильность по доле оплодотворившихся ооцитов для суматранского тигра (Karja et al., 2016) и для дымчатого леопарда, которая составляла 46 и 16% соответственно (Tipkantha et al., 2016). Лишь в случае бенгальского и амурского тигра проводилось гомологическое ЭКО ооцитов тигрицы, которое показало 70% дробления (Donoghue et al., 1992). Для некоторых видов собачьих и куньих проводили ИО, при этом частота наступления беременности у обыкновенной лисицы достигала 81% (Yatu et al., 2018), а у черноногого хорька – 28% (Howard et al., 2015).

Достижения и проблемы криоконсервации сперматозоидов представителей отряда хищных

В отряде хищных насчитывается 15 семейств (по данным NCBI taxonomy browser; https://www. ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi). Общей проблемой для отработки наиболее эффективных репродуктивных технологий по отношению к большинству этих семейств, является отсутствие доместицированных видов. Лишь для кошачьих, псовых и куньих имеются доместицированные представители, а именно – домашняя кошка, собака и хорек фуро, которые позволяют отработать соответствующие технологии получения и криоконсервации гамет и эмбрионов (Wildt et al., 1992), в частности, сперматозоидов, которые потом легче адаптировать к диким представителям этих семейств. Именно по этой причине, лишь для диких представителей данных трех семейств, а также медведей, имеются успешные работы с достаточно высокими показателями жизнеспособности семени после криоконсервации, что и отражено в табл. 1 и 2. Отдельно следует упомянуть медведей. Для этого семейства хищных нет доместицированных видов, которые могли бы быть использованы в качестве “модели” для отработки технологий, направленных на изучение диких видов. Между тем, как говорилось выше, шесть из восьми видов семейства являются уязвимыми. Соответственно, на это семейство были направлены большие усилия исследователей, и имеются работы по криоконсервации семени медвежьих (табл. 1, 2). По остальным видам хищных, не принадлежащих к этим четырем семействам, имеются лишь единичные работы, в которых обсуждается криоконсервация семени (Rodrigues da Paz, dos Santos Avila, 2015; Komatsu et al., 2021).

Проведенный анализ литературы позволяет сделать вывод о том, что в качестве основного криопротектора для замораживания семени различных представителей хищных чаще всего использует глицерин. Именно этот криопротектор был впервые использован для замораживания сперматозоидов более 70 лет назад (Polge et al., 1949) и до сих пор является криопротектором выбора при криоконсервации семени хищных (табл. 1). Использование данного криопротектора в некоторых случаях позволяет получить достаточно высокие показатели жизнеспособности и подвижности сперматозоидов различных представителей семейства кошачьих, псовых, медвежьих и куньих. Применение фирменных криопротекторных смесей (табл. 2), в целом, не дает ощутимого прироста показателей жизнеспособности после криоконсервации сперматозоидов различных видов диких хищных по сравнению с самостоятельно приготовленными криопротекторными смесями на основе глицерина (табл. 1). Между тем, использование фирменных криопротекторных смесей создает определенные преимущества при работе в условиях приближенным к полевым, о чем свидетельствует и наш собственный опыт (Amstislavsky et al., 2018).

Данные по жизнеспособности сперматозоидов после криоконсервации, полученные на представителях разных семейств хищных, тяжело поддаются сравнению, так как исследователи рассматривали различные индикаторы, такие как жизнеспособность, подвижность, оплодотворяющая способность сперматозоидов с использованием разных методов. В частности, фертильность (оплодотворяющую способность) сперматозоидов исследовали либо путем гомологического, либо путем гетерологического ЭКО, либо путем ИО. Создает определенные сложности и является достаточно серьезной проблемой также малый объем эякулята при работе с некоторыми дикими видами хищных (Luvoni, 2006; Franklin et al., 2018). Именно малый объем эякулята и относительный дефицит семени является важным аргументом в пользу выбора именно ЭКО, при работе с криоконсервированным семенем диких видов хищных семейства кошачьих, для этого способа требуется в сотни раз меньше подвижных жизнеспособных сперматозоидов, чем для ИО (Swanson et al., 2007).

Между тем, выбор того или иного способа работы с семенем, находящимся в криобанке, определяется конкретным видом хищных и осуществляется либо с экспериментальными целями, либо в контексте программы сохранения этого вида. Показательным примером, который, без сомнения является серьезным достижением в данной области, является применение криобанка в контексте усилий по сохранению вида черноногого хорька (Mustela nigripes) в Северной Америке (Howard et al., 2015). Более 130 потомков было получено путем ИО в ходе многолетней программы восстановления численности этого вида куньих (Howard, Wildt, 2009; Howard et al., 2015). Следует отметить, что, несмотря на то, что в большинстве случаев для этого использовали сперматозоиды не подвергавшееся криоконсервации, потомство было получено также и после ИО сперматозоидами, взятыми из криобанка, причем в некоторых случаях, эти сперматозоиды сохранялись в криобанке в течение двух десятилетий (Howard et al., 2015). Это может рассматриваться как несомненное достижение, поскольку криоконсервация мужских гамет в сочетании с другими методами, была успешно использована для восстановления вида хищных, находившегося на грани полного исчезновения.

Источник ооцитов и эмбрионов для криобанка представителей отряда хищных

Способы получения ооцитов и эмбрионов различаются в зависимости от вида животного и цели дальнейшего использования. В случае лабораторных модельных видов (например, домашняя кошка) чаще всего используют яичники, извлеченные после рутинной операции овариогистерэктомии в ветеринарных клиниках. Из таких яичников выделяют кумулюс-ооцитные комплексы (КОК) путем измельчения ткани кортекса и аспирации ооцитов из фолликулов. После процедуры сбора КОК-сы подвергаются селекции по качеству на основе морфологических критериев. Например, среди кошачьих КОК-сов наиболее пригодными для дальнейшего развития считаются такие, которые имеют правильную сферическую форму, темную однородную ооплазму и окружены не менее чем пятью слоями кумулюсных клеток (Wood, Wildt, 1997). Ооциты в таких комплексах, как правило, находятся на стадии герминального везикула (т.е. незрелые); их либо сразу криоконсервируют, либо вначале осуществляют дозревание in vitro с целью последующей криоконсервации или оплодотворения in vitro. При работе с редкими дикими видами хищных такая методика используется только при наличии медицинских показаний для операции (Boutelle et al., 2011) или post mortem: в случаях гибели особей, содержащихся в зоопарках, чтобы сохранить ценный генетический материал (Kochan et al., 2019). Иногда для получения ооцитов от диких видов хищных применяют гормонально индуцированную стимуляцию суперовуляции с последующей лапароскопической пункцией антральных фолликулов (Pope et al., 2006, 2012; Mastromonaco, Songsasen, 2020).

Особенностью представителей семейства псовых является то, что у них овуляция происходит не на стадии MII, а на более ранней стадии мейоза; при этом ооциты после овуляции дозревают в яйцеводах (Chastant-Maillard et al., 2011). С этим связаны проблемы создания условий для дозревания in vitro ооцитов диких представителей этого семейства (Amstislavsky et al., 2012). Между тем, были предприняты вполне успешные попытки криоконсервации ооцитов диких представителей семейства псовых (табл. 3) Есть несколько работ, посвященных in vitro дозреванию ооцитов представителей отряда медвежьих, например, барибала (Johnston et al., 1994) и бурого медведя (Yin et al., 2007). Что касается криоконсервации ооцитов медвежьих и куньих, в настоящее время пока не опубликовано работ на эту тему.

Эмбрионы для криоконсервации могут быть получены in vitro или in vivo. В первом случае оплодотворение ооцитов можно произвести путем традиционного ЭКО или с помощью ИКСИ (Pope, 2012, 2014). Эмбрионы представителей хищных, развившиеся in vivo чаще всего получают путем хирургического извлечения их из репродуктивных путей спустя несколько дней после оплодотворения in vivo (путем спаривания с самцом либо после ИО) у наркотизированных животных с сохранением их репродуктивной функции (Lindeberg et al., 2003; Piltti et al., 2004; Guaitolini et al., 2012).

Способы криоконсервации ооцитов и эмбрионов представителей отряда хищных

Существуют два способа замораживания ооцитов и эмбрионов млекопитающих – программное замораживание и витрификация (Whittingham et al., 1972; Rall, Fahy, 1985; Saragusty, Arav, 2011). Программное замораживание является равновесным процессом, который характеризуется низкими скоростями охлаждения для поддержания внутриклеточной воды в переохлажденном состоянии, что способствует перемещению воды из внутриклеточных компартментов во внеклеточные, в конце концов, по окончании процесса внутриклеточные кристаллы льда образуются, но они мелкие и, соответственно, не слишком вредоносные для клеток (Mazur, 1990). В принципиальную схему программы входит первый этап охлаждения со скоростью 1–2°С/мин до температуры около –5…–7°С, при которой проводят принудительную нуклеацию льда во избежание спонтанной кристаллизации, и второй этап более медленного охлаждения (десятые доли градуса в минуту) до температуры ниже –30°С, при которой можно помещать носитель в жидкий азот. Для предотвращения повреждения и гибели клеток в процессе замораживания применяют различные криопротекторы, как описано выше.

Витрификация (стеклование) основывается на предположении о том, что при высоких концентрациях криопротектора и очень быстром снижении температуры клетки переходят в стекловидное состояние (витрифицируются), минуя стадию кристаллизации (Mazur, 1990). Переход раствора в аморфную фазу происходит обычно при высоких скоростях охлаждения – более 500°С/мин; при проведении витрификации используют криопротекторы в концентрации от 4 до 7 молей, то есть выше, чем при программном замораживании (Saragusty, Arav, 2011). В большинстве современных методов такие скорости охлаждения достигаются погружением материала непосредственно в жидкий азот (–196°С) или в переохлажденный воздух – например, закрытые системы Rapid-I (Nowak et al., 2019). Закрытые системы отличаются от открытых отсутствием прямого контакта материала с жидким азотом, который может привести к контаминации образца; однако при этом они могут проигрывать по скорости охлаждения и, следовательно, эффективности (Vajta et al., 2015). Наиболее популярными являются открытые системы, такие как OPS – open pulled straw (Luciano et al., 2009), Cryotop и Cryoloop (Mikolajewska et al., 2012). Помимо скорости охлаждения, важную роль также играют объем и вязкость среды, в которой криоконсервируют образцы (Saragusty, Arav, 2011).

Оба метода криоконсервации имеют свои преимущества и недостатки. Преимущество медленного замораживания заключается в использовании низких концентраций криопротекторов, тогда как для витрификации требуются высокие концентрации, которые связаны с химической токсичностью и осмотическим шоком (Shaw, Jones, 2003). Однако витрификация является быстрым методом, позволяющим избежать этапа длительного охлаждения, что снижает криоповреждения, возникающие в клетках при их охлаждении до околонулевых температур и при замораживании клеток в результате кристаллизации внутриклеточной воды (Kim, 2013). Это преимущество особенно существенно при криоконсервации ооцитов и эмбрионов тех видов, у которых высокое содержание липидов в их репродуктивных клетках (Amstislavsky et al., 2019).

Способы оценки жизнеспособности ооцитов и эмбрионов в процессе и после криоконсервации

Существуют многочисленные способы оценки жизнеспособности ооцитов после процедуры криоконсервации. В работе Новак с соавторами (2019), для оценки выживаемости ооцитов сервала (Leptailurus serval) и манула (Otocolobus manul) после витрификации, их окрашивали флуоресцентными красителями: бромистым этидием (ETBr) в сочетании с диацетатом флуоресцеина (FDA). Живые ооциты с неповрежденной клеточной мембраной светятся в зеленом диапазоне длин волн, в то время как мертвые ооциты светятся ярко-оранжевым (Nowak et al., 2019). Помимо этого, используют пропидия йодид (PI), который окрашивает только мертвые ооциты с поврежденной мембраной; именно этот метод применили для оценки выживания ооцитов мексиканского волка после криоконсервации (Canis lupus baileyi) (Boutelle et al., 2011). Также применяют методы световой, флуоресцентной и конфокальной микроскопии, кроме того, используют электронную микроскопию для оценки изменений в ооцитах после криоконсервации, в том числе и на субклеточном уровне (Turathum et al., 2010; Apparicio et al., 2013; Cao et al., 2017). Для оценки эффективности криоконсервации исследуют также митохондрии после окрашивания их митотрэкером (Cao et al., 2017). После витрификации ооцитов обыкновенной лисицы (Vulpes vulpes) оценивали содержание глутатиона – тиолового соединения, необходимого для пролиферации клеток, транспорта аминокислот, синтеза белков и ДНК, поддержания окислительно-восстановительного баланса. Было показано, что концентрация данного вещества значительно снижается в витрифицированных ооцитах после их оттаивания по сравнению с контролем (Cao et al., 2017). Важным методом оценки жизнеспособности ооцитов хищных после криоконсервации является их способность к оплодотворению и дальнейшему развитию эмбриона, как было показано в работе Лювони и Пеллиццари (2000) на ооцитах домашней кошки (Felis silvestris catus) (Luvoni, Pellizzari, 2000).

Эффективность криоконсервации эмбрионов оценивают по их способности к развитию в культуре in vitro после цикла замораживания/оттаивания (Crichton et al., 2003; Mokrousova et al., 2020b). Наиболее убедительный способ проверки жизнеспособности эмбрионов после криоконсервации – это трансплантация их соответствующему реципиенту. Такие работы на представителях отряда хищных проведены преимущественно на домашних кошках (Dresser et al., 1988; Pope, 2000, 2014), собаках (Nagashima et al., 2015; Hori et al., 2016) и хорьках (Lindeberg et al., 2003; Piltti et al., 2004; Sun et al., 2008), а также на нескольких диких видах кошачьих (Pope et al., 2006; Conforti et al., 2008; Pope et al., 2012).

Способов оценить происходящие в живых клетках процессы, непосредственно в ходе охлаждения и замораживания эмбрионов и ооцитов, не много. Классическим методом является криомикроскопия, в ходе которого можно следить за ходом кристаллизации в охлаждаемых образцах (Mazur, 1990). На рис. 2 представлен эмбрион домашней кошки до начала охлаждения и в процессе охлаждения, данные получены с использованием криомикроскопа. Существуют и другие методы, которые позволяют “заглянуть внутрь” образца при его охлаждении. В частности, метод спектроскопии комбинационного рассеяния света (КРС) позволяет получить информацию о ходе кристаллизации в образце в процессе его охлаждения и оценить соотношение жидкой и твердой фазы воды (Karpegina et al., 2016). В ходе наших исследований с применением этой методики по отношению к эмбрионам и ооцитам домашней кошки удалось оценить температуру фазового перехода в процессе их охлаждения (Okotrub et al., 2018; Mokrousova et al., 2020b). Данная методика позволяет получать информацию об отдельных клетках в реальном времени в процессе их охлаждения, не вводя в клетки каких-либо меток. Наряду со спектроскопией КРС, для неинвазивного мониторинга живых клеток применяют также инфракрасную (ИК) спектроскопию (Ishigaki et al., 2016).

Рис. 2.

Эмбрионы домашней кошки, культивированные in vitro в среде с добавлением линолевой кислоты. Слева эмбрион при комнатной температуре, справа – в процессе замораживания на криостате. Масштабная полоска: 50 мкм.

Современные достижения и проблемы криоконсервации ооцитов представителей отряда хищных

Ооциты и преимплантационные эмбрионы всех представителей отряда хищных, например, домашней кошки, содержат большое число внутриклеточных липидных гранул – ЛГ (Guraya, 1965; Amstislavsky et al., 2019). Содержание большого числа ЛГ в репродуктивных клетках млекопитающих может оказывать влияние на эффективность их криоконсервации (Hwang, Hochi, 2014; Amstislavsky et al., 2019). При этом, как мы полагаем, большую роль может играть не только количественный, но и качественный состав ЛГ, например, степень ненасыщенности содержащихся в них липидов. Существует предположение, что чем больше ненасыщенных жирных кислот содержится в ЛГ, тем ниже точка фазового перехода липидов при охлаждении клеток (Okotrub et al., 2018) и тем выше может быть эффективность их криоконсервации (Amstislavsky et al., 2019). Одним из способов модификации липидного состава ооцитов и эмбрионов млекопитающих является введение жирных насыщенных и ненасыщенных жирных кислот (Aardema et al., 2017; Брусенцев и др., 2020; Ranneva et al., 2020). Поскольку спектры КРС чувствительны к структуре молекул и их окружению, измеряя КРС можно определять концентрацию веществ, их фазовое состояние и фазовые переходы (Mokrousova et al., 2020a, 2020b; Ranneva et al., 2020). С помощью спектроскопии КРС было показано, что клеточные липиды претерпевают размытый фазовый переход, при котором наблюдается разделение фаз (Mokrousova et al., 2020b). Нами было изучено распределение стеариновой кислоты, меченной дейтерием, в липидных гранулах ооцитов домашней кошки после культивирования in vitro (Ranneva et al., 2020). Исследование показало, что встраивание жирной кислоты происходит во все липидные гранулы ооцита. Кроме того, различные гранулы одного ооцита имеет разную концентрацию введенной кислоты в зависимости от времени культивирования (Ranneva et al., 2020). В настоящее время, данная работа продолжается нами в плане изучения влияния культивирования эмбрионов домашней кошки с линолевой кислотой на их способность переживать охлаждение и криоконсервацию (рис. 2).

Ооциты представителей отряда хищных иногда, хотя и редко, криоконсервируют путем программного замораживания (Luvoni, Pellizzari, 2000), чаще используют витрификацию (Boutelle et al., 2011; Galiguis et al., 2014; Cao et al., 2017; Turathum et al., 2018; Nowak et al., 2019). Результаты этих работ представлены в табл. 3. Исходя из теоретических предпосылок, в качестве наиболее предпочтительного криопротектора для криоконсервации ооцитов хищных млекопитающих может выступать ДМСО, поскольку именно он обладает липофильными свойствами и может легко проходить через цитоплазматические мембраны клеток, и, возможно, даже проникать непосредственно в ЛГ (Кулешова и др., 2014). Действительно, чаще всего, протокол, предназначенный для криоконсервации ооцитов представителей семейств отряда хищных, включает в качестве одного из криопротекторов именно ДМСО (Boutelle et al., 2011; Galiguis et al., 2014; Cao et al., 2017; Turathum et al., 2018). В частности, с применением смеси криопротекторов, имеющих в своем составе ДМСО, успешно удалось витрифицировать ооциты домашней собаки (Turathum et al., 2010), кошки (Galiguis et al., 2014), обыкновенной лисицы (Cao et al., 2017) и мексиканского волка (Boutelle et al., 2011).

Между тем, для этих же целей иногда используют стандартные коммерческие наборы для витрификации. В частности, в работе Аппаричио с соавторами (Apparicio et al., 2013) КОК-сы домашней кошки были витрифицированы с использованием фирменной смеси криопротекторов предназначенной для ооцитов крупного рогатого скота (Apparicio et al., 2013). Относительно недавно, ооциты сервала (Leptailurus serval) и манула (Otocolobus manul) криоконсервировали с использованием специального набора для витрификации, используемого в медицине: Cryotech Vitrification kit (Cryotech, Japan) (Nowak et al., 2019).

Достижения и проблемы криоконсервации эмбрионов представителей отряда хищных

На домашних кошках, собаках и хорьках были отработаны протоколы, как программного замораживания (Dresser et al., 1988; Gomez et al., 2003; Lindeberg et al., 2003; Tsujioka et al., 2008; Pope et al., 2011), так и витрификации (Piltti et al., 2004; Hori et al., 2016). Эти протоколы были применены к диким видам хищных. При этом наибольшее число работ по криоконсервации эмбрионов среди представителей отряда Carnivora было выполнено на кошачьих (Pope et al., 2012; Amstislavsky et al., 2012).

Как правило, программное замораживание при криоконсервации эмбрионов кошачьих используют чаще, чем витрификацию. Имеется лишь несколько исследований по витрификации эмбрионов кошачьих, причем все они проведены на домашней кошке. В одном из недавних исследований был выявлен высокий уровень апоптоза после витрификации эмбрионов домашних кошек (Ochota, Nizanski, 2018). Программное замораживание оказалось более щадящим способом по отношению к кошачьим эмбрионам, чем витрификация, если судить как по развитию эмбрионов в культуре in vitro (Pederson et al., 2009), так и по получению живого потомства (Pope et al., 2012). Результат получения живого потомства после витрификации эмбрионов домашней кошки обычно хуже, чем после программного замораживания. В исследовании, в котором эмбрионы домашней кошки после витрификации и оттаивания были пересажены реципиентам, родилось лишь пять котят: 6% от общего числа подсаженных эмбрионов. При этом наблюдались осложненные роды, всем кошкам приходилось делать кесарево сечение; более того, выжил лишь один котенок из пяти рожденных (Pope et al., 2012). В нашем недавнем исследовании не было обнаружено статистических различий по частоте развития in vitro и фрагментации ядер эмбрионов домашних кошек после замораживания/оттаивания и витрификации/отогрева (Mokrousova et al., 2020b). При сравнении же программного замораживания и витрификации по отношению к эмбрионам собаки, выяснилось, что, напротив, витрификация оказалась предпочтительнее, в связи с тем, что только после витрификации удалось получить живое потомство (Hori et al., 2016).

По отношению к куньим (Mustelidae) прямого сравнения витрификации и программного замораживания в рамках одного исследования не проводилось. Между тем, удалось успешно криоконсервировать эмбрионы домашнего хорька (Mustela putorius furo) при применении обоих этих способов и получить живое потомство как после программного замораживания (Lindeberg et al., 2003), так и после витрификации (Piltti et al., 2004; Sun et al., 2008).

До настоящего времени все случаи успешного применения криоконсервации эмбрионов диких представителей отряда Carnivora были отмечены исключительно на кошачьих (табл. 4). Так с использованием смеси пропиленгликоля и сахарозы в качестве криопротекторов удалось криоконсервировать дробящиеся эмбрионы африканской дикой кошки (Felis silvestris lybica), а после оттаивания и эмбриотрансфера от одной из кошек-реципиентов получить живого котенка (Pope, 2000). Та же самая смесь криопротекторов и сходный протокол замораживания были использованы для криоконсервации морул каракала (Caracal caracal); после эмбриотрансфера взятых из криобанка эмбрионов родились три нормальных котенка (Pope et al., 2006). Аналогичным способом были успешно заморожены двухклеточные эмбрионы черноногой кошки (Felis nigripes), при этом удалось получить от одной кошки-реципиента двух живых котят (Pope et al., 2012). Для криоконсервации бластоцист оцелота (Leopardus pardalis mitis) в качестве криопротектора использовали этиленгликоль; после оттаивания и эмбриотрансфера было получено три котенка (Conforti et al., 2008).

Таким образом, практически все успешные исследования по криоконсервации эмбрионов диких видов кошачьих выполнены путем программного замораживания. Исключение составляет только амурский тигр (Panthera tigris altaica); в данном случае эффективной процедурой криоконсервации оказалась витрификация, а программное замораживание оказалось не эффективным (Crichton et al., 2003). Однако живое потомство после этих процедур получено не было, что не позволяет полностью оценить потенциал применения витрификации по отношению к эмбрионам кошачьих.